2020年深圳地區(qū)4株冠狀病毒HCoV-NL63基因組特征分析

阮嘉雯，胡鵬威，蔣潘虹，鞠長燕，劉楚云，袁 夢，段永翔，陳 輝，俞慕華

人冠狀病毒NL63(Human coronavirus NL63，HCoV-NL63)是呼吸道感染中常見的病毒之一，臨床表現(xiàn)主要為病毒性感冒癥狀，在嬰幼兒、老年人和免疫缺陷患者中可引起肺炎或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-3]。Huang等[3]發(fā)現(xiàn)在臺灣因肺炎住院病例中HCoV-NL63檢出率為8.4%。2020年深圳市某看守所發(fā)生了一起由HCoV-NL63引起的呼吸道感染聚集性疫情，感染率為35.8%，遠高于研究報道的HCoV-NL63感染率(1.0%～9.3%)[4-5]。在新冠肺炎疫情期間，本課題組所在的流感監(jiān)測實驗室進一步擴大對轄區(qū)內(nèi)呼吸道感染疫情的病原學(xué)監(jiān)測譜，發(fā)現(xiàn)HCoV-NL63檢出率有所上升。現(xiàn)階段我國HCoV-NL63尚未有健全的監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，國內(nèi)的報道主要集中在HCoV-NL63在呼吸道感染病例中的檢出率，但關(guān)于其全基因組序列信息、基因型特征及進化變異規(guī)律的報道仍較少。

HCoV-NL63為有包膜的單股正鏈RNA病毒，全長約27 538 bp，基因組結(jié)構(gòu)從5′端到3′端依次為5′UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3′UTR[6]。棘突蛋白(Spike protein，S)和膜蛋白(Membrane protein, M)是HCoV-NL63兩個重要的糖蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，M蛋白在HCoV-NL63感染早期扮演重要的角色，S蛋白與M蛋白的協(xié)同作用是病毒與受體細胞結(jié)合并介導(dǎo)膜融合的先決條件[7-9]。由于HCoV-NL63和可引起重癥肺炎的冠狀病毒SARS-CoV、SARS-CoV-2均以血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)為受體，具有誘發(fā)嚴(yán)重下呼吸道感染的風(fēng)險[10-11]，因此，監(jiān)測HCoV-NL63遺傳變異和致病性仍具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究對新冠疫情期間深圳市南山區(qū)呼吸道感染聚集性疫情[4]和散發(fā)疫情中獲得的4株HCoV-NL63核酸陽性樣本進行全基因組測序，并結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中其他國家和地區(qū)HCoV-NL63流行株序列信息，對HCoV-NL63基因特征及S蛋白、M蛋白的N-糖基化位點進行分析比較，在一定程度上豐富了我國HCoV-NL63分子流行病學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)，同時也為HCoV-NL63的診斷治療及防控提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 本研究中4份HCoV-NL63核酸檢測陽性標(biāo)本分別來自于深圳市南山區(qū)一起呼吸道感染聚集性疫情[4]和學(xué)校呼吸道感染散發(fā)疫情的咽拭子標(biāo)本。

1.2 病毒檢測和基因測序 通過天隆核酸提取儀(西安天隆科技有限公司)提取咽拭子標(biāo)本中病毒總RNA，利用實時熒光定量PCR法(RT-PCR)檢測HCoV-NL63，試劑為15項呼吸道病原體快速檢測試劑盒(聯(lián)合醫(yī)學(xué))。HCoV-NL63核酸檢測陽性樣品由深圳華大基因科技有限公司進行二代測序。

1.3 序列分析 在GenBank數(shù)據(jù)庫中篩選并下載1983—2018年全球HCoV-NL63流行株。進一步對比剔除相同的HCoV-NL63核苷酸序列后，利用MEGA 6.0軟件對下載的具有代表性的55條HCoV-NL63全基因組序列構(gòu)建全基因組親緣關(guān)系進化樹。采用最大似然法(maximum likelihood,ML),選擇計算得出的GTR+G替換模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并使用p-distance估計遺傳距離，bootstrap值選擇1000次引導(dǎo)重復(fù)測試準(zhǔn)確性，bootstrap值>60%認為分組具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用Bioedit軟件計算本研究獲得的HCoV-NL63毒株序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的其他國家和地區(qū)55條參考株全基因組序列氨基酸熵值，分析其變異情況。同源性比較及S蛋白、M蛋白氨基酸位點突變分析通過MEGA 6.0軟件完成。氨基酸突變位點分析選用B基因型參比株AY518894.1。

2 結(jié) 果

2.1 基因組序列信息 本研究通過二代測序技術(shù)獲得了4株HCoV-NL63全基因組序列(表1)，推測其基因組結(jié)構(gòu)從5′端到3′端依次為5′UTR、ORF1a、ORF1b、S、ORF3、E、M、N、3′UTR，基因組兩端分別含有轉(zhuǎn)錄非翻譯區(qū)(UTR)。

