組蛋白甲基化酶G9a在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中的表達(dá)及臨床意義*

劉靜 梁蓉 高廣勛 董麗華 王健紅 李玉富

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL）是成人最常見的淋巴系統(tǒng)腫瘤，約占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%[1]。由于其高度異質(zhì)性，分子遺傳學(xué)特點(diǎn)和生物學(xué)行為有著很大的差別，不同亞型DLBCL治療反應(yīng)和預(yù)后呈現(xiàn)顯著性差異。盡管目前小分子靶向藥物、單克隆抗體、細(xì)胞免疫治療等一系列新的治療方法顯著提高了其治療反應(yīng)率,但仍有部分患者面臨復(fù)發(fā)難治性的問(wèn)題[2]，完善預(yù)后分層、制定精準(zhǔn)的治療方案十分重要。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和非編碼RNA調(diào)控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到關(guān)注[3]。其中組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（ histone methyltransferases，HMTts ）是一類以S-腺苷甲硫（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，催化1～3個(gè)甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到組蛋白賴氨酸或精氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移酶，G9a是組蛋白H3第9位賴氨酸（H3K9）的甲基轉(zhuǎn)移酶，能使H3K9發(fā)生甲基化，并參與到DNA甲基化、基因轉(zhuǎn)錄抑制、異染色質(zhì)形成等過(guò)程[4-5]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。G9a在多種腫瘤中表達(dá)異常增高，如胃癌、膀胱癌、乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤等，并與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)功能有關(guān)[6-8]。目前，組蛋白甲基化酶G9a在DLBCL臨床意義的研究未見報(bào)道。本研究旨在探討G9a在DLBCL中的表達(dá)情況，分析其在DLBCL臨床診療中的價(jià)值，為尋找新的預(yù)后及治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2014年6月至2019年6月經(jīng)淋巴結(jié)活檢后確診的初治DLBCL患者資料，入組的病例需要符合下述條件：1）術(shù)后的病理標(biāo)本及資料保存完整；2）病例基本信息、診治和隨訪資料完整；3）患者病理標(biāo)本獲取前未行任何抗腫瘤治療且不合并其他惡性腫瘤。本研究共收集75例DLBCL組織標(biāo)本，同時(shí)收集25例初診為淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織標(biāo)本作為對(duì)照組。病理分型按Hans分類法進(jìn)行；臨床分期參照臨床分期進(jìn)行；預(yù)后評(píng)分參照國(guó)際預(yù)后指數(shù)（IPI）評(píng)分。

1.2 方法

1.2.1 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)G9a在組織中的表達(dá)情況 采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DLBCL組織及淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中G9a蛋白的表達(dá)，兔抗人G9a單克隆抗體（購(gòu)自英國(guó)Abcam公司）。將石蠟切片在二甲苯中脫蠟，梯度乙醇水化；用配制好的修復(fù)液（EDTA緩沖液，Ph為9.0）修復(fù)抗原；然后用3%過(guò)氧化氫處理，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；滴加稀釋好的山羊血清封閉抗原。將切片與兔抗人G9a單抗（稀釋比1∶100）在4℃以下反應(yīng)過(guò)夜，添加山羊抗兔二抗在37℃以下孵育30 min，滴加DAB顯色液于每張切片上染色，Harris蘇木精對(duì)比染色，最后進(jìn)行脫水與封固。在顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中有棕黃色或棕褐色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞，高倍鏡下觀察染色強(qiáng)度并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例。采用半定量[9]積分法判斷結(jié)果。按染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分，淡棕色為1分，棕黃為2分，棕褐色為3分；按陽(yáng)性染色細(xì)胞百分率計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為0 分，10%～30%為1分，30%～50%為2分，50%～70%為3分，＞70%為4分。將（染色強(qiáng)度～積分）乘以染色細(xì)胞百分率積分的結(jié)果分為下述等級(jí)：＜2分為陰性（-），≥2分為陽(yáng)性（+）。

