外源ALA對(duì)NaCl脅迫下酸棗幼苗葉綠素合成的影響

陳麗靚，孫軍利，常心怡，葉家發(fā)

(石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000 )

0 引 言

【研究意義】鹽脅迫嚴(yán)重影響植物的發(fā)芽、生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致作物減產(chǎn)[1]。新疆土壤鹽堿化尤其嚴(yán)重，分布面積也最廣，類型最多。在亞洲栽培棗屬植物中，酸棗耐鹽堿性好，抗旱、抗寒能力較強(qiáng)，根系發(fā)達(dá)，分蘗能力強(qiáng)[2]。棗樹是新疆主要經(jīng)濟(jì)果樹之一，酸棗又是棗樹生產(chǎn)中常用砧木品種[3]。研究外源物質(zhì)提高酸棗的耐鹽性機(jī)制對(duì)新疆棗樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)不僅是葉綠素生物合成過程的第一個(gè)關(guān)鍵性前體物質(zhì)[4]，也是植物生命活動(dòng)必需的和代謝活躍的生理活性物質(zhì)。Hotta等[5]研究發(fā)現(xiàn)，ALA是一種與植物體內(nèi)葉綠素合成以及提高植物體內(nèi)葉綠素含量和捕光系統(tǒng)穩(wěn)定的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類物質(zhì)。近年來(lái)，研究表明ALA不僅可以提高植物的光合能力[6]和作物產(chǎn)量[7-8]，也能夠提高黃瓜[9]、茄子[10]以及油菜[11]等作物的抗冷性，緩解鹽脅迫對(duì)花生[12]、西伯利亞白刺[13]等植物的傷害?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前有關(guān)ALA在酸棗的葉綠素上的影響研究比較少。而酸棗的一些重要價(jià)值逐漸被發(fā)現(xiàn)[14]。需研究新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑ALA與鹽脅迫結(jié)合，分析鹽脅迫下酸棗幼苗的葉綠素合成通路上關(guān)鍵中間產(chǎn)物?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以酸棗水培幼苗為材料，測(cè)定葉綠素前體物質(zhì)含量、葉綠素含量，研究鹽脅迫下外源ALA對(duì)酸棗幼苗葉綠素合成的影響，為研究外源ALA提高酸棗的耐鹽性機(jī)制提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用酸棗種子購(gòu)自陜西省榆林市佳縣，ALA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。試驗(yàn)地點(diǎn)位于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院特色果蔬栽培生理實(shí)驗(yàn)室與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將大小一致且完好無(wú)損的酸棗種子在室溫(20℃)下浸種24 h，用0.5% KMnO4殺菌消毒30 min后，擺放在墊有濕潤(rùn)濾紙的發(fā)芽盒內(nèi)。用蒸餾水保持種子濕潤(rùn)，發(fā)芽前先全天黑暗，等到發(fā)芽后保持光照強(qiáng)度為12 000 lx，14 h光照，溫度控制在26℃左右，相對(duì)濕度65%～70%。待幼苗長(zhǎng)至2片真葉時(shí)，選擇大小一致，長(zhǎng)勢(shì)整齊的酸棗幼苗，移栽定植到裝有1/2倍500 mL日本園試營(yíng)養(yǎng)液的水培盒(19×13×11) cm中，培養(yǎng)一周后換成1倍的日本園試營(yíng)養(yǎng)液，置于人工氣候箱(RXZ智能型，寧波江南儀器廠)內(nèi)培養(yǎng)。待幼苗長(zhǎng)至6片真葉時(shí)，進(jìn)行試驗(yàn)處理。

共設(shè)置4個(gè)處理：(1)對(duì)照(CK)：葉面噴施蒸餾水；(2)ALA處理：葉面噴施100 mg/L ALA；(3)NaCl處理：營(yíng)養(yǎng)液中添加150 mmol/L NaCl，葉面噴施蒸餾水；(4)NaCl+ALA處理：營(yíng)養(yǎng)液中添加150 mmol/L NaCl，噴施葉面噴施100 mg/L。每個(gè)處理重復(fù)3次，每盒15株幼苗。為避免鹽激反應(yīng)，NaCl處理和NaCl+ALA處理中，NaCl濃度按每天50 mmol/L的濃度梯度遞增，于同一天達(dá)到目標(biāo)濃度，此時(shí)為NaCl處理0 d。處理3 d后取樣。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)

