鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究

蔡正旺

（安康學院，a.電子與信息工程學院；b.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學院，陜西 安康 725000）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo）為蘭科石斛蘭屬多年生附生草本，喜在半陰半陽的環(huán)境中生長，主要分布在中國的南部和西南部［1］，具有較高的藥用價值和經(jīng)濟價值，是中國傳統(tǒng)名貴中藥材，醫(yī)學界稱其為“藥界大熊貓”。鐵皮石斛自然繁殖力極低［2］，加之人為過度采挖和生境破壞，野生鐵皮石斛已瀕臨絕跡［3］。

以鐵皮石斛種子為材料資源短缺，沒有足夠的材料用于鐵皮石斛的工廠化生產(chǎn)；以原球莖為外植體增殖率比較低，用于規(guī)?；a(chǎn)成本比較高；以莖尖為外植體，大多數(shù)是依附于帶芽莖段，單獨以莖尖為外植體的成活率低；以葉片為外植體，葉片分化程度比較高，培養(yǎng)成完整植株的能力比較低，也不適合工廠化生產(chǎn)。國內(nèi)學者對鐵皮石斛的外植體選擇開展了較多研究，以鐵皮石斛的種子［4］、原球莖［5］、莖尖［6］、幼葉［7］、無菌苗莖段［8，9］等為材料通過增殖、分化、生根培養(yǎng)方式獲得了再生苗或完整植株。

也有文獻報道鐵皮石斛組織培養(yǎng)中的生長調(diào)節(jié)劑選擇［10-14］、煉苗與栽培管理等［15-17］。為促進秦巴地區(qū)產(chǎn)業(yè)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興，探究鐵皮石斛的可持續(xù)利用，在當?shù)亻_展鐵皮石斛快速繁殖技術(shù)的研究。以鐵皮石斛莖段為外植體，來源廣、操作簡單，探索適合于規(guī)?；a(chǎn)途徑，助力鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展。用不同激素組合的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，誘導(dǎo)腋芽、叢生芽的增殖，篩選出最優(yōu)誘導(dǎo)腋芽和叢生芽增殖的培養(yǎng)基、最適合栽培基質(zhì)，為鐵皮石斛建立快速繁殖體系提供技術(shù)支撐，并選取不同基質(zhì)對鐵皮石斛進行移栽，篩選鐵皮石斛生長的最適基質(zhì)。解決鐵皮石斛無菌苗移栽馴化成活率低、種苗品質(zhì)差、培養(yǎng)周期長的問題，為鐵皮石斛在秦巴地區(qū)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛盆栽苗來源于云南省德宏芒市繁錦花市。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌 將鐵皮石斛苗的枝條整枝剪下，去掉葉片，用洗潔精水浸泡15 min 左右，自來水沖洗干凈后，用刀片切成2~3 cm 長的莖段，75%乙醇滅菌30 s，無菌水沖洗3 次，再用0.1%的氯化汞滅菌10 min 左右，并不斷搖晃燒杯使其滅菌充分，最后將氯化汞倒出后用無菌水沖洗5~6 次備用。

1.2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的影響 將滅菌的鐵皮石斛莖段接種在添加不同濃度6-BA 和NAA 的6 種MS 培養(yǎng)基上（表1），每個處理接種12 瓶，每瓶接種3~4 個外植體，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d，30 d 后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率，觀察腋芽的生長情況，篩選出誘導(dǎo)腋芽的最佳生長調(diào)節(jié)劑配比。計算公式如下。

表1 鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑組合（單位：mg/L）

1.2.3 不同濃度的香蕉泥對腋芽誘導(dǎo)的影響 在培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 中加入不同濃度的香蕉泥，香蕉泥濃度分別為0、50、100、150、200 g/L。將滅菌的鐵皮石斛莖段分別接種在含不同濃度香蕉泥的培養(yǎng)基上，每種接種12 瓶，每瓶接種3~4 個外植體，3 次重復(fù)，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d，30 d 后統(tǒng)計腋芽誘導(dǎo)率，比較5 種培養(yǎng)基對鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的影響，篩選出適合鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的香蕉泥濃度。

