基于PI3K/Akt信號通路探討益氣溫陽活血方對老年腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松患者骨代謝的影響

張 斌，秦 永，范道波，李中連，馮冬前，劉 立，李蘭亞，葛大偉

1 沭陽縣中醫(yī)院骨傷科，江蘇 沭陽 223600；2 南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院骨科

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨骼脆性增加為特征的全身性骨病，會引起骨痛及增加壓縮性骨折風(fēng)險，需要積極治療。西醫(yī)治療骨質(zhì)疏松的藥物包括鈣劑、活性維生素D、雙磷酸鹽藥物等，補(bǔ)充鈣劑及活性維生素D為基礎(chǔ)治療，雙磷酸鹽藥物是抗骨質(zhì)疏松治療，其療效受服藥依從性影響較大，部分患者因無法堅(jiān)持規(guī)律服藥而影響治療效果。現(xiàn)代分子生物學(xué)研究認(rèn)為，PI3K/Akt信號通路是重要的促增殖及促分化通路，具有增強(qiáng)骨代謝的作用，該信號通路的抑制與骨質(zhì)疏松的發(fā)生密切相關(guān)［1］。

近年來中醫(yī)在骨質(zhì)疏松治療中的作用受到越來越多的關(guān)注，中醫(yī)認(rèn)為骨質(zhì)疏松為本虛標(biāo)實(shí)之證，臟腑虛損為本，瘀血外阻為標(biāo)。腎主骨，腎虛則骨髓無以養(yǎng)，臨床骨質(zhì)疏松多為腎虛血瘀證，治療應(yīng)以益氣溫陽活血為主［2-3］?；A(chǔ)研究表明［4-5］，益氣溫陽活血方對糖尿病腎病大鼠、心肌缺血再灌注大鼠PI3K/Akt信號通路具有激活作用?；诖?，本研究分析益氣溫陽活血方對老年腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松患者骨代謝及PI3K/Akt信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料將2017年6月至2019年6月于沭陽縣中醫(yī)院骨傷科就診的100例老年腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松患者隨機(jī)分為觀察組與對照組各50例。兩組患者基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者基線資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)1）符合《中國老年骨質(zhì)疏松診療指南》（2018）工作組擬定的《中國老年骨質(zhì)疏松診療指南（2018）》［6］中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)偏差（T值）≤-2.5SD；2）中醫(yī)辨證為腎虛血瘀證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)1）符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)及辨證分型；2）年齡≥60歲；3）自愿加入研究，簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)1）不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)及辨證分型；2）甲旁亢、自身免疫性疾病、多發(fā)性骨髓瘤等原因引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松者；3）合并骨結(jié)核、惡性腫瘤者；4）近3月使用過抗骨質(zhì)疏松藥物、激素、降鈣素者。

1.5 治療方法

1.5.1 對照組 口服碳酸鈣D3片（惠氏制藥有限公司；國藥準(zhǔn)字H10950029；規(guī)格：600 mg/片）每次600 mg，每日1次；口服阿法骨化醇軟膠囊[廣州白云山星群（藥業(yè)）股份有限公司；國藥準(zhǔn)字H20020501；規(guī)格：0.25μg/粒]每次0.5μg，每日1次。

1.5.2 觀察組 在對照組治療的基礎(chǔ)上加用具有益氣活血作用的[7]骨疏康顆粒劑（遼寧沃華康辰醫(yī)藥有限公司；國藥準(zhǔn)字Z20003255；規(guī)格：10 g/袋），主要成分為黃芪、淫羊藿、牡蠣、當(dāng)歸、川牛膝、桑寄生、補(bǔ)骨脂，每次10 g，每日2次。療程均為3個月。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 骨密度（bone mineral density，BMD）治療前及治療后采用雙能X線骨密度儀檢測腰椎正位腰2～4、左側(cè)股骨頸及Ward's三角區(qū)的BMD。

