動物冠狀病毒檢測方法的研究進展

何 迅，游 蘭，范紫瑋，鄭田利，陳嘉熠，裴曉方

冠狀病毒(Coronavirus，CoV)是有包膜的單股正鏈RNA病毒，病毒直徑約80～120 nm，從1937年首次在雞身上分離出冠狀病毒以來，共發(fā)現(xiàn)38種冠狀病毒，其中有7種可感染人類，分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、SARS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV-2。其中，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1主要引起普通感冒癥狀，而SARS-COV、MERS-COV、SARS-CoV-2可引起重癥呼吸道綜合征，甚至死亡[1]。研究表明，SARS-CoV和MERS-CoV均起源于蝙蝠冠狀病毒，并分別通過果子貍和單峰駱駝傳播至人[2]。研究發(fā)現(xiàn)冠狀病毒作為RNA病毒，具有較高的變異率，在一定的條件下，兩種不同基因類型的病毒在感染同一細胞時，病毒基因可通過重組變異產(chǎn)生新的病毒并適應新的宿主，導致不可預見的流行范圍和致病性。已有研究發(fā)現(xiàn)犬冠狀病毒(Canine coronavirus, CCoV)ORF3b區(qū)域缺失毒株可導致致命的感染和長期淋巴細胞減少，且可在犬巨噬細胞/單核細胞及人巨噬細胞中復制，具有可傳染人的風險[3]；還有從患有急性未分化熱病的海地兒童血漿樣品中鑒定出豬δ冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)[4]。目前，雖然SARS-CoV-2仍溯源不明，有報道顯示,針對11個代表性物種的大規(guī)模單細胞測序證明貓是SARS-CoV-2靶細胞比例最多的物種[5]。因此，為了避免動物成為將來各種冠狀病毒的混合器和中間宿主，有必要對動物中冠狀病毒的攜帶情況進行全面的監(jiān)測。

1 檢測動物冠狀病毒的常用樣品

已有研究發(fā)現(xiàn)，動物冠狀病毒主要感染處于幼齡階段的各類禽畜[6]，常導致不同宿主的呼吸道和消化道感染，甚至造成腎臟和生殖系統(tǒng)的感染[7]，嚴重時可導致禽畜死亡。有研究團隊[8]用ELISA和RT-PCR對咳嗽、流涕、腹瀉病牛的鼻拭子及糞便樣品同時進行檢測，結(jié)果顯示，ELISA檢測鼻拭子和糞便的BCoV檢出率分別為48%和53%，而RT-PCR檢出率分別為84%和96%，由此可見在動物冠狀病毒的檢測中，可針對研究目的采集不同感染階段動物的不同部位。如表1所示，常見樣本主要包括糞便、肛拭子、鼻咽拭子、氣管組織和腸道組織等。

表1 常用于檢測動物冠狀病毒的樣品

2 分離培養(yǎng)冠狀病毒的細胞類型

動物冠狀病毒常用傳代細胞進行分離培養(yǎng)，不同病毒所用傳代細胞類型如表2所示。在培養(yǎng)冠狀病毒過程中，往往需要添加一些特殊的成分或同時盲傳多代培養(yǎng)才能觀察到細胞病變效應(Cytopathic effect , CPE)，如在對PDCoV分離和培養(yǎng)過程中，需要添加胰酶、胰腺酶或未感染仔豬的小腸內(nèi)容物[17]；再如CCoV接種犬纖維肉瘤(A72)細胞系和犬腎上皮(MDCK)細胞，A72細胞系盲傳至第7代24 h后才觀察到明顯CPE；而MDCK細胞在盲傳第7代后仍無病毒生長[18]。

表2 常見分離培養(yǎng)動物冠狀病毒的細胞類型

3 冠狀病毒分子學檢測技術(shù)

常用于檢測冠狀病毒核酸的技術(shù)包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、基因芯片技術(shù)以及其它新興技術(shù)等。應用最廣泛的是普通RT-PCR。隨著病毒變異和多重感染的情況出現(xiàn)，研究者們還建立了多種特異性更高、適用范圍更廣的核酸檢測技術(shù)。

3.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應 冠狀病毒基因組結(jié)構(gòu)相似，其基因組5′端具有甲基化的帽狀結(jié)構(gòu)，3′端具有poly(A)尾，基因組含有約7～10個功能基因，從5′端到3′依次為5′-ORF1a/b-(HE)-S-E-M-N-3′。ORF1ab主要編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白；剩下基因區(qū)域主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。S、E、M和N基因分別編碼冠狀病毒的刺突蛋白(Spike Protein，S)、包膜蛋白(Envelop Protein，E)、膜蛋白(Membrane Protein，M)和核衣殼蛋白(Nucleocapsid Protein，N)，另外還有一些β屬冠狀病毒編碼一種與包膜相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白血凝素酯酶蛋白(Hemagglutinin-esterase Protein，HE)。以PDCoV為例，病毒的基因組如圖1所示。基因組結(jié)構(gòu)的差異是冠狀病毒分成不同類群的依據(jù)，針對差異的基因結(jié)構(gòu)設計檢測試劑盒可以有效地鑒別不同的冠狀病毒。

