特異性敲低海馬RNA甲基轉(zhuǎn)移酶Pcif1對空間學習記憶的影響與機制研究

孫祖浩，所信君，夏賢友，趙爽，竇妍，于春水△

學習和記憶與海馬神經(jīng)元內(nèi)基因的協(xié)同表達有關(guān)［1-2］，而基因表達受RNA 修飾的調(diào)控。RNA 甲基化是常見修飾，受YTH 蛋白家族N6 甲基腺嘌呤RNA 結(jié)合蛋白1（Ythdf1）、甲基轉(zhuǎn)移酶3（Mettl3）、磷酸化C端結(jié)構(gòu)域相互作用因子1（Pcif1）、脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（Fto）和alkB 同源基因5（Alkbh5）的調(diào)控［3-4］。研究表明，條件性敲除海馬組織Ythdf1或Mettl3可損害小鼠的學習和記憶功能［5-6］；慢病毒介導的Mettl3在海馬組織的過表達或Cre-LoxP系統(tǒng)介導的Fto敲低可導致小鼠小腦發(fā)育異常［7-8］；CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導的海馬Fto敲低或短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）干擾介導的表達下調(diào)內(nèi)側(cè)前額葉皮層Fto可增強小鼠的恐懼記憶［9-10］。Pcif1是新發(fā)現(xiàn)的一種RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶，可催化N～6，2′-O-二甲基腺嘌呤（m6Am）的形成［11-12］。敲除HEK293T細胞的Pcif1可以減少RNA 的m6Am 修飾，從而增加mRNA 的穩(wěn)定性［13-14］；選擇性敲低腫瘤組織Pcif1表達可以抑制腫瘤發(fā)生和腫瘤組織的化療耐藥性［15］。目前鮮見Pcif1對學習記憶調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報道。本研究旨在探索RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶Pcif1對海馬相關(guān)的空間學習記憶的調(diào)控及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8 周齡雄性C57BL/6J Nifdc 小鼠27 只，體質(zhì)量25～30 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021-0006。所有動物實驗均經(jīng)天津醫(yī)科大學實驗動物管理和使用委員會批準（批準號：

IACUC E2015093）。

1.1.2 主要試劑及儀器AgeⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶購自美國賽默飛世爾科技有限公司；Plko.1-puro、pCMV-VSV-G、psPAX2和RS-AAV-CMVNLS-EGFP 質(zhì)粒購自連云港市創(chuàng)瑞生物制品貿(mào)易有限公司；異氟烷購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；RIPA 裂解緩沖液、PMSF 和CCK-8 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF 膜購自德國默克集團；β 分泌酶1（BACE1）、胱天蛋白酶3（Caspase 3）、突觸后致密蛋白95（PSD95）和GAPDH 兔抗鼠一抗購自美國Proteintech 公司；Pcif1、B 細胞淋巴瘤-2 相關(guān)蛋白X（Bax）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）兔抗鼠一抗和羊抗兔二抗購自英國Abcam 公司；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒購自蘇州新賽美生物科技有限公司；嘌呤霉素購自安諾倫（北京）生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)基、胎牛血清和Trizol 購自美國Gibco 公司；Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。立體定位注射儀和Morris 水迷宮設(shè)備購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；Western blot實驗設(shè)備購自美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國賽默飛世爾科技有限公司；冰凍切片機購自德國徠卡公司；酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯株式會社；流式細胞儀購自美國碧迪公司。

1.2 研究方法

1.2.1 在線數(shù)據(jù)庫查詢Pcif1在大腦的表達情況 檢索Tabula Muris 數(shù)據(jù)庫（tabula-muris.ds.czbiohub.org）查詢Pcif1在小鼠大腦常見細胞中的RNA 表達水平［16］。檢索Human Protein Atlas（https://www.proteinatlas.org/）數(shù)據(jù)庫查詢Pcif1在小鼠大腦重要區(qū)域的蛋白水平［17］。檢索Human Brain Transcriptome（https://hbatlas.org/）數(shù)據(jù)庫查詢Pcif1在人腦重要區(qū)域的從出生到衰老的轉(zhuǎn)錄水平［18］。

