溫脾湯對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜屏障功能保護(hù)作用及其機(jī)制研究

黃建華，黃光輝，黃 河

（廣東省清遠(yuǎn)市中醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

膿毒癥并發(fā)癥多，病死率可達(dá)30%～70%，臨床救治困難[1]。腸道被認(rèn)為是膿毒癥誘發(fā)多器官功能障礙的啟動(dòng)器官，其中保護(hù)腸道屏障功能是膿毒癥治療的重要途徑[2]。本課題組臨床觀察發(fā)現(xiàn)溫脾湯對(duì)膿毒癥，尤其是腸道功能障礙有較好的治療作用，但具體機(jī)制尚未闡明。本課題組探究溫脾湯對(duì)膿毒癥大鼠的腸道屏障功能的保護(hù)作用及其機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇S P F級(jí)雄性S D大鼠5 0只，質(zhì)量（200g±20）g，由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22～26℃，相對(duì)濕度 40%～70%RH。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

溫脾湯（大黃12g，茯苓15g，人參10g，當(dāng)歸10g，制附子10g，白術(shù)10g，枳殼10g，干姜9g，芒硝3g，炙甘草6g，每劑煎至100mL，1.03g/mL），由清遠(yuǎn)市中醫(yī)院制劑室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備

膿毒癥動(dòng)物模型建立采用國(guó)際公認(rèn)的鼠類盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）膿毒癥模型。 假手術(shù)組：剖腹后只在盲腸根部穿入絲線，不行結(jié)扎和穿孔。

1.2.2 分組與給藥

將大鼠稱重后按阿拉伯?dāng)?shù)字編號(hào)，按隨機(jī)原則平均分為5組：模型組（n=10，1號(hào)-10號(hào)）、假手術(shù)組（n=10，11號(hào)-20號(hào)）、中藥高劑量組（n=10，21號(hào)-30號(hào)）、中藥中劑量組（n=10，31號(hào)-40號(hào)）、中藥低劑量組（n=10，41號(hào)-50號(hào)）。藥物劑量以成人用藥劑量按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體型系數(shù)換算法計(jì)算，參照陳奇主編的《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，得溫脾湯5.3g/（kg·d），設(shè)為低劑量組，而中劑量和高劑量分別為低劑量的2倍和4倍，即10.6g/（kg·d）和21.2g/（kg·d）。中藥治療組造模后每劑藥按相應(yīng)劑量中藥均加生理鹽水稀釋至9mL，分3等份，分別于術(shù)后 3h、11h、19h、27h、35h、43h（q8h）灌胃，其余均同時(shí)以等量生理鹽水干預(yù)，在制模后 24h 處死各組編號(hào)前5只大鼠、制模48h處死各組剩余大鼠，處死后立即取相應(yīng)血液及組織標(biāo)本。

1.3 觀察指標(biāo)

利用采血針連接真空采血管從大鼠腹主動(dòng)脈取血3～4mL，室內(nèi)常溫下放置1h后，在4℃條件下離心處理（3000r/min），將血清放置在冰箱（-20℃）中待用。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）分析法測(cè)定血清D-乳酸、IL-17水平。

取完血后處死大鼠并在無(wú)菌條件下迅速開(kāi)胸收集實(shí)驗(yàn)所需各組織。在距回盲瓣2～3cm處截取約5cm的小腸組織，用生理鹽水充分沖洗，確保腸內(nèi)黏液及糞便沖洗干凈后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗液再次洗滌，并剔除位于腸壁的淋巴結(jié)，沖洗洗滌3次后，沖洗干凈后，觀察腸管外觀及漿膜形態(tài)，用手術(shù)剪將回腸組織剪分為3份，分別用于光鏡下觀察回腸組織形態(tài)學(xué)變化，以及ELISA分析法檢測(cè)腸道上皮細(xì)胞sIgA蛋白表達(dá)。

切開(kāi)幼鼠腹腔，取結(jié)腸內(nèi)容物立存于80℃冰箱保存?zhèn)溆靡詸z測(cè)幼鼠腸道菌群的變化。采集并準(zhǔn)確稱量肝、腸系膜淋巴結(jié)各1g，檢測(cè)大鼠腸道細(xì)菌移位率。

即刻分離出脾組織，取綠豆大小脾臟放入PBS中，以備流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Treg、Th17細(xì)胞；整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0版統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（±s）表示；兩組數(shù)據(jù)間比較用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)間用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組血清D-乳酸、IL-17水平比較

相較于假手術(shù)組，模型組血清D-乳酸、IL-17水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示試驗(yàn)造模成功。相較于模型組，中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組血清D-乳酸、IL-17水平均更低，且隨著劑量的增加，水平越低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明溫脾湯對(duì)大鼠血清D-乳酸、IL-17水平有一定的影響。見(jiàn)表1。