1.6.2 血清骨代謝指標(biāo) 治療前及治療后采集患者空腹外周靜脈血2～3 mL，靜置0.5 h凝血，離心半徑5 cm，3000 r/min離心10 min，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測I型膠原羧基端肽β特殊序列（β-terminal cross-linked telopeptides of typeⅠcollagen，β-CTX）及I型前膠原氨基端延長肽（propeptide of type I NT-procollagen，PINP）含量。

1.6.3 外周血PI3K/Akt 治療前及治療后采集空腹外周靜脈血1～2 mL，采用人全血單個核細(xì)胞分離液分離外周血中單個核細(xì)胞，加入RIPA裂解液后進(jìn)行超聲裂解、提取蛋白，蛋白樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h后放入1∶1000稀釋的磷酸化PI3K（phosphorylation PI3K，p-PI3K）、磷酸化AKT（phosphorylation AKT，p-AKT）抗體中，4℃孵育過夜；第二天，在1∶2000稀釋的二抗中室溫孵育1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計算蛋白表達(dá)水平。

1.6.4 不良事件 檢測患者血常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)、肝腎功能，記錄治療過程中的不良事件。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMD兩組患者治療后腰2～4、股骨頸及Ward's三角區(qū)BMD水平均高于治療前（P＜0.05），觀察組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者治療前后不同部位BMD（T值）比較（±s）

表2 兩組患者治療前后不同部位BMD（T值）比較（±s）

注：#表示治療前后組內(nèi)比較，P＜0.05；*表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別觀察組對照組例數(shù)50 50時間治療前治療后治療前治療后腰2～4-（2.65±0.54）-（1.89±0.33）#*-（2.72±0.61）-（2.23±0.41）#股骨頸-（2.58±0.59）-（1.82±0.28）#*-（2.66±0.65）-（2.19±0.33）#Ward's三角區(qū)-（2.71±0.48）-（2.03±0.36）#*-（2.68±0.59）-（2.30±0.45）#

2.2 血清骨代謝指標(biāo)兩組患者治療前后血清β-CTX、PINP含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；觀察組治療后血清β-CTX含量低于對照組，PINP含量高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者治療前后血清β-CTX與PINP含量（±s） ng/mL

表3 兩組患者治療前后血清β-CTX與PINP含量（±s） ng/mL

注：#表示治療前后組內(nèi)比較，P＜0.05；*表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別觀察組對照組例數(shù)50 50時間治療前治療后治療前治療后β-CTX 0.73±0.15 0.49±0.08#*0.79±0.18 0.61±0.10#PINP 56.58±9.95 81.63±12.46#*58.14±9.27 69.44±10.32#

2.3 外周血PI3K/AKT表達(dá)觀察組患者治療前后外周血p-PI3K及p-AKT蛋白表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），對照組患者治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），觀察組治療后外周血p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05）。見圖1、表4。

圖1 兩組患者治療前后外周血p-PI3K與p-AKT的蛋白條帶

表4 兩組患者治療前后外周血p-PI3K與p-AKT表達(dá)（±s）

表4 兩組患者治療前后外周血p-PI3K與p-AKT表達(dá)（±s）

注：#表示治療前后組內(nèi)比較，P＜0.05；*表示與對照組治療后比較，P＜0.05

組別觀察組對照組例數(shù)50 50時間治療前治療后治療前治療后p-PI3K 0.24±0.09 0.49±0.08#*0.28±0.07 0.25±0.04 p-AKT 0.38±0.07 0.76±0.20#*0.40±0.08 0.37±0.10

