RIP1/RIP3介導(dǎo)的程序性壞死在LPS誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元損傷中的作用

鄭天成 郭 俊 孫憲昌

1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271000；2.泰安市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，山東 泰安 271000

帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一種多發(fā)于老年或老年前期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，其主要的臨床表現(xiàn)有靜止性震顫、肌肉僵直和姿勢障礙等運(yùn)動(dòng)癥狀，部分患者伴有嗅覺功能減退、精神異常及認(rèn)知功能障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀［1-2］。病理學(xué)研究已證實(shí)，PD的發(fā)病主要與中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失及紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)的耗竭有關(guān)。因此，了解多巴胺神經(jīng)元死亡的原因和途徑是干預(yù)、治療PD的關(guān)鍵，但多巴胺神經(jīng)元變性缺失的具體機(jī)制至今仍未完全清楚；目前尚無有效的方法或藥物能逆轉(zhuǎn)或阻斷PD病情的進(jìn)展。

研究顯示，PD 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，可能與環(huán)境、年齡、神經(jīng)炎癥和遺傳等多種因素密切相關(guān)，在以上多種因素的共同作用下最終導(dǎo)致了中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的選擇性變性、缺失直至死亡［3-4］。由于黑質(zhì)致密帶內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的死亡是不可逆的，因此預(yù)防或治療PD 的關(guān)鍵在于病因預(yù)防和對多巴胺能神經(jīng)元死亡機(jī)制的干預(yù)。關(guān)于多巴胺能神經(jīng)元死亡機(jī)制和形式目前仍存爭議，大部分研究認(rèn)為，黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的死亡主要與 caspase 依賴的凋亡有關(guān)［5-6］，多巴胺能神經(jīng)元在不同刺激因素的作用下，通過死亡受體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑激活細(xì)胞內(nèi)caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元以凋亡形式死亡缺失。但有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用凋亡抑制劑并不能完全阻斷多巴胺能神經(jīng)元的死亡，說明其他死亡形式也參與了多巴胺能神經(jīng)元的損傷過程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，程序性死亡（necroptosis）可能參與了多巴胺能神經(jīng)元的死亡并在其中發(fā)揮著重要作用［7］。

程序性死亡是近年來發(fā)現(xiàn)并被證實(shí)的一種主要由腫瘤壞死因子受體家族或細(xì)胞表面Toll樣受體家族觸發(fā)啟動(dòng)，可受嚴(yán)格調(diào)控的非caspase依賴性的新型細(xì)胞死亡形式。大量研究已證實(shí)，程序性死亡與免疫性疾病、炎癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病以及腫瘤等多種人類疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］；但目前關(guān)于程序性死亡與PD的關(guān)系研究相對較少且存在爭議。本研究利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立的PD 動(dòng)物模型，探討了程序性死亡在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和多巴胺能神經(jīng)變性缺失中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用的動(dòng)物為30 只2～3 月齡、體質(zhì)量200～250 g、雌雄不限的成年SD 大鼠，購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SYXK（Lu）20190022）。大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中將大鼠置于室溫（21±2）°C、晝夜循環(huán)光照、能自由進(jìn)食和飲水條件下飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

阿撲嗎啡（apomorphine，APO）購自美國Sigma公司；LPS 與 Nec-1 購自美國 MCE 公司，LPS 使用前用生理鹽水（normal saline，NS）溶解成2.5 μg/μL 的備用液，Nec-1用NS（含10%PMSF，20%SBE-β-CD）溶解成1 mg/mL的備用液；水合氯醛購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；多克隆小鼠抗大鼠-TH抗體購自美國Sigma 公司；小鼠抗-CD11b 單克隆抗體購自美國Millipore公司；免疫組化試劑盒（SABC法）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒、蛋白濃度測定BCA試劑盒及RIPA蛋白裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠RIP-1 及兔抗鼠RIP-3多克隆抗體均購自英國Abcam公司；多巴胺、雙羥苯乙酸及高香草酸標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；其它化學(xué)試劑購自國內(nèi)商業(yè)公司，均為分析純。