1.2.2 shRNA 的設(shè)計及慢病毒和腺相關(guān)病毒的包裝 靶向小鼠Pcif1的shRNA 序列的引物委托北京擎科生物科技有限公司合成，上游引物：5′-CCGGCCATCCATGTTTCGTGAAATTCTCGAGAATTTCACGAAACATGGATGGTTTTTG-3′；下游引物：5′-AATTCAAAAACCATCCATGTTTCGTGAAATTCTCGAGAATTTCACGAAACATGGATGG-3′。首先，引物退火后與經(jīng)AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的Plko.1-puro質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化后構(gòu)建慢病毒包裝質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒經(jīng)過測序驗證后，與pCMV-VSV-G 及psPAX2 質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T 細胞包裝得到慢病毒LV-shPcif1。質(zhì)粒上的shRNA 片段和U6片段被克隆出來，與XbaⅠ和SpeⅠ限制性內(nèi)切酶切開的線性AAV包裝質(zhì)粒（RS-AAV-CMVNLS-EGFP）同源重組，得到的質(zhì)粒進行AAV 包裝，得到AAV-shPcif1 和AAV-EGFP。AAV-shPcif1和AAV-EGFP的病毒元件包括反向末端重復序列、巨細胞病毒啟動子、增強綠色熒光蛋白和U6 啟動子，Pcif1-shRNA 序列為AAV-shPcif1獨有，病毒使用滴度為3.5×1012vp/mL。

1.2.3 立體定位注射AAV-shPcif1 敲低小鼠海馬Pcif1小鼠按照隨機數(shù)字表法分為3 組：Pcif1敲低組（注射AAVshPcif1）、假手術(shù)組（注射AAV-EGFP）和野生組（不做任何處理）。異氟烷麻醉小鼠，小鼠頭部被固定在立體定位儀上，切開小鼠頭皮暴露顱骨，并保持前后囟門的高度差和矢狀縫左右10 mm 處的高度差均在0.3 mm 以內(nèi)。使用手持顱鉆鉆開顱骨，微量注射器在左右背側(cè)海馬CA1區(qū)，即前囟后2.0 mm、矢狀縫左右1.5 mm以及腦組織下1.0 mm處分別注射1 μL病毒，注射速率為100 nL/min。注射完成后常規(guī)飼養(yǎng)小鼠3周，使病毒充分表達。小鼠全腦冰凍切片熒光成像確認病毒進入海馬組織，Western blot驗證Pcif1的敲低效率。

1.2.4 Morris水迷宮實驗測試小鼠空間學習記憶 立體定位注射3 周后對小鼠進行Morris 水迷宮測試，步驟參照文獻［19-20］，觀察小鼠在平臺可視期（第1天）的游泳速度、在訓練期（第2～6天）的逃避時間以及在測試期（第7天）的跨平臺次數(shù)和目的象限停留時間。

1.2.5 Western blot檢測海馬組織相關(guān)蛋白表達 使用RIPA裂解緩沖液和PMSF 提取海馬組織蛋白。蛋白產(chǎn)物經(jīng)4 ℃、5 000 r/min離心5 min，收集上清液。按4∶1的體積比例加入上樣緩沖液，95 ℃加熱15 min使蛋白變性。對變性蛋白溶液行聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離蛋白，蛋白溶液的上樣量根據(jù)Western blot預實驗檢測的內(nèi)參蛋白的濃度進行調(diào)整。電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min。然后將PVDF膜切割成合適大小的條帶，將條帶置于兔源Pcif1（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶2 000）、BACE1（1∶1 000）、Caspase 3（1∶2 000）、PSD95（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）一抗中4 ℃孵育過夜。次日回收一抗，PBST洗膜3次，加入羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育60 min?；厥斩?，PBST洗膜3次，滴加ECL曝光液，化學發(fā)光成像系統(tǒng)中成像。

1.2.6 構(gòu)建穩(wěn)定敲低Pcif1的HT22細胞系 使用LV-shPcif1感染HT22 細胞（感染復數(shù)=1），完成感染后使用嘌呤霉素篩選細胞得到穩(wěn)定敲低Pcif1的HT22 細胞（HT22-shPcif1 組）。使用對照慢病毒感染HT22細胞并進行篩選，得到對照HT22細胞（HT22-Ctrl組）。Western blot鑒定2組細胞Pcif1表達水平，方法參照1.2.5。

1.2.7 全轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq） 使用Trizol 試劑提取HT22-Ctrl 組和HT22-shPcif1 組細胞總RNA，每組設(shè)3 個重復樣本，所有樣本RNA的完整度值均≥9.7。RNA質(zhì)控及測序工作委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。使用Trim Glore 預處理RNA-seq 原始數(shù)據(jù)，使用Kallisto 將測序數(shù)據(jù)比對到mouse genome（vM25）參考基因組?；虿町惐稊?shù)＞1且FDR 校正后P＜0.05 的基因定義為差異表達基因。在ToppGene Suite（http://toppgene.cchmc.org）對差異表達基因進行功能富集分析，富集結(jié)果進行FDR 多重比較校正（P＜0.05）［21］。