1.2.2 治療及療效評(píng)價(jià) 患者接受的化療方案包括：CHOP、R-CHOP、R-mini CHOP、EPOCH、R-EPOCH和DHAP方案，部分難治患者或復(fù)發(fā)患者接受放療及造血干細(xì)胞移植治療。療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2016年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN）推薦的淋巴瘤療效標(biāo)準(zhǔn)，每2個(gè)周期進(jìn)行1次療效評(píng)估，療效評(píng)價(jià)包括完全緩解（complete response，CR）：所有疾病的證據(jù)消失；部分緩解（partial response，PR）：測(cè)量的病變消退并且無(wú)新發(fā)病灶、疾病進(jìn)展（progressive disease，PD）：任何新發(fā)病灶或病灶較最低水平增長(zhǎng)≥50%，疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）：未能達(dá)到CR、PR或PD。采用CR、總生存（overall survival，OS）率、無(wú)進(jìn)展期生存（progression-free survival，PFS）率，探討其對(duì)患者生存及預(yù)后的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析G9a蛋白在DLBCL組織與淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織之間表達(dá)差異，分析G9a蛋白表達(dá)情況與DLBCL臨床特點(diǎn)之間的關(guān)系；預(yù)后單因素分析采用Kaplan-Meier法，多因素分析采用Cox回歸模型。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLBCL組織和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中G9a蛋白的表達(dá)

G9a蛋白主要在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在DLBCL組織和淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織中有著不同的表達(dá)程度。75例DLBCL中49例（65.3%）呈G9a蛋白陽(yáng)性表達(dá)，25例正常淋巴組織中有5例（20.0%）G9a陽(yáng)性表達(dá)，G9a在DLBCL中表達(dá)較正常淋巴組織明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14.483，P＜0.001，表1，圖1）。

表1 G9a蛋白在淋巴結(jié)反應(yīng)性增生組織和DLBCL組織中的表達(dá)

2.2 G9a蛋白表達(dá)與DLBCL患者臨床特征的關(guān)系

G9a 蛋白陽(yáng)性與 G9a 蛋白陰性患者在性別、年齡、B 癥狀、LDH 水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），而 G9a 蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者的β2-MG的值，臨床分期，Ki-67 值均較 G9a 蛋白表達(dá)陰性患者更高，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.041、0.019和0.044，表2）。

表2 G9a蛋白表達(dá)與DLBCL患者臨床特征的關(guān)系

2.3 G9a蛋白表達(dá)與初治療效的關(guān)系

G9a蛋白陽(yáng)性組的49例患者中在初始治療后達(dá)CR的患者有29例（59.2%），未達(dá)CR有20例（40.8%），G9a蛋白陰性組的26例患者中達(dá)CR的患者有18例（69.2%），未達(dá)CR有8例（30.8%）。G9a蛋白陽(yáng)性組與陰性組在初始治療后CR方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.423，P=0.233，P＞0.05，表3），表明G9a蛋白表達(dá)與初始治療后的療效無(wú)關(guān)。

表3 G9a蛋白表達(dá)與DLBCL初始治療后療效的關(guān)系

2.4 G9a蛋白表達(dá)與病理細(xì)胞起源的關(guān)系

75例患者中，GCB組46例，其中G9a陽(yáng)性26例，G9a陰性20例，Non-GCB組29例，G9a陽(yáng)性患者23例，G9a陰性6例，Non-GCB 的G9a表達(dá)率高于GCB組（79.3%vs.56.5%），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023，P＜0.05）。將不同分子亞型DLBCL納入OS分析，GCB組3年OS率為87.6%，Non-GCB組3年OS為77.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.237，P=0.049，P＜0.05，表4，圖2）。提示G9a蛋白在Non-GCB型DLBCL中表達(dá)較高，且Non-GCB型與GCB型相比預(yù)后更差，生存率更低。

