Fib及GP IIb/IIIa基因多態(tài)性與家族聚集性LAA腦梗死的相關(guān)性

康 慧 王燕華 高 敏 張敬軍

山東第一醫(yī)科大學（山東省醫(yī)學科學院），山東 濟南 250017

大動脈粥樣硬化性（large-artery atherosclerosis，LAA）腦梗死發(fā)病機制尚未完全闡明，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是其重要病理生理機制，部分LAA 腦梗死患者具有家族聚集性［1-3］。纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）升高是促進AS發(fā)病的一個重要因素，F(xiàn)ib與血小板膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅱb/Ⅲa受體結(jié)合，是血小板活化的最后共同通路，并且是血小板聚集過程的關(guān)鍵因素，與許多血栓形成性疾病有密切關(guān)系。目前國內(nèi)外多項研究證實，F(xiàn)ib及GP Ⅱb/Ⅲa存在多種基因多態(tài)性，該基因多態(tài)性與血小板相關(guān)血栓形成密切相關(guān)。本研究擬通過病例對照研究，探討家族聚集性LAA腦梗死、散發(fā)性LAA腦梗死及對照組 Fib、GP Ⅱb/Ⅲa 基因多態(tài)性，為揭示家族聚集性LAA腦梗死的發(fā)病機制及分層防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇在山東第一醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科治療的家族聚集性LAA 腦梗死患者25 例及散發(fā)性LAA 腦梗死患者25 例為家族組及散發(fā)組。按照家族聚集性LAA 腦梗死及散發(fā)性LAA 腦梗死的診斷標準嚴格入選所有患者。選擇25 例與LAA 腦梗死患者同期就診于同一醫(yī)院其他科室的非心腦血管病患者作為對照組。家族組25 例，其中男性14例，女性11例，平均年齡（61.28±8.41）歲；散發(fā)組 25 例，其中男性 13 例，女性 12 例，平均年齡（61.48± 9.99）歲；對照組25例，其中男性13例，女性12 例，平均年齡（62.92 ± 8.21）歲。3 組患者在年齡、性別、高血壓病史、糖尿病史、吸煙史、飲酒史等方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.2 診斷標準

腦梗死診斷標準：（1）中老年患者多見，病前常有AS及高血壓病等基礎(chǔ)疾病病史；（2）發(fā)病前可有短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）前驅(qū)癥狀如乏力、肢體感覺異常等；（3）靜息狀態(tài)下或睡眠中急性起病，出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀或體征；（4）局灶性體征常于幾小時或1～2 d達到高峰，24 h內(nèi)神經(jīng)缺損癥狀無緩解；（5）患者一般意識清楚；（6）早期行CT檢查多正常，顱腦MRI早期可顯示責任缺血灶。

LAA腦梗死診斷標準：要求血管影像學檢查證實與腦梗死神經(jīng)功能缺損相對應(yīng)的顱內(nèi)外大動脈狹窄>50%或閉塞，且病變血管符合AS 改變；或存在顱內(nèi)外大動脈狹窄>50%或閉塞的間接證據(jù)，如影像學（MRI 或CT）顯示大腦皮質(zhì)、小腦、腦干或皮質(zhì)下梗死灶的直徑>1.5 cm，臨床表現(xiàn)主要為皮質(zhì)損害體征，如失語、體象障礙、意識改變，或有小腦、腦干損害體征。要求有至少1 個以上AS 卒中危險因素（如高齡、高血脂、高血壓等）或系統(tǒng)性AS（如冠心病、動脈硬化斑塊等）證據(jù)［4］。

家族聚集性LAA腦梗死診斷標準：一級親屬至少有2例或2例以上患LAA腦梗死；若存在多例腦血管病患者，則75%以上的患者為LAA腦梗死患者。

1.3 排除標準

年齡小于40 歲或大于75 歲，為漢族以外的民族；不符合家族聚集性LAA 腦梗死診斷標準；心電圖示心房纖顫，或既往有心律失常、急性心肌梗死等嚴重心血管疾??；其他少見病因（動脈炎、腦淀粉樣血管病、煙霧病、顱內(nèi)外夾層動脈瘤）引起的腦血栓形成；既往有周圍血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病者；既往有嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤疾病者；近期服用抗血栓藥物；嚴重精神障礙或臨床資料不完整者。