1.3 主要儀器

OLYMPUS BX50型正置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；專用大鼠立體定位儀，中國深圳瑞沃德生命科技有限公司；CM-2000型切片機(jī)（冰凍），德國萊卡公司；多功能酶標(biāo)分析儀，美國Molecular Devices（MD）公司；高效液相色譜儀及2465型電化學(xué)檢測器，美國Waters公司；UVP Biospectrum，美國UVP公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 SD 大鼠隨機(jī)分為3 組：（1）LPS 模型組（n= 10），動(dòng)物經(jīng)水合氯醛（腹腔注射，400 mg/kg）麻醉后，沿顱頂中線切開頭部皮膚，棉簽蘸取30%H2O2氧化腐蝕皮下組織暴露顱骨，以顱骨骨縫表面前、后囟為標(biāo)志，參考大鼠腦立體定位圖譜，確定大鼠右側(cè)黑質(zhì)注射坐標(biāo)為門齒桿?2.3 mm；前囟后?5.2 mm；旁開 2.1 mm；深度?7.8 mm。用微量注射器吸取2 μL（5 μg）LPS 以1 μL/min 的速度注射到大鼠右側(cè)黑質(zhì)區(qū)［9］，給藥完畢留針5 min后緩慢退出，骨蠟封閉顱骨表面鉆孔，最后縫合頭部皮膚。LPS 注射后，腹腔內(nèi)連續(xù)注射含 10% PMSF 和 20% SBE-β-CD 的 NS（2 mL/kg）14 d。（2）Nec-1+LPS 組（n=10），動(dòng)物黑質(zhì)內(nèi)注射2 μL LPS（方法同模型組），然后腹腔內(nèi)注射Nec-1（2 mg/kg），連續(xù)用藥14 d。（3）對照組（n= 10），黑質(zhì)內(nèi)注射NS 2μL，其余用藥同LPS模型組。

1.4.2 行為學(xué)檢測 黑質(zhì)內(nèi)注射LPS 14 d后，所有動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)檢測。檢測時(shí)提前15 min 將動(dòng)物放置于旋轉(zhuǎn)記錄儀中使其適應(yīng)測試環(huán)境，然后皮下注射 APO 0.5 mg/kg（用 NS 溶解成 1 mg/mL 的備用液），再將大鼠放置于旋轉(zhuǎn)記錄儀中觀察其行為學(xué)改變，記錄30 min內(nèi)大鼠由未注射側(cè)向注射側(cè)旋轉(zhuǎn)的總?cè)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.3 高效液相色譜-電化學(xué)（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測 旋轉(zhuǎn)行為檢測后，各組取6只動(dòng)物，麻醉后斷頭處死并立即分離出兩側(cè)紋狀體，快速稱重后凍存于?80oC 備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)取出凍存有紋狀體的EP 管，加入預(yù)冷的樣品預(yù)處理A 液（0.4 M HClO4）300 μL，用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，然后4 oC，13 000 r/min 離心30 min；離心后吸取240μL上清液存放于1.5 mL EP管，加入120μL預(yù)冷的預(yù)處理B液（300 mM磷酸氫二鉀，2 mM EDTA·2Na，20 mM 檸檬酸鉀），4 oC，13 000 r/min 離心30 min 后吸取上清液上機(jī)檢測。色譜柱為十八烷基硅烷分析柱，檢測方法嚴(yán)格按照說明進(jìn)行，最大上樣柱壓 2 700 psi，流速 1.0 mL/min，ECD 電壓0.65 V，抽樣體積20 μL，每一樣品檢測時(shí)間為50 min。根據(jù)說明利用多巴胺（dopamine，DA）、高香草酸（homovanillic acid，HVA）及二羥苯乙酸（dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC）標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果計(jì)算樣品中DA、HVA和DOPAC的含量。

1.4.4 免疫組化 每組選取4 只大鼠，麻醉后用4%多聚甲醛經(jīng)升主動(dòng)脈灌注固定腦組織。灌注結(jié)束后剝離出全腦，放置于4%多聚甲醛中后固定12 h，然后將固定好的腦組織依次放入10%、20%及30%的蔗糖溶液中進(jìn)行梯度脫水。標(biāo)本處理好后用OCT包埋劑包埋，然后根據(jù)大鼠腦定位圖譜確定黑質(zhì)的位置為前囟后4.8 mm 至6.0 mm，利用冰凍切片機(jī)在此范圍內(nèi)進(jìn)行連續(xù)冠狀切片，片厚30μm；切片被間隔分成2套，分別進(jìn)行CD11b及TH免疫組化染色。染色采用自由漂片法進(jìn)行，過程簡述如下：切片用4%胎牛血清常溫孵育20 min 封閉非特異性抗原，分別加入一抗（TH 1∶800，CD11b 1∶250）4 ℃搖床過夜，然后加入生物素化的二抗（1∶1 200），常溫孵育1 h，再加入被辣根過氧化物酶標(biāo)記過的三抗（1∶1 000），常溫孵育1.5 h，最后應(yīng)用DAB進(jìn)行顯色。