表4 G9a蛋白表達(dá)與病理類型的關(guān)系

2.5 G9a蛋白表達(dá)與DLBCL預(yù)后的關(guān)系

2.5.1 單因素分析 隨訪截至2020年12月，75例DLBCL患者共獲得完整資料74例， 隨訪率為98.6%。74例DLBCL中至隨訪結(jié)束共生存55例，OS為74.3%，無(wú)進(jìn)展生存共47例，PFS率為63.5%。將74例完整病例納入生存分析，將年齡、性別、臨床分期、B癥狀、病理類型、LDH水平、β2-MG、IPI評(píng)分、是否CR、G9a表達(dá)情況、納入影響患者OS、PFS的單因素分析中，結(jié)果顯示（表5，圖3，4）：G9a蛋白陰性組和陽(yáng)性組的3年OS率分別為89.5%和73.4%，且兩組OS率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.815，P＜0.05），G9a蛋白陰性組和陽(yáng)性組的3年P(guān)FS分別為79.3%和59.4%，兩組PFS率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.211，P＜0.05），表明G9a表達(dá)陽(yáng)性、Ⅲ/Ⅳ分期、Non-GCB、IPI 3～5分、初始治療未達(dá)到CR是DLBCL的不良預(yù)后因素。

2.5.2 多因素分析 由表5可見，分期、病理類型、IPI評(píng)分、G9a表達(dá)陽(yáng)性是DLBCL患者3年OS的影響因素，將其納入多因素Cox回歸分析，見表6：G9a并非DLBCL患者OS率的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.381,P＞0.05）。臨床分期、IPI評(píng)分、G9a表達(dá)陽(yáng)性、初治是否CR為DLBCL患者3年P(guān)FS率的影響因素，將其納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果見表7：初治CR是影響DLBCL患者3年P(guān)FS的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.010,P＜0.05），而G9a并非DLBCL患者3年P(guān)FS率的獨(dú)立預(yù)后因素（P=0.987,P＞0.05）。

表5 影響DLBCL患者OS和PFS的單因素分析

表6 影響DLBCL患者OS的多因素分析

表7 影響DLBCL患者PFS的多因素分析

3 討論

DLBCL是最常見的非霍奇金淋巴瘤，隨著國(guó)內(nèi)人口老齡化的發(fā)展，DLBCL作為一種主要發(fā)生于中老年人群的血液系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率也越來(lái)越高[1，10]。隨著精準(zhǔn)治療時(shí)代的到來(lái)，傳統(tǒng)的化學(xué)療法及評(píng)分體系受到挑戰(zhàn)，建立包括臨床因素和分子特征的新型預(yù)后分層模式和治療策略已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。在過(guò)去的幾年中，基因測(cè)序和基因組分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了DLBCL重要的遺傳損傷，揭示了一些與疾病相關(guān)的的基因與途徑的參與，其中一些（如NF-κB、BCR和BCL-6）已被用作臨床實(shí)踐中[2]，而一些表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物如EZH2、G9a被認(rèn)為是很有希望的潛在靶點(diǎn)。EZH2可對(duì)組蛋白H3第27位賴氨酸進(jìn)行三甲基化，參與基因表達(dá)的調(diào)控[11]，已有報(bào)道在2l%以上的GCB型DLBCL中發(fā)生了EZH2的功能增益突變，EZH2的抑制可使生發(fā)中心B細(xì)胞停止生長(zhǎng)分化，也可導(dǎo)致相關(guān)抑癌基因（如PRC2調(diào)控的基因）的表達(dá)上調(diào)。因此，EZH2抑制劑或可成為治療生發(fā)中心來(lái)源的DLBCL的新靶點(diǎn)[12-13]。