1.2.8 細胞毒性實驗（CCK-8）檢測細胞增殖能力 提前將HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細胞分別置于400 μmol/L H2O2條件下培養(yǎng)2 d，然后在0、12、24、36 和48 h 時間點使用CCK-8探針孵育細胞，方法參考CCK-8 試劑盒說明書，使用酶標儀檢測490 nm波長處的光密度（OD）值，繪制細胞的增殖曲線。

1.2.9 細胞劃痕檢測細胞遷移能力 方法參考文獻［22］，將HT22-shPcif1組和HT22-Ctrl組細胞分別接種到6孔板，接種密度為1×105/孔。待細胞擴增到相互接觸形成單層細胞薄層時，使用100 μL 的槍頭劃痕，在劃痕后0 h 和36 h，在顯微鏡下觀察并拍攝多個位置的細胞遷移狀態(tài)。使用Photoshop CC2014軟件測量空白區(qū)域的面積，計算細胞遷移率，細胞遷移率=（0 h劃痕面積-36 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.10 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 HT22-shPcif1 組和HT22-Ctrl組分別在400 μmol/L H2O2條件下培養(yǎng)2 d后，使用異硫氰酸熒光素（FITC）和碘化丙啶（PI）染劑孵育細胞，完成孵育的細胞在1 h 內(nèi)使用流式細胞儀檢測細胞總的凋亡水平，即早期和晚期凋亡細胞百分比之和。

1.3 統(tǒng)計學方法 除了RNA-seq 數(shù)據(jù)以外的實驗數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 8 軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2 組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；3 組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey’s 檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Pcif1在小鼠大腦內(nèi)的表達水平 通過查詢公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，Pcif1在大腦中呈時空表達。Tabula Muris 數(shù)據(jù)庫提示Pcif1在少突膠質(zhì)細胞前體細胞、神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞、周細胞、Bergmann 膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞中表達較高，見圖1A。檢索Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，Pcif1在小鼠大腦的多個腦區(qū)和核團中均有表達，表達量由高到低依次為嗅覺皮層、杏仁核、海馬、大腦皮層、小腦、基底神經(jīng)節(jié)、腦橋和髓質(zhì)、丘腦、中腦和下丘腦，見圖1B。檢索Human Brain Transcriptome數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，Pcif1在胚胎期高表達，出生后略有下降，但在整個生命過程中一直保持相對穩(wěn)定的高表達，見圖1C。

Fig.1 Pcif1 related expression data from Tabula Muris,Human Protein Atlas and Human Brain Transcriptome datasets圖1 Tabula Muris,Human Protein Atlas和Human Brain Transcriptome數(shù)據(jù)庫中有關(guān)Pcif1的表達數(shù)據(jù)

2.2 敲低海馬Pcif1對小鼠的空間學習記憶的影響 立體定位注射3 周后，小鼠冰凍腦切片熒光成像在海馬CA1區(qū)觀察到綠色熒光，提示建模成功，見圖2。在Morris水迷宮實驗的第1天（平臺可視期），3 組小鼠的游泳速度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在第5 天（訓練期），敲低組的逃避時間短于假手術(shù)組（P＜0.05）；在第6 天（訓練期），敲低組的逃避時間短于野生組（P＜0.05）；在第7 天（測試期），敲低組小鼠的目的象限時間顯著長于其他2組，此時3組跨平臺次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖3、表1。

Fig.2 Representative fluorescence image of frozen mouse brain section(×25)圖2 小鼠冰凍腦切片熒光成像圖（×25）

Fig.3 Representative swimming paths of mice from 3 groups圖3 3組小鼠水迷宮測試游泳軌跡圖

2.3 與敲低HT22細胞Pcif1有關(guān)的差異表達基因及其功能注釋 與HT22-Ctrl組比較，HT22-shPcif1組細胞中共發(fā)現(xiàn)2 065 個差異表達基因，其中84 個基因顯著上調(diào)，74個基因顯著下調(diào)，見表2、圖4。功能富集分析顯示，表達上調(diào)基因在4 類分子功能、118個生物學過程和4 種細胞成分中顯著富集，主要與細胞凋亡、遷移和增殖有關(guān)；表達下調(diào)基因主要在6類分子功能和42個生物學過程富集，見圖5。