利用OLYMPUS FV1000 Viewer 軟件對腦片黑質(zhì)區(qū)內(nèi)TH 反應(yīng)陽性的細(xì)胞計(jì)數(shù)，每側(cè)黑質(zhì)計(jì)數(shù)兩遍，取其平均數(shù)作為該側(cè)TH反應(yīng)陽性細(xì)胞的數(shù)目，然后用損傷側(cè)的細(xì)胞數(shù)與未損傷側(cè)的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行對比，即為損傷側(cè)黑質(zhì)TH神經(jīng)元存活率［9］。

1.4.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 行為學(xué)檢測結(jié)束后，每組隨機(jī)選取3 只大鼠，經(jīng)水合氯醛麻醉后斷頭取腦，快速切去小腦及嗅球部位，在大腦中后1/3交界處垂直切開腦組織，在大腦的冠狀切面可見清晰的黑質(zhì)輪廓，用彎頭眼科鑷迅速夾取兩側(cè)黑質(zhì)部位的腦組織，稱重后?80oC保存?zhèn)溆?。ELISA實(shí)驗(yàn)前，將組織樣品按1∶9 的比例加入預(yù)冷的lysis 緩沖液（含有蛋白酶抑制劑）冰上勻漿，4 ℃，13 000 r/min 離心30 min 后吸取上清液，ELISA 檢測黑質(zhì)中 TNF-α 及IL-1β 表達(dá)量的變化，檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。根據(jù)樣本450 nm 處測得的吸光度（optical density，OD）對結(jié)果進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線并算出回歸方程。最后根據(jù)待檢樣本的OD值即可得到相應(yīng)的蛋白含量，乘以稀釋倍數(shù)后再與樣品蛋白濃度作比較，即為該樣品的最終濃度。

1.4.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 每組選取3 只大鼠用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)，根據(jù)1.4.5 的方法取大鼠黑質(zhì)組織并稱重后保存于?80℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)每個(gè)樣品按照每4 mg 100 uL 裂解液的比例加入含有1 mM PMSF的RIPA裂解液，用電動(dòng)勻漿機(jī)在冰上將組織充分勻漿裂解，抽提組織中的蛋白。應(yīng)用BCA法檢測各樣品的蛋白濃度，從每個(gè)樣品中吸取等量蛋白（30μg）進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠（10%的分離膠）電泳以分離樣品中的不同蛋白，然后用濕式電泳轉(zhuǎn)移的方法將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。PVDF 膜用5%脫脂牛奶封閉過夜，然后將膜移入含有一抗CD11b（1∶400），RIP1（1∶1 000），RIP3（1∶1 000）和 β-actin（1∶5 000）的孵育盒中4 ℃搖床過夜；再用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶8 000）37 ℃孵育1 h，膜上滴加ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色。應(yīng)用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影拍照并進(jìn)行積分光密度（integrated optical density，IOD）測定，目的蛋白與β-actin的IOD比值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，應(yīng)用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Newman-Keuls 法進(jìn)行兩兩比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改變

研究證實(shí)，LPS 單側(cè)黑質(zhì)區(qū)注射會損傷患側(cè)黑質(zhì)-紋狀體通路，導(dǎo)致同側(cè)紋狀體內(nèi)DA遞質(zhì)含量顯著減少，是建立炎癥相關(guān)PD 動(dòng)物模型的較好方法［10-11］，而APO 誘導(dǎo)的動(dòng)物旋轉(zhuǎn)行為可以作為衡量此類PD 動(dòng)物模型是否成功建立的良好指標(biāo)［12-13］。本實(shí)驗(yàn)在LPS 注射14 d 后檢測了APO 誘導(dǎo)的大鼠行為學(xué)改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠在注射APO 后并沒有出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)現(xiàn)象；LPS 模型組大鼠在皮下注射APO后出現(xiàn)明顯的旋轉(zhuǎn)行為，旋轉(zhuǎn)時(shí)大鼠以患側(cè)后肢作為支點(diǎn)，身體向患側(cè)彎曲，首尾相銜接，原地轉(zhuǎn)動(dòng)，有的動(dòng)物甚至出現(xiàn)身體翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)的平均速度達(dá)8.5 r/min，說明注射側(cè)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元有明顯損傷缺失，已達(dá)到PD成模標(biāo)準(zhǔn)；而應(yīng)用Nec-1 干預(yù)后，大鼠的旋轉(zhuǎn)行為較LPS 組明顯改善（圖1）。

