溫陽(yáng)通脈顆粒對(duì)糖尿病模型大鼠血管內(nèi)皮功能的影響*

張荔，孫付軍，侯立靜，盛國(guó)良，黃德紅，李貴海

（1.湖北省襄陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng) 441000；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東省煙臺(tái)業(yè)達(dá)醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 265602）

動(dòng)脈粥樣硬化為糖尿病常見并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅人類的生命健康［1］。內(nèi)皮細(xì)胞障礙致使單核細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，同時(shí)使動(dòng)脈壁纖維化，在動(dòng)脈內(nèi)壁上形成硬化斑塊［2-4］。血漿內(nèi)皮素（ET）使血管收縮，一氧化氮（NO）使血管松弛，病理狀態(tài)下的ET 水平升高和NO 水平降低是內(nèi)皮損傷的標(biāo)志。高含量的低密度脂蛋白（LDL）和低含量的高密度脂蛋白（HDL）協(xié)同誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化［5-6］。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是血管炎性反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞增殖的重要刺激因素，與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體VEGF 受體（VEGFR）結(jié)合后能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與分化［7］。前期體外試驗(yàn)已證實(shí)，溫陽(yáng)通脈方及其組分對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）氧化損傷具有保護(hù)作用［8-11］。本研究將從體內(nèi)試驗(yàn)角度探討其作用及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：ME204E 型電子天平、xMark 型分光光度計(jì)（梅特勒-托利多<中國(guó)>有限公司）；ReaderM 型生化儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；IX73 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；A1301049 型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）。

試藥：羥苯磺酸鈣膠囊（西安利君制藥公司，批號(hào)為1205095）；溫陽(yáng)通脈顆粒由山東省中醫(yī)藥研究院生化室制備。

動(dòng)物：SPF 級(jí)Wistar 大鼠120只，均為雄性，體質(zhì)量200～250 g，由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（魯）20090001，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（魯）20050052。所有大鼠均于溫度為20～25 ℃、相對(duì)濕度為50%～70%、晝夜各半循環(huán)照明的環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 方法

建模、分組與給藥：120 只大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，取10 只大鼠作為空白組，給予普通飼料喂養(yǎng)；另取110只大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料［基礎(chǔ)飼料66.5%（面粉20%、米粉10%、玉米20%、麩皮25%、豆粉20%、骨粉魚粉2%），蔗糖20%，豬油10%，膽固醇2.5%，膽汁酸鈉1%］1 個(gè)月，按體質(zhì)量腹腔注射鏈尿佐菌素溶液50 mg/kg，繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)72 h，禁食8 h后斷尾，測(cè)定大鼠空腹血糖，>11.1 mol/L 即為建模成功。除空白組大鼠外，將建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組，羥苯磺酸鈣組（0.135 g/kg），溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組（5.000，2.500，1.250 g/ kg），各10 只。羥苯磺酸鈣組和溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組大鼠分別灌胃相應(yīng)藥物，空白組和模型組大鼠均灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)30 d。

指標(biāo)測(cè)定：大鼠頸外靜脈采血，分離血清，測(cè)定血糖及血清ET，NO，LDL，HDL 和三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、糖化血紅蛋白（HbA1C）水平。取血后處死大鼠，分離主動(dòng)脈，進(jìn)行免疫組化檢查，觀察大鼠VEGF 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞面密度，并計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。其中，陽(yáng)性細(xì)胞面密度=陽(yáng)性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計(jì)場(chǎng)總面積。免疫組化選擇陽(yáng)性細(xì)胞較集中的區(qū)域，采集3 個(gè)光鏡視野，輸入到HPIAS -1000 型高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)內(nèi)，在相同背底倍體條件下選擇相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)完全定量分析，軟件包由武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以表示，行t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 給藥前大鼠體質(zhì)量和血糖比較

與空白組比較，給藥前模型組大鼠體質(zhì)量均顯著減輕，血糖均顯著升高（P<0.05）；羥苯磺酸鈣組和溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組大鼠的體質(zhì)量和血糖與模型組比較均無顯著差異（P>0.05），提示造模成功。詳見表1。

表1 給藥前大鼠體質(zhì)量和血糖比較（，n=10）Tab.1 Comparison of the body mass and blood glucose of rats before the administration（，n=10）

表1 給藥前大鼠體質(zhì)量和血糖比較（，n=10）Tab.1 Comparison of the body mass and blood glucose of rats before the administration（，n=10）

注：與空白組比較，*P <0.05。表2同。Note：Compared with those in the blank group，*P <0.05（for Tab.1-2）.