1.2.2.1 葉綠素合成各前體含量

ALA測(cè)定參考Wu[15]的方法。選取酸棗葉片0.5 g，用三氯乙酸(質(zhì)量體積比為4%)提取，將提取液、1 mol/L NaAc、乙酰丙酮以及1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH4.6)混合，含量分別為5、2.35、0.15、2.5 mL，水浴加熱10 min，冷卻至室溫后進(jìn)行顯色，測(cè)其波長(zhǎng)為553 nm處的吸光值A(chǔ)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALA的含量。顯色選取的試劑為Ehrlich-Hg試劑，其制配過程為：在30 mL的乙酸中加入P-二甲氨基苯甲醛1 g，將其溶解，加入8 mL 70%高氯酸，使用乙酸溶液稀釋至50 mL，再添加HgCl220.2 g。溶液可以保存在棕色瓶當(dāng)中，瓶身采用錫紙包覆，可在4℃冰箱里面長(zhǎng)期保存。

單卟啉膽色素原(PBG)含量的測(cè)定參照?？e[16]的方法，并且加以改進(jìn)。選取酸棗葉片0.5 g，使用液氮進(jìn)行研磨，再用5 mL提取緩沖液(0.6 mol/L三羥甲基氨基甲+0.1 mol/L乙二胺四乙酸)進(jìn)行提取，104×g離心10 min，選取上清液、Ehrlich-Hg試劑各2 mL混合均勻，在黑暗環(huán)境中顯色，為15 min，測(cè)其吸光值A(chǔ)，波長(zhǎng)為553 nm。

原卟啉Ⅸ、Mg-原卟啉Ⅸ以及原葉綠素酸酯的含量測(cè)定參照Hoduins等[17]方法。選取新鮮酸棗幼苗的葉片0.3 g，加入25 mL的提取液進(jìn)行研磨，提取液為80%的堿性丙酮溶液，溶液由體積比為4:1的丙酮溶液和1%氨水溶液制配而成，提取完成后，分別測(cè)定575、590、628 nm波長(zhǎng)下的吸光值。

1.2.2.2 葉綠素含量

葉綠素的提取參考沈偉其[18]方法，并加以改正，分別稱取0.2 g剪碎的不同處理的新鮮的酸棗幼苗的葉片，混勻，置于15 mL的刻度試管中，再加入10 mL乙醇∶丙酮=1∶1的混合提取液中，用保鮮膜封口，用錫紙包裹，放置在黑暗條件下浸提24 h左右，至果皮顏色變白，提取上清液，分別在663、645、440 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值，每個(gè)處理重復(fù)3次，取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 24進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Microsoft Excel 2010繪制表格以及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)酸棗幼苗葉綠素各前體含量的影響

2.1.1 不同處理對(duì)酸棗幼苗內(nèi)源ALA含量影響

研究表明，與CK相比，外源單獨(dú)噴施ALA處理和NaCl處理下酸棗幼苗的內(nèi)源ALA含量分別提高了50.7%、33.9%；NaCl+ALA處理下酸棗幼苗內(nèi)源ALA含量較NaCl處理顯著提高44.8%。圖1

注：圖中標(biāo)注不同小寫字母表示處理后各處理間差異顯著性(P<0.05)。下同

2.1.2 不同處理對(duì)酸棗幼苗膽色素原含量影響

研究表明，外源單獨(dú)噴施ALA處理和NaCl處理下酸棗幼苗膽色素原含量較CK處理分別提高了35.9%、16.9%；與NaCl處理相比，NaCl+ALA處理下酸棗幼苗膽色素原含量顯著提高20.8%。圖2

圖2 不同處理下酸棗幼苗膽色素原含量變化

2.1.3 不同處理對(duì)酸棗幼苗原卟啉Ⅸ含量影響

研究表明，與CK相比，單獨(dú)噴施ALA處理下酸棗幼苗原卟啉Ⅸ含量顯著提高20.0%；NaCl處理下酸棗幼苗的原卟啉Ⅸ含量降低了12.1%。NaCl+ALA處理下酸棗幼苗原卟啉Ⅸ含量較NaCl處理顯著提高21.2%。圖3

圖3 不同處理下酸棗幼苗原卟啉Ⅸ含量變化

2.1.4 不同處理對(duì)酸棗幼苗Mg-原卟啉Ⅸ含量的影響

研究表明，外源單獨(dú)噴施ALA處理下酸棗幼苗的Mg-原卟啉Ⅸ含量較CK處理顯著提高27.0%；與CK相比，NaCl處理下酸棗幼苗的Mg-原卟啉Ⅸ含量降低了19.5%。NaCl+ALA處理下酸棗幼苗Mg-原卟啉Ⅸ含量較NaCl處理提高了26.4%。圖4

2.1.5 不同處理對(duì)酸棗幼苗原葉綠酸酯含量的影響

研究表明，與CK相比，外源單獨(dú)噴施ALA處理下，酸棗幼苗原葉綠素酸酯含量顯著提高42.7%；NaCl處理下酸棗幼苗的原葉綠素酸酯含量較CK處理降低了28.8%。NaCl+ALA處理下酸棗幼苗原葉綠素酸酯含量較NaCl處理提高了36.5%。圖5