圖1 阿撲嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為

2.2 大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺及其主要代謝產(chǎn)物含量的變化

紋狀體內(nèi)DA 遞質(zhì)的大量丟失是導(dǎo)致PD 患者出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)癥狀的主要原因，與黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的受損缺失程度密切相關(guān)。為進(jìn)一步明確LPS誘導(dǎo)PD 的機(jī)制及Nec-1 對多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響，本研究應(yīng)用HPLC法檢測了大鼠紋狀體內(nèi)DA及主要代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA含量的變化。結(jié)果如圖2所示，LPS模型組大鼠患側(cè)紋狀體內(nèi)DA及其代謝產(chǎn)物HVA 和DOPAC 的含量較對照組明顯減少；Nec-1+LPS 組大鼠患側(cè)紋狀體內(nèi)DA、HVA 及DOPAC 的含量與LPS 組相比，均有不同程度增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 紋狀體內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物含量的變化

2.3 大鼠黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxylase，TH）陽性神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)量變化

TH是多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)特有的酶系統(tǒng)，利用免疫組織化學(xué)的方法對其特異性染色后可以直觀的反應(yīng)黑質(zhì)內(nèi)多巴胺神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)量變化，從而能更好地觀察PD的病理變化。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元被染成棕黃色，胞體較大，境界清楚，纖維豐富，沒有明顯的損傷和缺失；LPS組大鼠患側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH染色明顯變淺，陽性神經(jīng)元數(shù)量較健側(cè)明顯減少，TH陽性神經(jīng)元存活率僅有31.6%；Nec-1+LPS組大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量較未損傷側(cè)也有顯著下降，但與LPS 組動(dòng)物的損傷側(cè)比較，其TH 免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量有明顯提升，其存活率上升到51.9%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組健側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TH染色情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 黑質(zhì)內(nèi)TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)量變化

2.4 大鼠黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活及Nec-1 的影響

LPS誘導(dǎo)的以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的中樞神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷、變性甚至死亡缺失的重要原因。為了觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)在PD致病過程中的作用及程序性壞死對神經(jīng)炎癥的影響，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化的方法對小膠質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的蛋白CD11b進(jìn)行免疫染色，觀察各組動(dòng)物黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量變化并以此判斷其活化情況和中樞炎癥反應(yīng)的程度。結(jié)果如圖4所示，對照組黑質(zhì)區(qū)內(nèi)可見胞體較小、形態(tài)呈明顯分枝狀、散在分布的靜息小膠質(zhì)細(xì)胞；LPS組動(dòng)物損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增多、胞體顯著增大、細(xì)胞分枝消失、形態(tài)呈阿米巴樣變化，是典型的小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活的反應(yīng)，免疫印跡結(jié)果顯示，CD11b 的表達(dá)量明顯較對照組增加；Nec-1+LPS組大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞也有激活的反應(yīng)，表現(xiàn)為數(shù)量增多、染色程度較深、阿米巴樣細(xì)胞增多，但與LPS組相比范圍較局限、活化細(xì)胞數(shù)量較少，染色吸光度及CD11b的表達(dá)量明顯下降，與LPS組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明Nec-1對LPS誘導(dǎo)的炎癥有抑制作用。

圖4 損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)CD11b免疫組化及免疫印跡結(jié)果

2.5 大鼠黑質(zhì)炎癥因子 TNF-α 和 IL-1β 含量的變化

小膠質(zhì)細(xì)胞活化后分泌的促炎介質(zhì)TNF-α 和IL-1β 與DA 能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性死亡密切相關(guān)。為了進(jìn)一步探討LPS 誘導(dǎo)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)利用ELISA 方法檢測了大鼠黑質(zhì)區(qū)主要炎癥因子 TNF-α 及 IL-1β 的含量變化。結(jié)果如圖5 所示，與對照組相比，LPS 組動(dòng)物損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)TNF-α 和IL-1β 的含量明顯升高；與LPS 組相比，注射LPS 后應(yīng)用Nec-1 進(jìn)行干預(yù)的動(dòng)物，其損傷側(cè)黑質(zhì)區(qū)TNF-α 及 IL-1β 的含量明顯降低。以上結(jié)果說明，LPS 激活小膠質(zhì)細(xì)胞后釋放的炎癥因子是誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元死亡的重要原因，炎癥反應(yīng)及炎癥因子的增加可能參與了細(xì)胞程序性壞死的過程。

