KLF9沉默對高糖刺激誘導的內(nèi)皮細胞損傷的影響

姚 瑞，孔令堯，張兆陟，杜家琦，李亞彭，趙國俊，張彥周

鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052

糖尿病并發(fā)癥是一種以糖尿病為基礎的全身代謝性疾病，主要包括糖尿病心臟病、糖尿病腎病，以及糖尿病眼病等[1]。糖尿病導致的全身代謝紊亂和內(nèi)皮損傷是糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病基礎[2-3]。糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制包括過度的炎癥反應和氧化應激，因此抑制氧化應激可以抑制糖尿病并發(fā)癥的進展[4-5]，深入探究高糖誘導的內(nèi)皮細胞損傷對預防和治療糖尿病并發(fā)癥具有重要意義。

KLF9屬于Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族，是參與氧化還原系統(tǒng)的重要因子[6]。Zucker等[7]發(fā)現(xiàn)，KLF9可導致各種類型的培養(yǎng)細胞和肺纖維化小鼠肺組織中活性氧(ROS)水平升高；用氧化還原調(diào)節(jié)劑NF-E2相關因子2(NRF2)刺激KLF9表達后ROS水平進一步增加，并可導致細胞死亡。Parga等[8]發(fā)現(xiàn)KLF9可減少血管緊張素Ⅱ誘導的神經(jīng)元細胞中ROS，并提高這些細胞的存活率。上述結果提示KLF9可能在氧化應激反應中有重要調(diào)節(jié)作用。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為研究對象，觀察高糖條件下沉默KLF9對內(nèi)皮細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料HUVEC購自上海中科院細胞典藏中心。DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，CCK-8試劑盒、ROS檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶2(SOD2)以及谷胱甘肽還原酶(Gpx)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，ELISA試劑盒購自美國BioLegend公司，NRF2抗體購自Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔IRdye@488 CW IgG購自美國LI-COR公司，TUNEL染色試劑盒購自美國Millipore公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國羅氏公司。

1.2 高糖刺激后HUVEC中KLF9表達的變化HUVEC接種于6孔板，每孔106個，分為4組，空白對照組不處理，其他3組分別給予高糖(33.5 mmol/L葡萄糖)刺激12、24、48 h。采用Trizol提取細胞總RNA，檢測濃度和純度后采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄。引物序列：KLF9上游5’-ACAGT GGCTGTGGGAAAGTC-3’，下游5’-TCACAAAGCGT TGGCCAGCG-3’;GAPDH 上游5’-TGGTATCGTG GAAGGACTC-3’，下游5’-AGTAGAGGCAGGGAT GATG-3’[生工生物工程(上海)股份有限公司設計合成]。采用LightCycler 480 SYBR?Green 1 Master Mix體系進行PCR擴增： 95 ℃變性5 min，42個循環(huán)。PCR結果使用雙重標準化曲線來量化，使用GAPDH mRNA的表達進行校準，校準后的qPCR值進行倍數(shù)分析(以空白對照組為基準比值)。實驗重復6次。

1.3 KLF9沉默質(zhì)粒的構建HUVEC用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞密度達90%時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。構建3對KLF9沉默質(zhì)粒(KLF9 siRNA1、2、3)，轉(zhuǎn)染細胞，以轉(zhuǎn)染空載體的細胞為對照。采用qRT-PCR法檢測KLF9 siRNA的沉默效率，選用轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)者用于后續(xù)實驗。

1.4 實驗分組取對數(shù)生長期的4～6代細胞分為3組。對照組(ScRNA組)：細胞轉(zhuǎn)染空載體ScRNA，12 h后給予正常糖(5.5 mmol/L)、27.5 mmol/L的甘露醇處理48 h(模擬高糖刺激下的高滲狀態(tài))；高糖組(HG-ScRNA組)：細胞轉(zhuǎn)染空載體ScRNA，12 h后給予高糖(33.5 mmol/L葡萄糖)處理48 h；高糖+KLF9 siRNA組(HG-KLF9 siRNA組)：細胞轉(zhuǎn)染KLF9 siRNA，12 h后給予高糖處理48 h。