2.2 不同處理對(duì)酸棗幼苗葉綠素含量的影響

研究表明，與CK處理相比，外源單獨(dú)噴施ALA對(duì)酸棗幼苗葉綠素含量沒有顯著性變化；NaCl處理下酸棗幼苗的葉綠素a、b含量以及總含量較CK處理分別降低了23.5%、22.3%、19.8%；NaCl+ALA處理下酸棗幼苗葉綠素a、b含量以及總含量較NaCl處理分別顯著提高36.0%、38.4%、41.2%。圖6

圖6 不同處理下酸棗幼苗葉綠素含量變化

3 討 論

在高等植物中，光合作用在植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量以及抗逆性方面具有十分重要的作用[19]，而葉綠素是參與光合作用中光能吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化的重要色素，是參與植物光合作用的重要物質(zhì)[17]。植物光合速率以及有機(jī)物質(zhì)的積累與葉綠素含量的高低密切相關(guān)，常作為衡量葉片功能強(qiáng)弱的一個(gè)重要指標(biāo)[20]。ALA是高等動(dòng)植物體中都普遍存在的一種非常重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類物質(zhì)[21]，在植物體內(nèi)可以促進(jìn)葉綠素的合成[5]，提高光合作用和保護(hù)酶活性，從而抑制膜質(zhì)過氧化[22-23]。

ALA可以顯著提高葡萄果皮[24]、蘿卜[25]葉片葉綠素含量；李丹丹等[26]提出低濃度的ALA可以顯著提高紫花苜蓿農(nóng)牧806幼苗葉片中葉綠素含量，而隨著ALA濃度的增加，葉片光合色素含量顯著降低。研究表明，外施100 mg/L ALA處理下酸棗幼苗的葉綠素含量較CK處理無(wú)顯著性變化，而其他前體物質(zhì)較CK處理顯著增加，與前人結(jié)果不一致，實(shí)驗(yàn)中外施100 mg/L ALA對(duì)酸棗幼苗的葉綠素含量不起作用的原因可能是ALA濃度太高，外源ALA對(duì)酸棗幼苗葉綠素含量的作用存在濃度效應(yīng)。

在高等植物葉綠素的生物合成途徑中 (Glu→ALA→PBG→ Uro Ⅲ→ Proto Ⅸ→ Mg-proto Ⅸ→ Pch l→ Chl a→ Chl b) ，任何一步受到影響，葉綠素含量就會(huì)受到影響[27]。NaCl脅迫下，菠菜葉片的葉綠素含量下降，膽色素原和內(nèi)源ALA積累，鹽脅迫可能使PBG向UroIII轉(zhuǎn)換的過程受阻[28]；實(shí)驗(yàn)研究與前人結(jié)果一致，150 mmol/L NaCl脅迫下酸棗幼苗內(nèi)源ALA含量、膽色素原含量顯著增加，葉綠素含量顯著降低，鹽脅迫下，酸棗幼苗的ChI a和ChI b均降低，其上游物質(zhì)Proto IX、Mg-Proto IX、PchI含量也同時(shí)降低。

外源噴施ALA可以顯著提高鹽脅迫下黃連種子[29]、夏枯草[30]、顛茄[31]、番茄[32-33]的葉綠素含量和內(nèi)源ALA含量；燕飛等[34]發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，外施外源ALA可以顯著增加黃瓜幼苗的膽色素原含量(PBG)、原卟啉Ⅸ含量、Mg-原卟啉Ⅸ含量、葉綠酸酯含量以及葉綠素含量。本實(shí)驗(yàn)研究表明，NaCl+ALA處理下酸棗幼苗的前體物質(zhì)含量、葉綠素含量較NaCl處理顯著性提高，與前人研究結(jié)果一致。在NaCl脅迫下對(duì)酸棗幼苗噴施外源ALA后，抑制其葉片中葉綠素的分解速度，可能是由于外源ALA可以通過促進(jìn)PBG和UroⅢ等中間產(chǎn)物向下游轉(zhuǎn)化，促進(jìn)葉綠素合成[33]，有效緩解了NaCl脅迫對(duì)酸棗幼苗的葉綠素代謝的影響。

4 結(jié) 論

與150 mmol/L NaCl處理相比，外施100 mg/L ALA顯著提高了酸棗幼苗的內(nèi)源ALA含量、膽色素原含量、原卟啉Ⅸ含量、Mg-原卟啉Ⅸ含量、原葉綠酸酯含量、葉綠素a、b含量以及葉綠素總含量，較NaCl處理分別提高44.8%、20.8%、21.2%、26.4%、36.5%、36.0%、38.4%、41.2%；且葉綠素合成受阻位點(diǎn)在ALA向PBG轉(zhuǎn)化的過程。外源噴施100 mg/L 外源ALA可以提高NaCl脅迫下酸棗幼苗的光合能力，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)。