1.2.4 鐵皮石斛芽增殖培養(yǎng) 將誘導(dǎo)出的腋芽切下，轉(zhuǎn)接到添加有不同濃度6-BA 和NAA 的培養(yǎng)基上（表2），每處理接種12 瓶，每瓶接種3~4 個腋芽，3次重復(fù)，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照度2 000 lx，光照時間12 h/d，30 d 后統(tǒng)計腋芽增殖系數(shù)及叢生芽的生長情況，篩選出芽增殖最佳培養(yǎng)基。增殖系數(shù)計算公式如下。

表2 鐵皮石斛芽增殖培養(yǎng)基生長調(diào)節(jié)劑組合（單位：mg/L）

1.2.5 鐵皮石斛組培苗移栽馴化 當鐵皮石斛組培苗達4 cm 以上，且有6~8 片葉和3~4 條3 cm 以上的根時，取出組培苗并將組培苗根上的培養(yǎng)基清洗干凈，晾至根發(fā)白，然后移栽到裝有不同基質(zhì)的花盆中，移栽的基質(zhì)體積配比如表3 所示。每盆移栽3~4株幼苗，每種基質(zhì)移栽10 盆，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，30 d 后，統(tǒng)計莖的平均生長量及新增的芽數(shù)。計算公式如下。

表3 鐵皮石斛幼苗移栽馴化基質(zhì)組合（單位：份）

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對腋芽誘導(dǎo)的影響

不同生長調(diào)節(jié)劑組合對鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的影響見表4。從表4 可以看出，以MS 為基本培養(yǎng)基，不同生長調(diào)節(jié)劑組合對鐵皮石斛腋芽的誘導(dǎo)有明顯的差異。其中2 號培養(yǎng)基的腋芽誘導(dǎo)率最高，為76.5%，腋芽飽滿、濃綠、健壯，6 號培養(yǎng)基的腋芽誘導(dǎo)率為71.4%，腋芽葉色濃綠、較為粗壯。其他幾種培養(yǎng)基的腋芽誘導(dǎo)率較低，且有部分外植體的腋芽較瘦弱、顏色發(fā)黃、生長速度緩慢，有少量腋芽在后期褐化死去。綜合來看，2、6 號培養(yǎng)基均適合鐵皮石斛腋芽的誘導(dǎo)。

表4 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的影響

2.2 不同濃度香蕉泥對腋芽誘導(dǎo)的影響

通過對加入不同濃度香蕉泥的培養(yǎng)基比較發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入香蕉泥比不加入香蕉泥的腋芽誘導(dǎo)率要高（表5），其中培養(yǎng)基中加入100 g/L或150 g/L香蕉泥的鐵皮石斛腋芽的長勢好、新芽健壯、芽葉濃綠，腋芽基部有少數(shù)根生成。試驗中，隨著香蕉泥的濃度增大，鐵皮石斛的腋芽誘導(dǎo)率增加，香蕉泥的濃度達到200 g/L 時，腋芽的誘導(dǎo)率不再增加，更高濃度的香蕉泥對腋芽誘導(dǎo)率的增加沒有效果?？紤]經(jīng)濟成本，選擇培養(yǎng)基中加入100 g/L 的香蕉泥。綜上所述，最適合鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+100 g/L 香蕉泥。

表5 不同濃度香蕉泥對鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)的影響

2.3 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對芽增殖的影響

將誘導(dǎo)出的鐵皮石斛腋芽切下接種在5 種增殖培養(yǎng)基上，10 d 后，發(fā)現(xiàn)切口處長出少量叢生芽，芽濃綠、健壯，部分芽基部出現(xiàn)數(shù)條細小的根（圖1a）。25 d 后，腋芽長高，芽上有6~7 片新葉，葉色濃綠（圖1b），60 d 后幼苗已長至10 cm 左右，基部分化出數(shù)條健壯的根（圖1c）。從表6 可以看出，1—3 號培養(yǎng)基中，NAA 濃度不變時，隨著6-BA 濃度增加鐵皮石斛增殖系數(shù)降低。4 號培養(yǎng)基的6-BA 和NAA 濃度都較高，其叢生芽的增殖率并不高，且叢生芽較瘦弱，可能是高濃度的生長調(diào)節(jié)劑抑制了叢生芽的生成，當6-BA 的濃度為2.0 mg/L、NAA 的濃度為0.5 mg/L 時，鐵皮石斛的增殖系數(shù)最高，長勢最好。鐵皮石斛芽增殖最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。6-BA 和NAA 的生長調(diào)節(jié)劑組合，不僅能用于鐵皮石斛腋芽、叢生芽的增殖，而且也有利于根的形成。