2.4 HT22-shPcif1 組細胞在正常環(huán)境下遷移能力的變化及H2O2環(huán)境下凋亡和增殖能力的變化 Western blot 結(jié)果證實，HT22-shPcif1 組細胞中Pcif1表達較HT22-Ctrl組明顯下調(diào)，見圖6。細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，在正常培養(yǎng)條件下HT22-shPcif1 組細胞的遷移率比HT22-Ctrl 組更高（P＜0.01），見圖7、表3。在400 μmol/L H2O2條件下培養(yǎng)48 h 后，CCK-8 實驗顯示HT22-shPcif1 組細胞的增殖能力高于HT22-Ctrl 組，見圖8；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，HT22-shPcif1 組細胞的凋亡率相比HT22-Ctrl 組顯著降低（P＜0.01），見圖9、表3。

Tab.1 Morris water maze results of 3 groups of mice表1 3組小鼠Morris水迷宮測試結(jié)果 （n=9）

Tab.2 Differentially expressed genes of HT22-shPcif1表2 HT22-shPcif1差異表達基因

Fig.4 Volcano plot of differentially expressed genes of HT22-shPcif1圖4 HT22-shPcif1差異表達基因火山圖

Fig.5 GO analysis of differentially expressed genes of HT22-shPcif1圖5 HT22-shPcif1差異表達基因GO分析

Fig.6 Protein levels of Pcif1 in HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells measured by Western blot assay圖6 Western blot檢測HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細胞的Pcif1蛋白水平

Fig.7 Comparison of migration between HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells(×100)圖7 HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細胞遷移的比較（×100）

Tab.3 Comparison of cell migration and apoptosis of HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells表3 HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細胞遷移和凋亡比較 （n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of cell migration and apoptosis of HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells表3 HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細胞遷移和凋亡比較 （n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01。

Fig.8 Growing curves of HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells under 400 μmol/L H2O2 condition圖8 400 μmol/L H2O2條件下HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細胞的生長曲線

Fig.9 Comparison of apoptosis measured by flow cytometry between HT22-shPcif1 and HT22-Ctrl cells under 400 μmol/L H2O2 condition圖9 400 μmol/L H2O2條件下流式細胞術(shù)檢測HT22-shPcif1和HT22-Ctrl細胞凋亡比較

2.5 敲低Pcif1 促進小鼠海馬組織中抗凋亡蛋白的表達 Western blot 結(jié)果顯示，與野生組和假手術(shù)組相比，敲低組小鼠海馬組織Pcif1 的表達顯著下調(diào)（P＜0.05）；抗凋亡蛋白Bcl-2 顯著上調(diào)（P＜0.05），促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。敲低組BACE-1 蛋白的表達較野生組和假手術(shù)組顯著上調(diào)；PSD95 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義。見圖10、表4。

Fig.10 The relative expression of Pcif1,Bcl-2,Bax,Caspase3,BACE-1 and PSD95 in hippocampal tissues of three groups of mice measured by Western blot assay圖10 Western blot檢測3組小鼠海馬組織Pcif1、Bcl-2、Bax、Caspase3、BACE-1和PSD95的相對表達

3 討論

3.1Pcif1在小鼠的大腦的主要區(qū)域終生維持較高的表達水平 公共數(shù)據(jù)庫提供的信息表明，無論是基因還是蛋白質(zhì)水平，Pcif1在小鼠大腦中均保持較高的表達水平。在人腦中，Pcif1終生維持較高的表達水平，由于Pcif1具有高度的進化保守性［23］，其在小鼠的大腦中也應該終生表達。Pcif1的廣泛表達與m6Am在小鼠腦內(nèi)的廣泛分布具有一致性［24］。據(jù)此可以推測，Pcif1能夠像其他RNA甲基化調(diào)節(jié)蛋白酶一樣，對大腦的生理功能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