1.4 方法

1.4.1 血樣采集

所有研究對象在生命體征平穩(wěn)、清晨、空腹狀態(tài)（禁食12 h后）下使用EDTA真空抗凝管抽取肘靜脈血約2 mL，將抗凝管上下顛倒混勻5～8次，在室溫下靜置2 h 后保存于?80 ℃冰箱中。75 例血液標本采集完畢后統(tǒng)一進行實驗操作，注意避免反復凍融。若標本發(fā)生溶血則會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

1.4.2 聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

從血液中提取DNA并測定其濃度，置于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。PCR 擴增反應(yīng)體系（100μL）：10×PCR buffer 10μL，正向引物F 2μL，反向引物R 2μL，dNTPs 1.5μL，熒光探針1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預變性3 min，然后按94 ℃30 s、65 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s每2個循環(huán)減0.5 ℃，共20個循環(huán)，再按94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s共20個循環(huán)，最后72 ℃延長至10 min。

Fib基因正向引物序列：5′-GGCTTGTGGGAAAT GAAGGAAAAT-3′，反向引物序列：5′-GGAAGTTAGG GCACTCCTCAAAGA-3′，擴增目的片段長度 218 bp。GPIIb基因正向引物序列：5′-CTCAAGGTAAGAGCTGG GTGGAAGAAAGAC-3′，反向引物序列：5′-CTCACTA CGAGAACGGGATCCTGAAGCCTC-3′，擴增目的片段長度253 bp。GP Ⅲa基因正向引物序列：5′-GTCGCC ATAGCTCTGATTGC-3′，反向引物序列：5′-GAGCCGG AGTGCAATCCTCT-3′，擴增目的片段長度239 bp。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料采用均數(shù) ± 標準差（）表示，3 組間比較用方差分析，采用最小顯著差異法（LSD法）進行兩兩比較；計數(shù)資料采用n（%）表示，組間比較采用卡方檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 3組研究對象一般臨床資料對比

3組患者在年齡、性別等7個方面，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 3組患者一般臨床資料對比［，n（%）］

表1 3組患者一般臨床資料對比［，n（%）］

臨床資料年齡（歲）男性高血壓病史糖尿病史冠心病史吸煙史飲酒史家族組（n=25）61.28±8.41 14（56.0）16（64.0）3（12.0）2（8.0）10（40.0）6（24.0）散發(fā)組（n=25）61.48±9.99 13（52.0）15（60.0）3（12.0）1（4.0）8（32.0）6（24.0）對照組（n=25）62.92±8.21 13（52.0）15（60.0）1（4.0）1（4.0）10（40.0）6（24.0）F/χ2 0.25 0.107 0.112 1.261 0.528 0.456<0.001 P 0.875 0.948 0.945 0.532 0.768 0.796>0.999

2.2 Fib及Gp Ⅱb/Ⅲa SNP測序

家族組、散發(fā)組及對照組中基因的遺傳方法均符合 Hardy-Weinberg 平衡原理。Fib 的 PCR 產(chǎn)物如圖 1 所示，GP IIb/IIIa 的 PCR 產(chǎn)物如圖 2 所示。SNP測序結(jié)果顯示，F(xiàn)ib基因第455位基因存在2種基因型，即GG、GA（圖3），GP Ⅱb基因第843位胸腺嘧啶（T）被鳥嘌呤（G）取代（圖4），GP Ⅲa基因型均為TT型，未發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性。

圖1 Fib基因擴增目的片段

圖2 GPⅡb、Ⅲa基因擴增目的片段

圖3 Fib基因測序結(jié)果

圖4 GP Ⅱb基因SNP測序結(jié)果

研究結(jié)果顯示，家族組、散發(fā)組及對照組Fib基因型分布比較，F(xiàn)ib基因多態(tài)性在3組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；家族組、散發(fā)組及對照組均以GG型為主，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。GPⅡb基因型分布比較，家族組以ab基因型為主，其中家族組患者ab 基因型分布頻率高于散發(fā)組及對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），a等位基因與b等位基因之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表3。GP Ⅲa基因型在家族組、散發(fā)組及對照組中比較，均為TT基因型，未發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表4。