表1 4株HCoV-NL63毒株信息

2.2 進化樹分析 將本研究中獲得的4株序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中下載1983—2018年全球具有代表性的HCoV-NL63 S基因序列和全基因組序列構(gòu)建進化樹分析。S基因的進化樹分析結(jié)果顯示(圖1A)，HCoV-NL63毒株劃分為A、B、C 3個基因型，其中本研究獲取的4株毒株均屬于B基因型B2基因亞型，在進化樹上處于同一分支，與2018年廣州發(fā)現(xiàn)的MK334046.1、MK334047.1株親緣性關(guān)系較近。S基因的進化樹跟全基因組進化樹(圖1B)結(jié)果相似。

▲指本研究獲得的毒株。A: 以S基因序列構(gòu)建進化樹; B: 以全基因組序列構(gòu)建的進化樹。

2.3 序列同源性分析 將本研究中獲得的4株HCoV-NL63毒株和6株參考株的全序列進行同源性分析，結(jié)果見表2。本研究獲得的4株毒株間的核苷酸(氨基酸)同源性為99.80%～99.98%(99.64%～99.93%)，與2018年廣州發(fā)現(xiàn)的B基因型MK334046.1同源性為99.79%～99.90%(99.68%～99.84%)，與B型參考株AY518894同源性為98.52%～98.59%(97.81%～97.90%)；與原型株NC 005831.2同源性為97.64%～97.70%(96.85%～96.92%)。

表2 2020年深圳市南山區(qū)4株HCoV-NL63毒株與參考株全序列同源性分析

2.4 全基因組基因多態(tài)性分析 采用BioEdit軟件(v7.9.0)Entropy[H(X)]plot計算從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的55條HCoV-NL63流行株序列及本研究獲得的毒株序列各蛋白編碼區(qū)氨基酸位點的熵值。由圖2分析發(fā)現(xiàn)，變異性較大的蛋白編碼區(qū)分別為ORF1ab蛋白、S蛋白和M蛋白。全基因組中變異熵值≥0.6的易突變氨基酸位點共有193個，其中ORF1ab蛋白編碼區(qū)最多，有90個，占蛋白編碼區(qū)總變異位點數(shù)46.6%；其次為S蛋白，有83個(43%)易突變位點；M蛋白、N蛋白、E蛋白分別有9、5、2個位點。

圖2 全基因組各個蛋白質(zhì)編碼區(qū)氨基酸變異

將獲得的4株HCoV-NL63序列和B型的參考株進行S蛋白、M蛋白氨基酸位點差異分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S蛋白有48個單氨基酸多態(tài)性位點(圖3)，其中在本研究從學(xué)校疫情獲得的3株毒株(NL63-SZNS02/2020、NL63-SZNS03/2020、NL63-SZNS04/2020)的S1蛋白區(qū)第196位均發(fā)生了亮氨酸→苯丙氨酸的突變；聚集性疫情NL63-SZNS01/2020毒株S2蛋白區(qū)第946位發(fā)生了氨基酸替換(A946S)。M蛋白有8個單氨基酸多態(tài)性位點(圖4)。

圖3 獲得的4株HCoV-NL63毒株與B型參考株S蛋白氨基酸差異位點比較

圖4 獲得的4株HCoV-NL63毒株與B型參考株M蛋白氨基酸差異位點比較

2.5 N-糖基化位點分析 通過NetNGlye 1.0在線預(yù)測了獲得的HCoV-NL63毒株S蛋白和M蛋白的N-糖基化位點。結(jié)果顯示，S蛋白有10個糖基化位點(閾值>0.5)，分別為94 NISL、117 NVST、153 NATR、299 NFSS、424 NVSA、504 NISL、842 NVTS、850 NLSS、1216 NKTL、1245 NLSS；M蛋白的N-糖基化位點有2個(閾值>0.5)，分別為3NSSV、19NFSW。

3 討 論

HCoV-NL63是目前已知的唯一能與SARS-CoV和SARS-CoV-2的受體ACE2結(jié)合，從而侵染細胞并在胞內(nèi)進行病毒復(fù)制的α屬冠狀病毒[12]。Van等[13-14]發(fā)現(xiàn)在幾乎所有8歲以上兒童血清中均能檢測到針對HCoV-NL63的有效中和抗體，表明HCoV-NL63感染在嬰幼兒時期非常普遍。雖然HCoV-NL63臨床表現(xiàn)主要為輕微的呼吸道感染癥狀，但隨著病毒的持續(xù)傳播和進化，其致病性也會發(fā)生變化。2018年Wang等[15]在廣州發(fā)現(xiàn)HCoV-NL63病毒的B基因型和C3亞型可誘發(fā)嚴(yán)重的下呼吸道感染癥狀，推測S蛋白RBD區(qū)域I507L位點的突變可能會加強HCoV-NL63的傳播力和致病力。因此，監(jiān)測HCoV-NL63基因遺傳變異特性，對評估HCoV-NL63流行風(fēng)險和制定相應(yīng)的防控措施有著重要的作用。