1.5 HUVEC活性檢測細胞接種于96孔板，每孔104個，按1.4分組處理后，用PBS清洗細胞3次，每孔加入10 μL CCK-8溶液，室溫孵育細胞30 min，用酶標儀檢測450 nm處的光密度(OD)值。細胞增殖率=(OD處理-OD對照)/OD對照×100%。實驗重復6次。

1.6 HUVEC凋亡檢測細胞接種于24孔板，每孔105個，按1.4分組處理后，采用TUNEL染色試劑盒檢測凋亡。細胞用40 g/L多聚甲醛固定5 min，采用Triton X-100通透，TdT酶工作液孵育1 h，抗-地高辛熒光工作液孵育0.5 h后用DAPI進行細胞核染色，封片，顯微鏡下觀察。每組選擇6張片子，每張片子選取10個視野(×200)。正常細胞胞核被染為藍色，凋亡細胞胞核被染為綠色。記錄每個視野內(nèi)凋亡細胞數(shù)及總細胞數(shù)，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。實驗重復6次。

1.7 HUVEC中炎癥因子水平的檢測細胞接種于6孔板，每孔106個，按1.4分組處理。然后每孔加入50 μL裂解液孵育15 min，收集裂解后的細胞1 200 r/min離心30 min，吸取上清，采用ELISA試劑盒檢測TNF-α、IL-1、IL-6的水平。實驗重復6次。

1.8 HUVEC中氧化應激因子水平的檢測采用熒光探針DCFH-DA進行ROS檢測。細胞接種于96孔板，每孔104個，按1.4分組處理。然后每孔加入1 μL DCFH-DA熒光探針孵育20 min，用培養(yǎng)基洗滌3次，在酶標儀下檢測熒光強度。另取細胞接種于6孔板，每孔106個，分組處理后常規(guī)裂解細胞，收集裂解液采用BCA法檢測蛋白濃度，用相應試劑盒檢測MDA含量及SOD2、Gpx活性。實驗重復6次。

1.9 NRF2免疫熒光染色細胞接種于24孔板，每孔105個，按1.4分組處理。采用40 g/L多聚甲醛固定5 min，Triton X-100通透10 min，體積分數(shù)8%羊血清封閉1 h，加NRF2一抗(1∶100稀釋)孵育過夜，加488熒光二抗孵育1 h，用DAPI進行核染色，封片，顯微鏡下觀察。每組5張切片。NRF2免疫熒光染色(綠色)跟細胞核重疊(藍色)的細胞為NRF2轉(zhuǎn)位細胞。高倍鏡下每張切片取10個視野，計數(shù)每個視野里的細胞和NRF2核轉(zhuǎn)位細胞，取均值。NRF2核轉(zhuǎn)位細胞比=NRF2核轉(zhuǎn)位細胞/細胞總數(shù)×100%。

1.10 統(tǒng)計學處理應用SPSS 23.0處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較4組細胞KLF9 siRNA表達的變化，KLF9 siRNA 1、2、3轉(zhuǎn)染效率以及3組細胞增殖、凋亡、炎癥因子水平、氧化應激因子水平與NRF2核轉(zhuǎn)位水平的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 高糖刺激對HUVEC中KLF9 mRNA表達的影響空白對照組與高糖刺激12、24、48 h組細胞中KLF9 mRNA的表達水平分別為(1.00±0.13)、(1.32±0.59)、(1.82±0.55)和(2.87±0.35)，4組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=29.560，P<0.001)；高糖刺激24、48 h組KLF9 mRNA表達高于空白對照組(P<0.05)。

2.2 KLF9沉默質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率比較空載體、KLF9 siRNA1、KLF9 siRNA2、KLF9 siRNA3轉(zhuǎn)染48 h后HUVEC中KLF9 mRNA的表達水平分別為(1.00±0.07)、( 0.57±0.09)、(0.43±0.06)、(0.16±0.04)，4組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=158.367，P<0.001)；KLF9 siRNA3的轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)，因此后續(xù)實驗選用KLF9 siRNA3。

2.3 KLF9沉默對高糖刺激的HUVEC增殖及凋亡的影響與ScRNA組相比，HG-ScRNA組細胞增殖率降低，細胞凋亡率升高；與HG-ScRNA組相比，HG-KLF9 siRNA組細胞增殖率升高，細胞凋亡率降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組細胞增殖率與凋亡率比較(n=6) %