表2 3組患者Fib基因型和等位基因分布頻率比較［n（%）］

表3 3組研究對象GP Ⅱb基因型和等位基因分布頻率比較［n（%）］

表4 3組研究對象GP IIIa基因型分布頻率比較［n（%）］

3 討 論

LAA腦梗死具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率等特點，已成為最重要的全球健康問題之一。研究表明，遺傳因素是LAA 腦梗死的獨立危險因素，通過對一些家系、同胞進行研究發(fā)現(xiàn)，遺傳因素與LAA腦梗死發(fā)病關(guān)系密切［5-6］，可定義為家族聚集性LAA 腦梗死。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ib 及 GP Ⅱb/Ⅲa 與 LAA腦梗死密切相關(guān)［7］。AS 是 LAA 腦梗死中的重要病理基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細胞損傷后導致膠原和組織因子暴露，GP 與膠原結(jié)合引起血小板粘附激活，釋放血栓素（TXA2）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）等物質(zhì)，促使GP Ⅱb/Ⅲa 表達增加、發(fā)生構(gòu)象改變及受體結(jié)合位點暴露，GP Ⅱb/Ⅲa與Fib、vWF、纖維連接蛋白（Fn）、Vitronectin（Vn）等粘附蛋白結(jié)合，最終導致血小板聚集及血栓形成。

Fib是纖維蛋白的前體，當血漿中Fib含量過高時會與GP Ⅱb/Ⅲa 結(jié)合，導致血小板聚集，促進血栓形成，從而增加LAA 腦梗死的危險性［8］。本研究主要對家族聚集性LAA 腦梗死患者和散發(fā)性LAA腦梗死患者及正常人檢測 Fib 基因 B β 鏈-455 位點多態(tài)性，結(jié)果顯示家族組和散發(fā)組Fib GG 基因型19 例，AG 基因型 6 例；對照組 GG 基因型 17 例，AG 基因型 8 例。3 組均無 AA 型，F(xiàn)ib B β 鏈-455 位點GA 多態(tài)性在3 組間差異無統(tǒng)計學意義，提示Fib B β 鏈-455 位點 GA 多態(tài)性與家族聚集性 LAA 腦梗死無關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ib B β 鏈-455 位點 GA 多態(tài)性與血漿Fib 水平和冠心病的發(fā)展密切相關(guān)［9］。在腦梗死患者的血液中同樣檢測到高水平的Fib，發(fā)現(xiàn)Fib B β鏈-455位點GA多態(tài)性與亞洲人腦梗死的危險性顯著相關(guān)，是腦梗死發(fā)生的危險因素［10］。本研究結(jié)果與相關(guān)報道研究結(jié)果存在一定差異，分析其原因如下：（1）基因多態(tài)性與環(huán)境因素的協(xié)同作用，使某些基因型個體更容易受環(huán)境因素的影響，從基因型到表現(xiàn)型其過程相當復雜；（2）Fib B β 鏈-455位點多態(tài)性與種族、人群有關(guān)，不同種族之間存在差異；（3）可能與本研究分組方法有關(guān)，詳細機制待進一步研究。

GP Ⅱb/Ⅲa 介導血小板與纖維蛋白原結(jié)合，是血小板聚集的最后通路，GP Ⅱb/Ⅲa 被認為是體內(nèi)血小板活化狀態(tài)的標志，與血栓性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是目前抗血小板治療的主要靶點［11］。Gp Ⅱb/Ⅲa 分布于血小板和巨核細胞中，是血小板膜上分布最廣泛的糖蛋白，當GP Ⅱb/Ⅲa基因發(fā)生變異時會影響血小板聚集從而影響血栓形成，所以GP Ⅱb/Ⅲa 基因多態(tài)性成為研究熱點。GP Ⅱb 和GP Ⅲa基因在血小板上以Ca2+依賴性二聚體形式存在，其在復合物狀態(tài)下才能充分發(fā)揮受體功能。