本研究從聚集性疫情和散發(fā)疫情HCoV-NL63核酸檢測陽性標(biāo)本中，利用二代測序技術(shù)獲得了4株不同來源的HCoV-NL63全基因組序列，并進行基因型鑒定和基因特征分析。結(jié)果顯示本研究中4株不同來源的HCoV-NL63毒株序列高度相似，并且與廣州肺炎病人的MK334046.1、MK334047.1在基因進化樹形成一個獨立的進化分支，提示來源于同一傳播鏈；對已報道深圳地區(qū)流行的HCoV-NL63毒株S蛋白進行進化分析，此次在南山區(qū)疫情中獲得的4株毒株與2014年深圳市流行的HCoV-NL63毒株被劃分為不同的基因亞型，推測深圳地區(qū)HCoV-NL63可能存在不同的傳播鏈，引起聚集性疫情和散發(fā)疫情的HCoV-NL63病毒源自廣州毒株的可能性大。由于目前已知的深圳地區(qū)HCoV-NL63毒株序列的時間空間覆蓋不足，尚不能全面的解釋深圳地區(qū)HCoV-NL63毒株變異變遷情況，后續(xù)仍需收集更多的流行毒株序列信息。

對熵值結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，變異在基因組廣泛存在，結(jié)構(gòu)蛋白中S蛋白氨基酸變異最大，因此S蛋白經(jīng)常作為分子流行病學(xué)研究病毒傳播鏈的靶基因片段。前期研究發(fā)現(xiàn)，S蛋白與M蛋白在病毒識別受體細胞、侵染細胞并在胞內(nèi)進行病毒復(fù)制的過程中起著重要的作用[7]。S蛋白是冠狀病毒中最大的跨膜糖基化蛋白，胞外域可以被分成介導(dǎo)受體結(jié)合的S1和介導(dǎo)膜融合的S2兩個蛋白亞基。S1亞基是主要的功能區(qū)，包含兩個功能域:N端結(jié)構(gòu)區(qū)(N-terminal region,NTR)和受體結(jié)合區(qū)(Receptor binding domain,RBD)(476～616 aa)[15-16]。目前認為N端結(jié)構(gòu)區(qū)是S蛋白中基因變異頻率最高的區(qū)域，含有多個潛在的N-糖基化位點[17]。S2亞基進一步使病毒包膜和細胞膜重新排列，拉近病毒膜和細胞膜間的距離，啟動膜融合的發(fā)生，介導(dǎo)病毒侵入細胞[18]。與B型參考株相比，本研究獲得的4株HCoV-NL63株的S蛋白中發(fā)現(xiàn)2處氨基酸位點變異：位于散發(fā)疫情毒株S1蛋白NTR區(qū)L196F和位于聚集性疫情毒株S2蛋白A946S。A946S突變是否會影響聚集性疫情毒株與細胞膜融合過程從而引起感染率升高，仍需深入研究。進一步對GenBank數(shù)據(jù)庫中HCoV-NL63病毒B基因型流行株序列分析發(fā)現(xiàn)，2018年來中國廣東地區(qū)B基因型流行株中S1亞基94氨基酸發(fā)生了替換(K94N)，增加了94位N-糖基化位點94 NISL。S1蛋白區(qū)域的N-糖基化位點增加可能會引起氨基酸空間構(gòu)象的改變，可能會在一定程度上幫助病毒逃逸宿主中和抗體識別[19-20]。本研究獲得的廣東地區(qū)HCoV-NL63 B基因型流行株中N-糖基化位點增加對病毒抗原性及機體免疫的影響還有待進一步的探討。

M蛋白通過與宿主細胞表面硫酸肝素糖蛋白(HSPGs)結(jié)合，介導(dǎo)病毒附著于宿主細胞，在HCoV-NL63早期感染階段起著重要的作用。M蛋白包含一個氨基端膜外區(qū)、一個跨膜區(qū)和一個羧基端膜內(nèi)區(qū)，氨基端153～226 aa區(qū)被認為是HSPG結(jié)合位點[7, 21-22]。對GenBanK數(shù)據(jù)庫中HCoV-NL63病毒B基因型流行株M蛋白分析發(fā)現(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)M蛋白153～226 aa區(qū)域較為保守，與B型參比株相比均沒有發(fā)生氨基酸替換；在廣東流行株中均發(fā)現(xiàn)3個特異性的氨基酸位點變異(L43F、V76I、L122I)，這些氨基酸位點的突變對HCoV-NL63的致病力和傳播能力的影響仍有待研究。

本研究對深圳地區(qū)聚集性疫情和散發(fā)疫情獲得的4株HCoV-NL63進行全基因組測序和基因特征分析，初步分析了與病毒入侵相關(guān)的S蛋白、M蛋白的氨基酸變異情況及潛在的N-糖基化位點，在一定程度上豐富了我國HCoV-NL63基因特征信息，為相關(guān)的防控工作提供生物學(xué)依據(jù)。

利益沖突：無

引用本文格式：阮嘉雯，胡鵬威，蔣潘虹，等.2020年深圳地區(qū)4株冠狀病毒HCoV-NL63基因組特征分析[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(1)：35-41.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.178