圖1 PDCoV的基因組示意圖[25]

冠狀病毒作為RNA病毒，RT-PCR是檢測其最常規(guī)的方法，但只能進行定性檢測。實時熒光定量PCR技術(shù)通過檢測熒光信號強度直接對產(chǎn)物進行定性分析和定量分析，具有高靈敏度、高特異性和高精準定量等優(yōu)點。Xiu L團隊[26]針對冠狀病毒RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)基因設計了通用型引物，建立了一種新的半巢式逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR方法，并在81份家禽拭子樣品中檢出25份冠狀病毒陽性；109份豬拭子樣本中檢出1份陽性樣本；31份活禽市場氣溶膠樣本中檢出6份陽性樣本。除上述通用引物PCR外，應用最普遍的就是分別針對各種冠狀病毒的N[27]、M[28]、S[14]基因保守區(qū)域所建立的特異性RT-PCR。

除了上述針對一種冠狀病毒的單一RT-PCR外，多個研究團隊還建立了可同時檢測2種及以上病原體的雙重及多重RT-PCR或?qū)崟r熒光PCR方法[13, 29-30]。這在診斷臨床混合感染樣品及監(jiān)測疾病中具有較大的優(yōu)勢，但在引物設計、探針合成方面較為嚴格。

3.2 等溫擴增法 常見的等溫擴增技術(shù)包括環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)、重組酶聚合酶擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification, RPA)、滾環(huán)擴增技術(shù)以及依賴解旋酶等溫擴增技術(shù)等。LAMP技術(shù)使用鏈置換型DNA聚合酶等溫擴增，通過肉眼觀察有無白色沉淀即可簡單定性，可在15～60 min內(nèi)實現(xiàn)109～1 010倍的擴增[31]。有學者建立了檢測IBV的RT-LAMP方法[32]，對268份不同類型的臨床樣本進行檢測，平均檢出率為98.65%；另外，該法用于檢測PEDV[33]、PDCoV[34]等動物冠狀病毒時均顯示出較高的靈敏度和特異性。RPA技術(shù)是一種依賴于重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶在常溫條件下5～20 min即可完成的等溫擴增技術(shù)。也有學者針對PDCoV N基因設計特異引物，建立了檢測PDCoV的RPA方法[35]，最低檢測限度為103copies/μL，且檢測結(jié)果比普通PCR方法更加準確。該技術(shù)也成功用于快速檢測CCoV[36]。

3.3 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)的原理為大量合成的DNA探針有序地固定在芯片載體表面成為基因芯片，待檢樣品經(jīng)過擴增和標記后，與基因芯片雜交反應，掃描并分析雜交反應的信號，即可得到待檢樣品的基因信息?；蛐酒夹g(shù)減少了傳統(tǒng)檢測技術(shù)中為同時檢測多種病原而增加多種引物帶來的非特異性反應的發(fā)生概率，對于多種病原混合感染的診斷顯示出較大的優(yōu)勢，推動了基因芯片技術(shù)在病原檢測方面的應用。

胡靖飛團隊[37]建立了聯(lián)合檢測豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒A群與豬δ冠狀病毒4種豬腸道病毒的寡核苷酸芯片并進行了臨床應用，可同步快速區(qū)分4種仔豬腹瀉，為仔豬腹瀉的鑒別診斷和高通量篩查提供了新技術(shù)。熊煒研究團隊[38]在大量構(gòu)建特異克隆的基礎(chǔ)上篩選，制備了可同時檢測并區(qū)分CCoV、FECV、和FIPV的特異性基因芯片。

3.4 基因測序技術(shù) 冠狀病毒具有遺傳多樣性，容易發(fā)生變異和跨種傳播。2020年3月以來，先后有多個國家報道了多起SARS-CoV-2動物感染疫情，荷蘭、丹麥等國家還出現(xiàn)了人-水貂-人的傳播鏈條[39-40]，當冠狀病毒出現(xiàn)跨種傳播時，原病毒在新宿主體內(nèi)是否發(fā)生變異從而形成一種新的病毒，單靠一般檢測技術(shù)無法進行準確判別，只能對其基因序列進行測序，進而分析其基因結(jié)構(gòu)以及構(gòu)建進化樹，從而進行病毒溯源。

測序技術(shù)是指測定基因組DNA分子中每一個堿基的排列順序，與數(shù)據(jù)庫比對后進行分類。這項技術(shù)幾乎可以識別臨床上所有病原微生物，尤其在面對未知病原體檢測方面，不需對病原體進行分離培養(yǎng)，也不需要依賴已知序列才可設計引物進行擴增和檢測。適合于病原體初期識別和病毒溯源，具有特異性高及準確性好等特點，但由于檢測周期長，并且對儀器設備和檢測人員要求嚴格，并不適用于快速大量檢測。