3.2 敲低海馬Pcif1的表達能夠促進小鼠的空間學習記憶 本研究發(fā)現(xiàn)，Morris 水迷宮測試實驗結(jié)果與預期相反，敲低海馬組織的Pcif1促進了小鼠的空間學習記憶。以往研究表明，其他RNA甲基轉(zhuǎn)移酶和RNA 甲基位點結(jié)合蛋白對大腦的可塑性和學習記憶起有益的調(diào)節(jié)作用，而RNA去甲基化酶則起不利的調(diào)節(jié)作用。例如，在小鼠腦組織敲低Mettl3會導致小腦發(fā)育異常，并提高小腦內(nèi)新生的顆粒細胞的凋亡水平［25］；條件性敲除海馬組織的Mettl3和YTHDF1會損害小鼠的長期記憶形成［5-6］；下調(diào)海馬組織的Fto可增強小鼠的恐懼記憶［9］。總體來說，RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶促進小鼠的認知能力，這是因為其能催化并維持RNA甲基化修飾，從而對相關(guān)基因的RNA 翻譯和RNA 定位起正向調(diào)節(jié)作用［26］。Pcif1對小鼠空間學習記憶的調(diào)控與其他RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶相反，可能是由于催化的RNA 甲基化種類不同，Pcif1催化形成m6Am，而Mettl3催化形成m6A。m6Am 修飾僅發(fā)生在mRNA 的5′端帽子結(jié)構(gòu)后的第1 個腺嘌呤上，而m6A 修飾主要發(fā)生在mRNA 的3′未翻譯區(qū)域和終止密碼子的腺嘌呤上。m6A是哺乳動物mRNA 最常見的修飾，而m6Am 的含量只占m6A 含量的1/30～1/10。m6Am 和m6A 修飾的位置及含量的差異可能會導致甲基基團對mRNA理化性質(zhì)影響不同，最終影響基因的表達以及小鼠空間學習記憶的表現(xiàn)。

3.3 敲低Pcif1會導致細胞的凋亡、遷移和增殖發(fā)生變化 對HT22-shPcif1 細胞進行RNA-seq 分析，發(fā)現(xiàn)了許多差異表達基因，這些基因能夠富集到細胞凋亡、遷移和增殖等通路，提示Pcif1對細胞凋亡、遷移和增殖等重要功能具有調(diào)節(jié)作用。細胞實驗驗證了RNA-seq 的預測結(jié)果，細胞劃痕實驗表明敲低Pcif1后細胞的遷移、增殖能力提高，細胞凋亡水平下降。海馬組織的Western blot 結(jié)果表明敲低Pcif1會促進海馬組織內(nèi)的抗凋亡蛋白的表達，該結(jié)果與細胞實驗一致，表明敲低Pcif1可通過上調(diào)抗凋亡蛋白降低細胞的凋亡水平。

Tab.4 Comparison of hippocampal relative protein levels of Pcif1,Bcl-2,Bax,Caspase3,BACE-1 and PSD95 of three groups of mice表4 3組小鼠海馬組織Pcif1、Bcl-2、Bax、Caspase3、BACE-1和PSD95蛋白相對水平 （n=3，±s）

Tab.4 Comparison of hippocampal relative protein levels of Pcif1,Bcl-2,Bax,Caspase3,BACE-1 and PSD95 of three groups of mice表4 3組小鼠海馬組織Pcif1、Bcl-2、Bax、Caspase3、BACE-1和PSD95蛋白相對水平 （n=3，±s）

＊＊P＜0.01；a與野生組比較，b與假手術(shù)組比較，P＜0.05。

3.4Fgf21是潛在的Pcif1影響學習記憶的中介因子 有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)gf21具有神經(jīng)保護作用，能在體內(nèi)和體外降低細胞凋亡水平［27］，而神經(jīng)元凋亡水平升高會損害個體的認知功能［28］；敲除Fgf21會降低上皮細胞遷移和傷口愈合速率［29］，而神經(jīng)元遷移可以促進長期記憶的形成［30］；上調(diào)Fgf21的表達會促進海馬神經(jīng)元再生［31］，足夠的正常神經(jīng)元對于維持突觸網(wǎng)絡(luò)和信息傳遞至關(guān)重要。另外，給AD大鼠注射外源性Fgf21會緩解AD 大鼠的記憶障礙和降低磷酸化tau 表達及氧化應激［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低Pcif1會促進細胞的遷移、抗凋亡和增殖等功能，這與上調(diào)Fgf21對細胞功能的影響一致。RNA-seq 也證實了Fgf21在HT22-shPcif1 細胞中的表達量顯著增加了1.86 倍，進一步增加了Fgf21是中介因子的可能性。筆者下一步計劃在海馬共同敲低Pcif1和Fgf21，研究其對小鼠空間學習記憶的影響；在HT22細胞上共同敲低Pcif1和Fgf21，研究其對細胞遷移、增殖和凋亡的影響，明確Fgf21是否為敲低Pcif1促進空間學習記憶的中介因子。

綜上所述，敲低海馬RNA甲基轉(zhuǎn)移酶Pcif1對神經(jīng)系統(tǒng)是有利的，在細胞水平，能夠上調(diào)抗凋亡蛋白表達、促進細胞遷移和增殖；在動物水平，能夠促進小鼠的空間學習記憶能力。