發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒溫度敏感性研究

韋雪敏，李書(shū)晗，王 耀，陳夢(mèng)婷，趙 麗，王志玉，萬(wàn) 敏，溫紅玲

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)屬布尼亞病毒目白纖病毒科白蛉病毒屬。由其引起的SFTS是一種新發(fā)出血熱疾病，病死率高達(dá)30%[1]。自2009年發(fā)現(xiàn)SFTSV后，其發(fā)病人數(shù)逐年增加，發(fā)病區(qū)域也在不斷擴(kuò)大，截至2018年已累計(jì)有25個(gè)省報(bào)告了SFTS病例[2]。SFTSV主要通過(guò)蜱叮咬傳播，也可在人與人之間傳播[3]，且有多項(xiàng)報(bào)道表明患病寵物可直接將SFTSV傳染給人類[4-6]。作為一種新發(fā)病原體，目前對(duì)其生物學(xué)和理化特性的了解尚不充分。本研究主要通過(guò)觀察不同溫度對(duì)SFTSV病毒滴度的影響，了解其對(duì)溫度的敏感性，為SFTSV的消毒和實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞和病毒 非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株JS2011-013-1由江蘇省疾病預(yù)防控制中心惠贈(zèng)。JS2011-013-1的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染量(CCID50)為107.25/100 μL。

1.1.2 主要試劑及儀器 熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)。DMEM培養(yǎng)基和青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司, FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。一抗為人源SFTSV Gn蛋白單克隆抗體(由武漢大學(xué)于學(xué)杰教授課題組惠贈(zèng))[7]。異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的二抗(山羊抗人IgG)購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溫度實(shí)驗(yàn) 將待測(cè)病毒分裝到250 μL的PCR管中，100 μL/管，分別放置在4 ℃冰箱，以及25 ℃、37 ℃、39 ℃、56 ℃、70 ℃金屬浴中。間隔預(yù)定時(shí)間后，分別取出1份樣品，用DMEM維持液(含1%滅活的胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素雙抗)對(duì)樣品做10倍梯度稀釋。

1.2.2 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn) Vero細(xì)胞接種到96孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12～18 h(細(xì)胞匯合度70%～80%)后接種上述病毒稀釋液，每個(gè)梯度設(shè)置4個(gè)平行樣，并同時(shí)設(shè)置4個(gè)病毒陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。72 h后，加入-20 ℃預(yù)冷的80%丙酮固定12 h后，棄去固定液，加入人源SFTSV Gn抗體(1∶750，抗體稀釋液稀釋)，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次后，在避光條件下，加入FITC標(biāo)記的二抗(1∶50，PBS稀釋)，并在稀釋液中按1∶2 000加入0.5%埃文斯藍(lán)?；靹蚝?，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次后在熒光顯微鏡下觀察記錄熒光孔的分布。Karber法計(jì)算病毒CCID50。

2 結(jié) 果

2.1 在4 ℃、25 ℃、37 ℃和39 ℃條件下SFTSV滴度變化 隨溫度的升高，病毒滴度下降速度加快，在4 ℃、25 ℃、37 ℃和39 ℃放置24 h后由107.25/100 μL分別下降到107.00/100 μL、106.75/100 μL、106.50/100 μL、105.00/100 μL(表1)。同一溫度，隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)，病毒滴度下降趨勢(shì)也愈加明顯，SFTSV在4 ℃、25 ℃、37 ℃放置72 h后，病毒滴度由107.25/100 μL分別下降到106.63/100 μL、106.50/100 μL、103.38/100 μL。SFTSV在39 ℃放置72 h后完全被滅活(圖1)。

圖1 多種溫度下SFTSV隨時(shí)間病毒滴度變化情況

表1 多種溫度下SFTSV隨時(shí)間變化滅活對(duì)數(shù)值

2.2 56 ℃、70 ℃條件下對(duì)SFTSV的作用 由表2可知，56 ℃作用180 min或70 ℃ 作用5 min后，SFTSV失去活性，熒光顯微鏡下無(wú)熒光出現(xiàn)(圖2和圖3)。