圖5 損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)炎癥因子表達(dá)量變化

2.6 大鼠黑質(zhì)內(nèi)程序性死亡相關(guān)蛋白RIP1 與RIP3的表達(dá)量變化

RIP1與RIP3是細(xì)胞啟動(dòng)程序性壞死的關(guān)鍵信號分子，是反映細(xì)胞死亡形式的重要蛋白。為了進(jìn)一步探討程序性死亡與LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡的關(guān)系及PD 的發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫印跡的方法檢測了大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)RIP1與RIP3蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果如圖6 所示，LPS 組大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)RIP1與RIP3蛋白的表達(dá)量較對照組均有明顯增加；而Nec-1+LPS 組大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)RIP1與RIP3蛋白的表達(dá)量較LPS組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖6 損傷側(cè)黑質(zhì)內(nèi)程序性死亡相關(guān)蛋白表達(dá)量變化

3 討 論

PD 是一種多發(fā)于中老年人群的神經(jīng)退行性疾病，是世界第一大運(yùn)動(dòng)障礙性疾病，60 歲以上人群中患病率為1%～4%，目前全球PD患者總?cè)藬?shù)已達(dá)600萬人，其中我國患者約占全球的一半［14］，而且隨著我國人口老齡化的加重，PD患者的數(shù)量在未來十年內(nèi)將會明顯增加，PD已成為不可小覷的公共衛(wèi)生問題。PD 主要的臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢不穩(wěn)等運(yùn)動(dòng)功能障礙，盡管這在短期內(nèi)不會危及患者生命，但其較高的發(fā)病率、致殘率及較長的病程會嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并給社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此關(guān)于PD 的研究一直是國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

研究已證實(shí)，中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失及紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)的大量耗竭是PD的主要病理改變，但PD的確切病因及發(fā)病機(jī)制迄今未明，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PD 患者多巴胺神經(jīng)元的死亡可能與遺傳、環(huán)境、年齡及神經(jīng)炎癥等多種因素相關(guān)，是多種因素共同作用的結(jié)果［15］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，以小膠質(zhì)細(xì)胞激活為特征的中樞神經(jīng)炎癥在PD 的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵性作用［16］。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)固有的免疫監(jiān)視細(xì)胞，對腦內(nèi)各種炎癥刺激反應(yīng)靈敏，其適度激活可清除腦內(nèi)病原、細(xì)胞碎片，有助于維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；但持續(xù)或較強(qiáng)的炎癥刺激會導(dǎo)致腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞過渡激活并釋放谷氨酸、促炎因子或活性氧等大量的有害物質(zhì)損傷神經(jīng)元，神經(jīng)元損傷裂解后可以釋放出大量的促炎因子又進(jìn)一步加劇中樞神經(jīng)炎癥反應(yīng)，這樣會在腦內(nèi)形成一個(gè)持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)與神經(jīng)元損傷的惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致了多巴胺能神經(jīng)元的大量損傷、死亡及PD 的發(fā)生。中樞神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是誘發(fā)PD 的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，開始受到越來越多研究者的關(guān)注；炎癥PD 模型隨之成為研究PD機(jī)制、探索PD治療方法的常用模型。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用黑質(zhì)內(nèi)單次注射LPS 的方法建立炎癥PD 動(dòng)物模型進(jìn)行了相關(guān)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［9，17］，黑質(zhì)內(nèi)注射LPS可成功誘導(dǎo)腦內(nèi)炎癥反應(yīng)以及黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的大量死亡缺失，HPLC檢測發(fā)現(xiàn)損傷側(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)明顯減少，APO皮下注射可誘導(dǎo)出模型組動(dòng)物明顯的旋轉(zhuǎn)行為，說明實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了炎癥相關(guān)PD大鼠模型。本實(shí)驗(yàn)以此動(dòng)物模型為基礎(chǔ)，進(jìn)一步對PD 多巴胺能神經(jīng)元死亡方式和機(jī)制進(jìn)行了研究。