2.4 不良事件兩組患者治療期間無死亡病例，血常規(guī)、尿常規(guī)、糞常規(guī)、肝腎功能均在正常范圍。

3 討論

骨質(zhì)疏松屬中醫(yī)“骨痿”“骨枯”“骨痹”范疇，為本虛標(biāo)實(shí)之證，腎虛為本，血瘀為標(biāo)，腎虛血瘀是臨床骨質(zhì)疏松最常見的中醫(yī)辨證類型。該病的病位在骨，根源在腎，腎主骨生髓，腎精虧虛會使骨髓生長無源，骨失去滋養(yǎng)，繼而出現(xiàn)骨痿、骨枯、骨痹［8-11］?！端貑枴ど鷼馔ㄌ煺撈分杏涊d：“腎陽為諸陽之本”“陽氣者若天與日，失其所，則折壽而不彰，陽氣者，精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋”，可見腎虛可引起骨的虛弱；《醫(yī)林改錯》中記載，“元?dú)庹吣I氣也”“元?dú)饧刺?，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”，可見腎虛可引起血瘀，血瘀又能進(jìn)一步影響骨髓滋養(yǎng)并加重骨痿、骨枯、骨痹［12-14］。

根據(jù)腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松的中醫(yī)特點(diǎn)，益氣溫陽活血方能夠起到補(bǔ)腎益氣、溫陽健骨、活血化瘀的作用。方中補(bǔ)骨脂、淫羊藿、桑寄生補(bǔ)腎助陽、強(qiáng)筋健骨；當(dāng)歸、牛膝益氣活血；黃芪升陽補(bǔ)氣、滋養(yǎng)五臟六腑，增加精血，共奏益氣溫陽活血功效，有助于增益骨髓，強(qiáng)健骨骼。本研究中益氣溫陽活血方能夠針對腎虛血瘀證發(fā)揮益氣溫陽活血功效，在鈣爾奇、阿法骨化醇的基礎(chǔ)上加用益氣溫陽活血方后觀察組患者BMD高于對照組，表明在常規(guī)西藥治療的基礎(chǔ)上加用益氣溫陽活血方能增加腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松患者的骨密度。

骨質(zhì)疏松的發(fā)生與骨形成減弱、骨吸收增強(qiáng)有關(guān)。PINP是I型膠原合成過程中的副產(chǎn)物，反應(yīng)骨形成過程中的膠原合成能力；β-CTX是I型膠原水解過程中的副產(chǎn)物，反應(yīng)骨吸收過程中的膠原水解程度［15-16］。在腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松的發(fā)生過程中，腎精虧虛，瘀血阻滯會使骨髓生長無源，骨失去滋養(yǎng)，在現(xiàn)代生物學(xué)上表現(xiàn)為骨形成減弱、骨吸收增強(qiáng)，患者血清中PINP減少、β-CTX增加［17］。本研究中觀察組患者血清PINP含量高于對照組、β-CTX含量低于對照組，表明在常規(guī)西藥治療的基礎(chǔ)上加用益氣溫陽活血方能夠增強(qiáng)骨形成，抑制骨吸收，與其能增加骨密度相吻合。

在骨形成和骨吸收的調(diào)控中，PI3K/AKT信號通路起到了至關(guān)重要的作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明［18-21］，益氣溫陽活血方中補(bǔ)骨脂、淫羊藿、黃芪等多味藥物能夠激活PI3K/AKT通路并刺激成骨細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而增強(qiáng)骨形成、抑制骨吸收。另有動物實(shí)驗(yàn)表明［22-23］，益氣溫陽活血方能激活糖尿病腎病大鼠及心肌缺血再灌注大鼠PI3K/Akt信號通路。本研究中觀察組患者外周血p-PI3K、p-AKT的表達(dá)均高于治療前及治療后對照組，但對照組治療前后p-PI3K、p-AKT表達(dá)未發(fā)生明顯變化，表明常規(guī)西醫(yī)治療對PI3K/AKT通路無明顯激活作用，加用益氣溫陽活血方后PI3K/AKT通路被激活，提示激活PI3K/AKT通路是益氣溫陽活血方治療腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松可能的分子機(jī)制。

綜上所述，益氣溫陽活血方聯(lián)合鈣爾奇、阿法骨化醇能夠增加老年腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松患者骨密度，改善骨代謝，其機(jī)制可能與激活PI3K/AKT通路有關(guān)，具有積極的臨床治療價值，值得臨床進(jìn)一步使用和推廣。