2.2 對(duì)大鼠糖代謝的影響

與空白組比較，模型組大鼠的血糖和血清HbA1C水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組和溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組大鼠的血糖和血清HbA1C水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表2。

2.3 對(duì)大鼠脂代謝的影響

與空白組比較，模型組大鼠的血清TG，TC，LDL 水平均顯著升高，HDL 水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組大鼠的血清TG，TC，LDL 水平均顯著降低，羥苯磺酸鈣組和溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組大鼠的血清HDL 水平均顯著升高（P<0.05）。詳見表2。

2.4 對(duì)大鼠血清NO 和ET 的影響

與空白組比較，模型組大鼠的血清NO 水平顯著降低，ET 水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組和溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組大鼠血清NO水平均顯著升高，ET水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表2。

2.5 對(duì)大鼠VEGF 表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，羥苯磺酸鈣組和溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組大鼠VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率均顯著降低（P<0.05）；各組間陽(yáng)性細(xì)胞面密度比較無顯著差異（P>0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠觀察指標(biāo)比較（，n=10）Tab.2 Comparison of observation indexes of rats in each group（，n=10）

表2 各組大鼠觀察指標(biāo)比較（，n=10）Tab.2 Comparison of observation indexes of rats in each group（，n=10）

注：與模型組比較，△P <0.05。Note：Compared with those in the model group，△P <0.05.

3 討論

《中國(guó)2型糖尿病防治指南（2020年版）》指出，中醫(yī)藥在糖尿病防治中有重要意義［12］。糖尿病在中醫(yī)學(xué)屬“消渴”范疇，以“益氣、養(yǎng)陰、清熱”為常見治則。溫陽(yáng)通脈顆粒由黃芪、淫羊藿、三七、黃連、紅花、川芎等中藥材組方，方中主要藥物的有效成分黃芪甲苷、三七皂苷、淫羊藿苷對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用［8-11］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)疏》記載，黃芪“氣旺生津止渴”，具有補(bǔ)氣功效，其主成分能有效降低血糖［13］?！侗静菥V目》記載，黃連“治消渴，用酒蒸黃連”，為降糖圣藥，具有清熱瀉火功效，黃連堿能顯著下調(diào)半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）的表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷［14-15］。川芎的主要有效成分能改善糖尿病模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)［16］。黃芪注射液聯(lián)合三七總皂苷可調(diào)節(jié)血栓素A2/前列腺素I2（TXA2/PGI2）和組織型纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制物-1（t -PA/ PAI -1）的平衡，而減輕血瘀證［17］。三七總皂苷和淫羊藿苷對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的衰老具有保護(hù)作用，可能與調(diào)節(jié)SIRT3信號(hào)通路和減輕氧化應(yīng)激有關(guān)［18］。三七-紅花復(fù)方通過抗炎和抗凋亡發(fā)揮對(duì)心肌梗死模型大鼠的保護(hù)作用［19］。

研究表明，糖尿病血管內(nèi)皮功能障礙主要由氧化應(yīng)激與炎癥引起，源于NO 生成和激活障礙。NO 能激活鳥苷酸環(huán)化酶，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)鳥苷-3'，5-磷酸介導(dǎo)NO的生物作用，如控制血管張力等［20-21］。ET為一種活性多肽，具有強(qiáng)烈的收縮血管作用，其受體存在于冠狀動(dòng)脈和心肌細(xì)胞中，可導(dǎo)致心肌缺血，其與NO 共同調(diào)節(jié)血管張力，一旦平衡被破壞就會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)自由基濃度升高，引發(fā)糖尿病并發(fā)癥［22-23］。VEGF 為目前已知特異性最高的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可加速內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶生成NO，加速內(nèi)皮損傷［24-26］。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，溫陽(yáng)通脈顆粒高、中、低劑量組大鼠的血糖和血清HbA1C，TG，TC，LDL，ET 水平及VEGF 陽(yáng)性表達(dá)率均顯著降低，血清HDL 和NO 水平均顯著升高（P<0.05）；各組間陽(yáng)性細(xì)胞面密度比較均無顯著差異（P>0.05）。表明溫陽(yáng)通脈顆粒能改善糖尿病模型大鼠的血脂和血糖水平，保護(hù)血管內(nèi)皮功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NO 和ET 的釋放平衡、抑制VEGF的表達(dá)有關(guān)。