表1 3組血清D-乳酸、IL-17水平比較 （±s）

表1 3組血清D-乳酸、IL-17水平比較 （±s）

組別 鼠數(shù) D-乳酸（mmol/L） IL-17（ng/L）假手術(shù)組 10 3.12±0.71 691.23±45.81模型組 10 2.80±0.62 612.75±41.06中藥低劑量組 10 2.03±0.54 452.38±37.94中藥中劑量組 10 1.76±0.48 425.68±35.42中藥高劑量組 10 1.51±0.40 410.85±32.04 F 112.680 62.304 P 0.000 0.000

2.2 各組s Ig A蛋白表達(dá)比較

相較于模型組，各組s Ig A蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但各用藥組均有所降低，提示溫脾湯能在一定程度上調(diào)節(jié)大鼠的免疫球蛋白水平，減輕機(jī)體免疫反應(yīng)。見(jiàn)表2。

表2 3組ZO-1蛋白和s Ig A蛋白表達(dá)的比較 （ug/mL，±s）

表2 3組ZO-1蛋白和s Ig A蛋白表達(dá)的比較 （ug/mL，±s）

組別 鼠數(shù) IgA IgM IgG假手術(shù)組 10 11.21±2.36 7.52±1.36 8.52±1.69模型組 10 11.57±2.38 6.97±1.32 7.42±1.38中藥低劑量組 10 11.34±2.37 7.04±1.33 7.23±1.35中藥中劑量組 10 11.06±2.32 6.89±1.31 7.10±1.34中藥高劑量組 10 10.98±2.30 6.74±1.30 7.02±1.33 F 0.645 0.720 0.583 P 0.142 0.285 0.347

2.3 各組Treg和Th17細(xì)胞含量比較

相較于模型組，中藥低、中、高劑量組Treg和Th17細(xì)胞含量均更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且中藥低、中、高劑量組之間呈明顯上升趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

表3 3組Treg和Th17細(xì)胞含量的比較 （%，±s）

表3 3組Treg和Th17細(xì)胞含量的比較 （%，±s）

組別 鼠數(shù) Treg（%） Th17（%）假手術(shù)組 10 4.02±0.32 1.76±0.34模型組 10 4.87±0.39 2.03±0.40中藥低劑量組 10 5.24±0.47 2.85±0.49中藥中劑量組 10 5.86±0.53 3.76±0.53中藥高劑量組 10 5.97±0.56 4.41±0.60 F 42.517 63.290 P 0.000 0.000

3 討 論

膿毒癥Sepsis是指宿主對(duì)感染產(chǎn)生的失控反應(yīng)并出現(xiàn)危及生命器官功能障礙的臨床綜合征，并發(fā)癥多，病死率高達(dá)30%～70%，ICU住院時(shí)間長(zhǎng)，花費(fèi)高[3]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，炎性反應(yīng)致炎癥因子增加，腸道內(nèi)環(huán)境平衡紊亂，腸上皮細(xì)胞凋亡增多，腸道黏膜屏障受到破壞，腸黏膜通透性發(fā)生改變，致使腸道菌群失調(diào)，內(nèi)毒素入血，免疫系統(tǒng)失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，危及患者生命[4]。腸道被認(rèn)為是誘發(fā)多器官功能障礙的啟動(dòng)器官，其中腸道屏障，包括機(jī)械屏障、生物屏障與免疫屏障，在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[5]。

溫脾湯出至唐《千金備急方》，主治脾陽(yáng)不足、陰寒內(nèi)盛、寒積中阻證，是溫下劑的代表方。全方不僅能溫補(bǔ)脾陽(yáng)，而且能除瘀血、滌蕩積滯、調(diào)理氣機(jī)，標(biāo)本兼顧，攻補(bǔ)兼施，使邪去而正易復(fù)，直切膿毒癥胃腸功能障礙病機(jī)所在。既往研究證實(shí)，溫脾湯對(duì)膿毒癥，尤其是腸道功能障礙有較好的治療作用，但具體機(jī)制尚未闡明[6-8]。本研究結(jié)果顯示，溫脾湯對(duì)大鼠腸黏膜屏障功能可起保護(hù)作用，其中血清炎癥因子的水平經(jīng)干預(yù)后明顯下降，提示溫脾湯對(duì)大鼠血清D-乳酸、IL-17的表達(dá)可起到抑制作用；對(duì)免疫系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)溫脾湯干預(yù)后，Treg和Th17細(xì)胞含量明顯上升，而各免疫球蛋白盡管無(wú)明顯變化，但各用藥組均有所降低，提示溫脾湯能在一定程度上調(diào)節(jié)大鼠的免疫球蛋白水平，減輕機(jī)體免疫反應(yīng)。

綜上所述，溫脾湯對(duì)膿毒癥大鼠腸黏膜屏障可起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子表達(dá)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)有關(guān)。