表2 56 ℃和70 ℃條件下SFTSV病毒滴度變化

注：60 min、120 min和180 min代表病毒原液在金屬浴中的處理時(shí)間；101～103代表經(jīng)過(guò)預(yù)處理的病毒原液分別稀釋10倍、102倍和103倍后觀察到的熒光圖。

注：5 min和10 min代表病毒原液在金屬浴中的處理時(shí)間；101代表經(jīng)過(guò)預(yù)處理的病毒原液稀釋10倍后觀察到的熒光圖。

3 討 論

本研究以CCID50為107.25/100 μL SFTSV實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株JS2011-013-1為對(duì)象，探索SFTSV隨溫度升高病毒滴度的變化規(guī)律。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含有SFTSV的細(xì)胞培養(yǎng)上清液在冷藏(4 ℃)和室溫(25 ℃)條件下存放72 h后，病毒滴度僅輕微下降。既往研究發(fā)現(xiàn)SFTSV在4 ℃條件下放置144 h，其病毒滴度僅下降約10倍[8]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在37 ℃和39 ℃條件下，隨時(shí)間延長(zhǎng)，病毒滴度下降速率明顯高于4 ℃和25 ℃，但存活時(shí)間仍較長(zhǎng)，在39 ℃下放置72 h，病毒才失去感染性。這提示SFTSV離開(kāi)宿主進(jìn)入外環(huán)境后，仍可長(zhǎng)時(shí)間存活并具有感染性，該特性為其自然傳播提供了有利條件。SFTSV可通過(guò)接觸患者血液和血性分泌物傳播，甚至有研究者在感染SFTSV 12 d的雪貂體液(如尿液、唾液等)標(biāo)本中檢測(cè)到SFTSV[9-10]。另外，有醫(yī)務(wù)人員在佩戴防流感口罩和手套的防護(hù)條件下為確診患者氣管插管后感染SFTSV[11]，提示一般防護(hù)措施并不能完全抵抗SFTSV對(duì)機(jī)體的侵襲。上述氣溶膠感染案例可能是由于體內(nèi)病毒載量較高的危重癥患者會(huì)釋放出具有感染性的小粒徑氣溶膠病毒顆粒[9, 11-12]，從而造成周圍人員的感染。因此，應(yīng)重視對(duì)接觸過(guò)SFTSV的物品、SFTS患者體液沾染的物品及SFTS患者起居室的消毒。醫(yī)務(wù)人員在接觸危重癥患者時(shí)，還需額外的預(yù)防氣溶膠傳播的措施，如佩戴N95口罩等。

根據(jù)既往研究[13]，除了56 ℃，我們還探究了70 ℃ 條件下SFTSV病毒滴度的變化。SFTSV在70 ℃放置5 min，病毒即被滅活；56 ℃作用180 min，病毒才失去感染性。并且本實(shí)驗(yàn)中所用病毒株為實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)株JS2011-013-1，病毒存在的環(huán)境為DMEM維持液，與離體體液中的病毒相比，其成分更簡(jiǎn)單，對(duì)病毒的保護(hù)作用更弱，溫度對(duì)其作用可能更強(qiáng)。所以在對(duì)SFTS患者離體體液進(jìn)行熱滅活時(shí)，需要適當(dāng)提高作用溫度或延長(zhǎng)處理時(shí)間，確保SFTSV被完全滅活。此外，外界環(huán)境中存在的介質(zhì)較多，SFTSV存活時(shí)間可能相對(duì)更長(zhǎng)。因此，對(duì)于SFTS高發(fā)地區(qū)的居民，應(yīng)加強(qiáng)自我保護(hù)與消毒方法的宣傳教育，當(dāng)身邊有人出現(xiàn)發(fā)熱、胃腸道癥狀時(shí)，要避免接觸患者體液，同時(shí)不能忽視對(duì)患者所處環(huán)境及接觸過(guò)物品的消毒。

綜上所述，研究者對(duì)病毒進(jìn)行熱滅活時(shí)，至少要70 ℃加熱 5 min以上，避免病毒滅活不完全，出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室及醫(yī)院內(nèi)傳播事件。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：韋雪敏，李書(shū)晗，王耀，等.發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒溫度敏感性研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(1)：25-28.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.176