圖1 鐵皮石斛組培苗長勢

表6 不同生長調(diào)節(jié)劑組合對鐵皮石斛芽增殖的影響

2.4 不同移栽基質(zhì)對鐵皮石斛組培苗移栽馴化的影響

當鐵皮石斛組培苗達到移栽要求時，將組培苗根上的培養(yǎng)基洗干凈，晾至根發(fā)白（圖2），再移栽到裝有不同基質(zhì)的花盆中。從表7 可以看出，鐵皮石斛的5 種移栽基質(zhì)，單一基質(zhì)和復(fù)合基質(zhì)的幼苗成活率均為100%。單一基質(zhì)鋸末和混合基質(zhì)松樹皮+鋸末（7∶3），平均有6 個新芽萌發(fā)，且新芽色濃綠、莖粗壯，老莖加粗較為明顯；而混合基質(zhì)珍珠巖+松樹皮（1∶1）和鋸末+碎磚末（9∶1），都有5 個新芽萌發(fā)，新芽葉色綠、莖較壯，莖有伸長和加粗；單一基質(zhì)松樹皮，只有2 個新芽萌發(fā)，莖生長較緩慢。從莖平均生長量分析，單一基質(zhì)鋸末中的莖平均生長量為2.6 cm，是5 種栽培基質(zhì)莖伸長最多的；混合基質(zhì)松樹皮+鋸末（7∶3）的莖生長2.5 cm，這2 種移栽基質(zhì)莖段生長明顯?；旌匣|(zhì)珍珠巖+松樹皮（1∶1）和鋸末+碎磚塊（9∶1），雖然平均新發(fā)芽數(shù)較多，但其莖的伸長較小，因此，最適合鐵皮石斛組培苗移栽馴化的基質(zhì)是單一基質(zhì)鋸末和混合基質(zhì)松樹皮+鋸末（7∶3）（表7、圖3）。

圖2 鐵皮石斛組培苗移栽前曬苗

圖3 鐵皮石斛組培苗移栽馴化

表7 不同栽培基質(zhì)對鐵皮石斛組培苗移栽訓化的影響

3 小結(jié)與討論

鐵皮石斛腋芽的誘導(dǎo)和叢生芽的增殖與生長調(diào)節(jié)劑、天然添加物、培養(yǎng)基的基本成分等有關(guān)。植物生長調(diào)節(jié)劑是植物組織培養(yǎng)不可或缺的物質(zhì)，用量雖少但在植物組織培養(yǎng)過程中非常重要，而合適的生長調(diào)節(jié)劑組合又是成功培養(yǎng)鐵皮石斛的關(guān)鍵。馬玉申等［18］在鐵皮石斛帶節(jié)莖段的組培快繁體系研究中發(fā)現(xiàn)，當6-BA 為2.0 mg/L、NAA 0.2~0.6 mg/L 誘導(dǎo)效果均較好，其中NAA 為0.2 mg/L 時效果最好。羅煥明等［19］認為，在鐵皮石斛組織培養(yǎng)中，香蕉泥的作用是使組培苗根系發(fā)達苗粗壯且整齊。本試驗結(jié)果表明，在鐵皮石斛腋芽誘導(dǎo)中，當6-BA 濃度為1.0 mg/L，NAA 濃度為0.5 mg/L 時效果最好。100 g/L的香蕉泥有助于鐵皮石斛的腋芽生長健壯，可使組培苗整齊、根系發(fā)達、葉色濃綠。在鐵皮石斛叢生芽增殖培養(yǎng)中，當6-BA、NAA 的濃度分別為2.0、0.5 mg/L 時，鐵皮石斛芽的增殖率最高，叢生芽數(shù)最多，長勢最好，增殖的新芽最健壯。潘梅等［13］認為在2.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA 的培養(yǎng)基上鐵皮石斛芽增殖效果最好。鐵皮石斛移栽馴化結(jié)果表明，鐵皮石斛在單一基質(zhì)鋸末和復(fù)配基質(zhì)松樹皮+鋸末（7∶3）中移栽后生長狀況好，新發(fā)枝條多，更有利于鐵皮石斛的工廠化生產(chǎn)。