3.5 其他技術(shù) 納米PCR可用于檢測動物冠狀病毒含量較低的樣品，它是在普通PCR的基礎(chǔ)上加入具有優(yōu)良導熱性的納米金顆粒，可縮短擴增時間，同時能特異性吸附單鏈DNA分子，從而減少非特異性擴增[41]。Zhu Y等[30]用納米RT-PCR和普通RT-PCR同時檢測病豬的糞便樣本，兩種方法對PEDV的檢出率分別為48.2%和45.6%，且經(jīng)比較，納米RT-PCR的靈敏度是普通RT-PCR的10倍，檢測下限也明顯高于后者。

數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)是近年發(fā)展起來的一種核酸絕對定量的檢測技術(shù)，其原理可理解為分散成無數(shù)個獨立反應單元的定量PCR，從而實現(xiàn)單分子意義上的絕對定量檢測，擴增結(jié)束后讀取各個反應單元的陰性或者陽性熒光信號并采用泊松分布的統(tǒng)計學方法進行分析，即可計算出原始樣本的模板拷貝數(shù)[42]。藍柯團隊開發(fā)了用于檢測SARS-CoV-2的微滴式數(shù)字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)，檢測下限值是RT-PCR的1/500，且臨床總體準確率達到94.3%[43]。雖然目前dPCR用于動物冠狀病毒的診斷仍處于起步階段，但其在快速、靈敏和準確定量患畜樣品中病毒載量方面具有巨大潛力。

4 免疫學檢測

免疫學方法應用于動物冠狀病毒的檢測較為常見，根據(jù)抗原抗體特異性反應的基本原理，可通過檢測樣本中病毒蛋白或者機體產(chǎn)生的相應抗體來確診。冠狀病毒的S、M、E和N蛋白這4種蛋白常作為免疫檢測的特異性靶點。目前，常用的一些免疫學方法包括血清中和實驗、酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)、免疫膠體金試紙、間接免疫熒光技術(shù)(Indirect immunofluorescence，IF)等。對于采集不同的動物樣本，綜合考慮靈敏度、特異度和準確性等因素選擇合適的方法。如針對動物血清樣本，常采用血清中和實驗、ELISA、IF等方法檢測抗體，其中血清中和實驗和ELISA都適用于大批量血清學調(diào)查，但都存在交叉反應的缺點。ELISA由于具備很好的靈敏度、特異度和穩(wěn)定性，是目前實驗室使用最廣泛的檢測方法之一，如對PDCoV[44]、BCoV[45]等的檢測。ELISA也可用于動物組織、糞便等樣本的病原檢測[46]。而免疫膠體金試紙則在操作簡便、檢測速度上更有優(yōu)勢。如今，市面上已有一些動物冠狀病毒免疫檢測試劑盒的研制和開發(fā)，但由于方法本身的缺點、樣本復雜性以及交叉反應性等，也易產(chǎn)生假陽或假陰性從而不能準確診斷。因此對于動物冠狀病毒的檢測，免疫學方法常用作初篩和進一步基因檢測和臨床診斷的輔助手段。

5 小 結(jié)

非典、中東呼吸綜合征以及新冠肺炎疫情的發(fā)生表明，冠狀病毒從動物跨種傳播到人類會嚴重危害人類健康和社會的發(fā)展。在“全健康”理念下，加強對動物冠狀病毒的監(jiān)測和研究、及早發(fā)現(xiàn)潛在的威脅人群健康的動物病毒、共同促進人和動物健康顯得尤為重要。

目前已經(jīng)建立了多種檢測動物冠狀病毒的方法，然而每一種方法各有優(yōu)缺點，單一的技術(shù)不足以解決臨床樣本檢測中的所有問題。細胞分離培養(yǎng)雖然作為病毒診斷的金標準，但它耗時費力不便于快速檢測，僅適用于實驗室病原體的研究；雖然作為目前最常用的檢測技術(shù)，但PCR技術(shù)對設備要求高且具有一定的檢出下限，同時易交叉污染，出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果；等溫擴增檢測技術(shù)雖具有靈敏度高、擴增速度快以及無需變溫等優(yōu)勢，但也存在引物設計復雜、容易出現(xiàn)假陽性等弊端；基因芯片技術(shù)雖具有準確且高通量的優(yōu)點，但成本相對較高，對于臨床樣本檢測的實用性不強。免疫學手段雖能檢測病毒的抗體或抗原，但不適合于早期診斷，不利于及時發(fā)現(xiàn)病毒。基因測序技術(shù)作為確定病毒種類和病毒溯源的有力方法，但不適用于疫情暴發(fā)時的快速診斷。數(shù)字PCR雖能準確定量病毒含量，但現(xiàn)在仍處于初步發(fā)展階段。因此，未來開發(fā)新型的冠狀病毒檢測技術(shù)應以快速、靈敏、高效和準確為主要特征，可從電化學、試紙條、數(shù)字化及納米技術(shù)等方向出發(fā)，開發(fā)出具有快速診斷、低成本、高靈敏度和不需專業(yè)人員操作的檢測技術(shù)，為傳染病早期監(jiān)控提供技術(shù)保障。

利益沖突：無

引用本文格式：何迅，游蘭，范紫瑋，等.動物冠狀病毒檢測方法的研究進展[J].中國人獸共患病學報，2022，38(1)：42-47.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.166