眾所周知，多巴胺能神經(jīng)元丟失后是不可再生的，因此預(yù)防或治療PD 的關(guān)鍵在于病因預(yù)防和死亡機(jī)制的干預(yù)，只有盡可能的減少或延緩多巴胺能神經(jīng)元的損傷和死亡，才能有效地延緩或暫停PD的發(fā)生或進(jìn)展。明確多巴胺能神經(jīng)元的死亡方式和機(jī)制是治療和干預(yù)PD至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，目前關(guān)于多巴胺能神經(jīng)元死亡的機(jī)制和形式仍未完全清楚，大部分研究認(rèn)為黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的死亡主要與caspase依賴的凋亡有關(guān)，多巴胺能神經(jīng)元是在不同刺激因素的作用下，通過死亡受體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑激活胞內(nèi)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)了多巴胺能神經(jīng)元以凋亡的形式變性死亡［5-6］。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用凋亡抑制劑并不能完全阻斷多巴胺能神經(jīng)元的死亡，說明其它細(xì)胞死亡形式也參與其中。最新的研究指出，程序性細(xì)胞壞死可能參與了多巴胺能神經(jīng)元的死亡并在其中發(fā)揮著重要作用［7，18］。

程序性死亡是近年來發(fā)現(xiàn)并被證實(shí)的一種可調(diào)控的、caspase 非依賴性的細(xì)胞死亡形式，主要由腫瘤壞死因子受體家族及細(xì)胞表面Toll樣受體家族觸發(fā)啟動(dòng)［19］，然后依次磷酸化激活細(xì)胞內(nèi)重要信號分子RIP1和RIP3并形成壞死復(fù)合物，最后激活混合譜系激酶域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）使其形成寡聚體并轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，促進(jìn)離子內(nèi)流（鈣和鈉）或孔隙形成，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙并使膜完整性受到破壞，觸發(fā)程序性細(xì)胞壞死并釋放出具有損傷作用的分子引起加重炎癥反應(yīng)，參與不同的生理病理過程［20］。目前關(guān)于程序性細(xì)胞壞死與PD的研究相對較少，但有證據(jù)表明，程序性細(xì)胞壞死在PD的病理變化中發(fā)揮重要作用，可以為PD 的治療提供潛在靶點(diǎn)。Lin 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在MPTP制備的小鼠PD模型中，程序性壞死相關(guān)的重要蛋白RIP1、RIP3、MLKL 表達(dá)量明顯增加；應(yīng)用RIP1阻斷劑Necrostatin-1（Nec-1）阻斷程序性壞死后可使上述蛋白表達(dá)量明顯下降，同時(shí)明顯減少了DA神經(jīng)元的損傷數(shù)量；另外該研究還發(fā)現(xiàn)，敲除了RIP3和MLKL 的小鼠除程序性壞死受到抑制外，中腦黑質(zhì)內(nèi)的促炎因子表達(dá)量也有明顯降低。Onate 等［22］在最近的研究中也得到了類似的結(jié)果，證實(shí)了程序性壞死參與了6-OHDA誘導(dǎo)的DA神經(jīng)元死亡，Nec-1處理或抑制RIP3的表達(dá)可保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。但Dionísio等［23］研究發(fā)現(xiàn)，凋亡依然是MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡的主要方式，程序性細(xì)胞壞死在其中的作用有限。所以關(guān)于程序性細(xì)胞壞死在PD中的作用機(jī)制仍然存在爭議且研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過LPS建立炎癥誘導(dǎo)的PD模型，利用程序性壞死特異阻斷劑Nec-1觀察了程序性壞死在炎癥誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元死亡中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Nec-1能明顯改善LPS誘導(dǎo)的動(dòng)物旋轉(zhuǎn)行為，明顯減輕黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的損傷和丟失，明顯提升了紋狀體內(nèi)多巴胺遞質(zhì)的含量，表明程序性壞死是LPS導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元丟失的重要方式。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，作為腦內(nèi)炎癥反應(yīng)重要標(biāo)志的小膠質(zhì)細(xì)胞，在LPS刺激下明顯激活，表現(xiàn)為數(shù)量明顯增多、胞體明顯變大、突起變短甚至消失，呈現(xiàn)阿米巴樣形態(tài)；而應(yīng)用Nec-1后小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)學(xué)變化均有明顯改善。以上結(jié)果表明，抑制程序性細(xì)胞壞死可通過減輕炎癥反應(yīng)保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。這些結(jié)果與既往研究基本一致，均表明炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)程序性壞死的發(fā)生，程序性壞死可釋放促炎物質(zhì)加劇腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的進(jìn)行，程序性壞死可作為治療神經(jīng)系統(tǒng)炎癥疾病的重要靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過LPS 建立的炎癥PD 模型，證實(shí)了程序性壞死與多巴胺能神經(jīng)元的死亡密切相關(guān)，可能參與了PD 的發(fā)病過程。而程序性壞死具體的機(jī)制，在多巴胺能神經(jīng)元死亡中的重要程度，凋亡和程序性壞死之間的關(guān)系等諸多問題，仍需要通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突