2.4 KLF9沉默對高糖刺激下HUVEC中炎癥因子水平的影響與ScRNA組相比，HG-ScRNA組細胞中TNF-α、IL-1、IL-6水平升高，而HG-KLF9 siRNA組各因子水平較HG-ScRNA組降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組細胞中炎癥因子水平的比較(n=6) ng/L

2.5 KLF9沉默對高糖刺激下HUVEC氧化應激的影響與ScRNA組相比，HG-ScRNA組細胞ROS和MDA水平升高，抗氧化酶SOD2和Gpx活性降低；與HG-ScRNA組相比，HG-KLF9 siRNA組細胞ROS和MDA水平降低，SOD2和Gpx活性升高(P<0.05)。見表3。

表3 3組細胞中氧化應激因子水平的比較(n=6)

2.6 KLF9沉默對高糖刺激下HUVEC中NRF2表達以及核轉(zhuǎn)位的影響NRF2染色結果顯示：與ScRNA組相比，HG-ScRNA組NRF2表達降低；與HG-ScRNA組相比，HG-KLF9 siRNA組NRF2表達升高(圖1)。ScRNA組、HG-ScRNA組和HG-KLF9 siRNA組NRF2核轉(zhuǎn)位細胞比分別為(8.63±0.87)%、(2.22±0.73)%、(5.77±1.25)%，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=65.051，P<0.001);3組間兩兩比，差異均有統(tǒng)計學意義，且與NRF2表達的變化趨勢一致。

綠色：NRF2；藍色：細胞核；箭頭示NRF2核轉(zhuǎn)位細胞

3 討論

糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機制包括過度的炎癥反應和氧化應激[4-5]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，KLF9調(diào)節(jié)許多重要的生物過程，如增殖、凋亡、分化和發(fā)育。作為轉(zhuǎn)錄因子，KLF9最初被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)脂肪生成[10]。本研究中，我們首先確定了高糖刺激下HUVEC中KLF9表達的變化，結果表明高糖刺激24、48 h，HUVEC中KLF9 mRNA表達上調(diào)。進一步的研究結果顯示，高糖刺激下HUVEC增殖能力降低，凋亡增加；同時，炎癥因子(TNF-α、IL-1、IL-6)的生成增加，氧化應激因子ROS和MDA水平升高，抗氧化酶SOD2和Gpx活性降低。而高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染KLF9 siRNA后，HUVEC增殖能力增強，凋亡和炎癥因子合成減少，氧化應激水平改善，提示KLF9在內(nèi)皮細胞中發(fā)揮促氧化的作用。Parga等[8]發(fā)現(xiàn)KLF9減少神經(jīng)元細胞中的ROS。此外，有研究[11]發(fā)現(xiàn)KLF9在三氧化物誘導的大鼠肝損傷中介導NRF2的抗氧化作用。這些研究提示KLF9在不同的組織細胞中發(fā)揮氧化或抗氧化作用。

研究[12]表明，作為氧化還原調(diào)節(jié)劑，NRF2可以調(diào)節(jié)各種氧化還原平衡分子(包括谷胱甘肽過氧化物酶、SOD、血紅素加氧酶-1)的表達，NRF2被激活后進入細胞核直接調(diào)控上述抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄；NRF2在糖尿病心肌病心臟組織中表達下調(diào)，并且提高NRF表達水平會抑制糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。NRF2可以被諸多因子調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄激活因子4和過氧化物酶體增殖物激活受體[13]。因此，NRF2可能是預防或治療糖尿病并發(fā)癥的潛在靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，KLF9沉默可增加高糖刺激下的HUVEC中NRF2的表達及核轉(zhuǎn)位，提示KLF9可能通過調(diào)控NRF2的表達在內(nèi)皮細胞中發(fā)揮促氧化作用，具體調(diào)控機制尚待進一步探究。

綜上所述，KLF9在高糖誘導的內(nèi)皮細胞中表達增高；沉默KLF9可減輕高糖刺激下內(nèi)皮細胞的炎癥和氧化應激水平，減少內(nèi)皮細胞凋亡；KLF9可能通過調(diào)控NRF2的表達參與高糖環(huán)境下的內(nèi)皮損傷。KLF9或NRF2有可能成為治療糖尿病血管并發(fā)癥的靶點。