本研究結(jié)果顯示，家族組患者ab基因型高于散發(fā)組及正常組，aa 型及bb 型與腦梗死發(fā)病關(guān)系不大，提示GP Ⅱb基因多態(tài)性可能與家族聚集性LAA腦梗死發(fā)生有關(guān)，推測其可能在遺傳因素作用下，基因突變導致GP表面纖維蛋白原受體的分布密度、形態(tài)和功能改變，血小板活化功能隨之改變，從而增加血栓性疾病發(fā)生的風險。關(guān)于GP Ⅱb 基因多態(tài)性目前研究較少，研究比較深入的是HPA-3（HPA-3a、HPA-3b），Gp Ⅱb第843個位點發(fā)生由T到G的堿基替換。HPA-3a（Baka）在這個位點的基因編碼Ⅱe，而 HPA-3b（Bakb）的 等 位 基 因 編 碼 Ser［12］。Carter 等［13］研究者應(yīng)用 PCR-RFLP 方法檢測 515 例腦梗死患者和423 例對照者的HPA-3 基因頻率，發(fā)現(xiàn)兩組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.5），通過隨訪死亡病例和存活者，處理了混雜因素后得出結(jié)論，HPA-3與腦梗死病死率有關(guān)，腦梗死患者攜帶HPA-3a等位基因者病死率相對較高。研究發(fā)現(xiàn)，HPA-3b純合子基因與年輕女性患腦梗死風險相關(guān)，女性高血壓病、糖尿病和高同型半胱氨酸血癥等患者攜帶HPA-3b等位基因純合子患缺血性腦卒中的危險性較高［14］。段淏等［15］的研究表明，GP IIb 的基因多態(tài)性與腦梗死的發(fā)生相關(guān)。但有研究顯示，GP Ⅱb HPA-3基因多態(tài)性與腦梗死的發(fā)病無關(guān)。

對于GP Ⅲa基因型，本研究結(jié)果與國內(nèi)部分研究結(jié)果相同，GP Ⅲa 基因型在3 組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），均為TT 基因型，提示GP Ⅲa 基因多態(tài)性與LAA腦梗死發(fā)生無關(guān)，分析其原因可能如下：（1）基因多態(tài)性為基因型，血栓形成為表現(xiàn)型，基因發(fā)揮作用受環(huán)境等多種因素影響；（2）GP Ⅲa基因可能與急性心肌梗死其他高危等位基因位點之間存在連鎖關(guān)系。目前已發(fā)現(xiàn)GP Ⅲa的多態(tài)性有6種，在臨床中研究最為深入廣泛的是HPA-1a和HPA-1b（即PIA1和PIA2），GP Ⅲa基因第2外顯子1565位的T取代C，導致第33位點處亮氨酸（HPA-la，PlA1）被脯氨酸（HPA-lb，PlA2）取代。關(guān)于GP Ⅲa的基因多態(tài)性研究意見尚未一致，Todinova等［16］研究表明，攜帶PlA2等位基因與腦梗死的發(fā)生有關(guān)，其通過調(diào)節(jié)血小板細胞膜彈性、形態(tài)及活化狀態(tài)而促進血栓形成。Weiss 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，GP Ⅲa 基因 P1A1/P1A2多態(tài)性與心肌梗死的發(fā)生有關(guān)，P1A2基因攜帶者易發(fā)生心肌梗死。但 Maguire 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，GP Ⅲa基因多態(tài)性與LAA 腦梗死發(fā)生無關(guān)。大部分國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，漢族人群GP Ⅲa基因多態(tài)性與LAA腦梗死發(fā)生無關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)ib、Gp Ⅱb/Ⅲa 基因多態(tài)性與 LAA腦梗死發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，GP Ⅱb基因多態(tài)性與家族聚集性LAA腦梗死的發(fā)生有關(guān)，其可能通過增強血小板的活化功能從而促進血栓形成，增加家族聚集性LAA腦梗死發(fā)生風險，其研究結(jié)果有待進一步分析，以期為腦血管病的分層防治提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突