G9a是組蛋白H3第9位賴氨酸（H3K9）的甲基轉(zhuǎn)移酶，能使H3K9發(fā)生甲基化，并參與到DNA甲基化、基因轉(zhuǎn)錄抑制、異染色質(zhì)的形成等過(guò)程[3-4]，而這些在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中都有著重要作用，針對(duì)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a的抑制劑也正在開發(fā)中。G9a在許多癌癥如乳腺癌，膀胱癌中過(guò)表達(dá)，G9a的高表達(dá)可以激活下游上皮細(xì)胞黏附分子（Ep-CAM）從而引起腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。據(jù)報(bào)道G9a在ALL中也存在過(guò)表達(dá)，該研究發(fā)現(xiàn)G9a抑制劑以劑量依賴的方式降低人T淋巴母細(xì)胞（Jurkat細(xì)胞）的生存能力，并伴有P53，TP73，BAX和MDM4表達(dá)的增加，抑制G9a可誘導(dǎo)ALL中促凋亡基因的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞死亡[15]。G9a在肝癌患者中的表達(dá)明顯高于正常人肝組織，敲除細(xì)胞中G9a基因后，瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，侵襲性減弱[16]；G9a在乳腺癌組織中表達(dá)增加，其調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的途徑之一是調(diào)控MSK1的激活和表達(dá)[17]。另外腫瘤細(xì)胞代謝有一個(gè)必需通路：絲氨酸-甘氨酸生物合成通路，而G9a是維持這條通路處于活性狀態(tài)的酶基因, 也是在此通路應(yīng)答絲氨酸缺乏時(shí)轉(zhuǎn)錄激活所必需的，這也暗示G9a可能參與原癌基因或抑癌基因在胚胎發(fā)育中的調(diào)控表達(dá)，其通過(guò)增加絲氨酸的產(chǎn)出來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化潛能；若G9a失活, 絲氨酸及它的下游代謝產(chǎn)物就相應(yīng)減少, 引發(fā)腫瘤細(xì)胞自噬死亡[18]。更重要的是，G9a在細(xì)胞分裂過(guò)程中與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1進(jìn)行物理相互作用，以協(xié)調(diào)DNA和組蛋白的甲基化，從而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默[19]。從這個(gè)意義上講，抑制G9a的功能，不僅降低組蛋白甲基化水平，也會(huì)在一定程度上降低DNA甲基化水平從而導(dǎo)致抑癌基因的重新激活并抑制癌細(xì)胞的增殖。上述研究均提示，抑制G9a表達(dá)可降低癌細(xì)胞增殖，阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移并延緩疾病進(jìn)展。

最新的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[20]結(jié)果示：G9a 抑制劑 BIX-01294 對(duì)人 DLBCL 細(xì)胞系的增殖有明顯抑制作用，而對(duì)正常人外周血單核細(xì)胞系抑制效果不明顯， 表明G9a 抑制劑對(duì) DLBCL 有相對(duì)特異的抑制作用。該研究還揭示了其抑制 DLBCL 增殖的途徑：1）G9a抑制劑可以增加P21表達(dá)水平和降低細(xì)胞周期蛋白E水平導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期停滯，引起DLBCL細(xì)胞發(fā)育障礙；2）其通過(guò)內(nèi)源性和外源性凋亡途徑誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞凋亡；3）其還通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激觸發(fā)人類DLBCL細(xì)胞中的自噬凋亡。這些研究均提示G9a蛋白在DLBCL細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)G9a蛋白表達(dá)陽(yáng)性DLBCL患者的β2-MG，臨床分期，Ki-67水平均較G9a蛋白表達(dá)陰性患者更高，提示G9a可能與DLBCL的增殖和進(jìn)展有關(guān)，此外G9a蛋白還是影響初治DLBCL患者3年OS和3年P(guān)FS的不良預(yù)后因素。

本研究首次發(fā)現(xiàn)與淋巴結(jié)炎性增生組織相比，組蛋白甲基化酶G9a 蛋白在DLBCL中表達(dá)明顯增加；并進(jìn)一步揭示了G9a的表達(dá)與DLBCL的臨床特征、療效及預(yù)后有一定的關(guān)系，但仍需要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。后續(xù)應(yīng)開展G9a在DLBCL作用機(jī)制的深入研究，進(jìn)一步探討G9a在DLBCL發(fā)生發(fā)展中的意義。