高效液相色譜法測定復方黃蜀葵花噴霧劑中金絲桃苷含量*

譚本仁，黃義純，陳華龍，鄭錦坤，徐曉梅△

1 汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院,廣東 韶關 512026；2 韶關市食品藥品檢驗所

復方黃蜀葵花噴霧劑是以黃蜀葵花為主，配紫草、地榆、大黃、白及、虎杖、大黃等中草藥，經過科學方法提取和研制而成，用于治療各種燒、燙傷引起的創(chuàng)傷、疼痛、紅腫、潰爛及感染等。黃蜀葵花具有清利濕熱、消腫解毒功效，用于濕熱壅遏，淋濁水腫，癰疽腫毒，水火燙傷［1-2］，其主要成分為金絲桃苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、棉皮素-3-葡萄糖苷和異槲皮苷等黃酮類成分，收載于2015年版《中華人民共和國藥典》［3-5］。其中，金絲桃苷具有抗炎、解痙、利尿、止咳、保肝、免疫調節(jié)等多種藥理活性［6］。本研究采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定復方黃蜀葵花噴霧劑中主要成分金絲桃苷的含量，旨在為制定復方黃蜀葵花噴霧劑質量標準提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器島津（SHIMADZU）LC-30AD型高效液相色譜儀（日本島津）；島津SPD-20A型紫外分光檢測儀（日本島津）；METTLE TOLEDO AG135型電子天平（精密0.000 01 g）；HT-300BQ型超聲波清洗儀（濟寧恒通）。

1.2 試藥復方黃蜀葵花噴霧劑樣品及其陰性對照品均由汕頭大學醫(yī)學院附屬粵北人民醫(yī)院制劑室自制；金絲桃苷對照品（批號：111521-201809，含量：94.9%，中國食品藥品檢定研究院提供）；乙腈、甲醇（色譜純，TEDIA公司）；水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱：Kromasil 100-5-C18（5μm，250 mm×4.6 mm）；乙腈為流動相A，2%磷酸鹽緩沖溶液為流動相B，梯度洗脫，流動相比例見表1。柱溫：30℃；流速：1 mL/min；檢測波長：401 nm，進樣量：10μL。理論板數(shù)按金絲桃苷計算應不低于3000。

表1 梯度洗脫流動相比例

2.2 金絲桃苷對照品溶液的制備精密稱取金絲桃苷對照品10.81 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，作為102.58μg/mL的對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備精密量取復方黃蜀葵花噴霧劑供試品約10 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.4 陰性對照品溶液的制備按復方黃蜀葵花噴霧劑工藝制成缺黃蜀葵花的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制備陰性對照品溶液。

2.5 樣品測定分別精密吸取對照品溶液、復方黃蜀葵花噴霧劑供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，復方黃蜀葵花噴霧劑中其他成分對金絲桃苷的測定無干擾。見圖1—3。

圖1 金絲桃苷對照品HPLC圖譜

圖2 供試品HPLC圖譜

圖3 陰性對照品HPLC圖譜

2.6 線性關系考察取“2.2”項下對照品溶液，以對照品的含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。金絲桃苷的回歸方程為：Y＝1.4065×103X+5.3507×103（r=1），結果表明金絲桃苷在10.26～205.17μg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗分別精密吸取對照品溶液10μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣5次，測定峰面積，并計算RSD為0.23%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗取復方黃蜀葵花噴霧劑，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，于室溫下分別放置0、2、4、8、12、24 h后進樣，測定金絲桃苷的峰面積，以考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結果RSD為0.24%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.9 重復性試驗取6支復方黃蜀葵花噴霧劑依“2.3”項下方法制備供試品溶液及進樣測定含量，金絲桃苷的平均含量為18.35μg/mL，RSD為0.33%（n=6），表明重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗精密量取6支復方黃蜀葵花噴霧劑供試品溶液10 mL，分別精密加入金絲桃苷對照品溶液（102.58μg/mL）0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，按“2.1”項下色譜條件進行測定，并計算加樣回收率。結果顯示平均加樣回收率為97.40%，RSD為0.81%（n=6），見表2。

表2 金絲桃苷加樣回收率試驗結果

2.11 樣品中金絲桃苷含量測定取3批樣品，按“2.3”項方法制備供試品溶液，分別測定2次，結果表明復方黃蜀葵花噴霧劑中金絲桃苷含量基本穩(wěn)定。見表3。

表3 金絲桃苷含量測定結果

3 討論

3.1 提取溶液及提取方法篩選金絲桃苷作為復方黃蜀葵花噴霧劑的主要成分，可溶于甲醇［7］。在供試品溶液的制備過程中對甲醇、乙酸乙酯等不同提取溶劑進行優(yōu)選，甲醇提取含量最高。選定甲醇為提取溶劑。在預試驗中對比了超聲、回流等不同提取方法，但差異性較小，所以采取直接提取方法。該法方便，快速，提取的金絲桃苷含量最高，確定本法為供試品溶液的制備方法［8］。

3.2 最大吸收波長測定取金絲桃苷對照品溶液和供試品溶液，進行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)金絲桃苷在401 nm波長處有最大吸收，故本試驗選擇401 nm作為檢測波長。

3.3 流動相、流速和柱溫的選擇考察了甲醇-水-磷酸系統(tǒng)、乙腈-水-磷酸系統(tǒng)［9］，乙腈-2%磷酸鹽緩沖溶液的分離效果理想，確定為流動相系統(tǒng)?？疾炝?.8、1、2 mL/min 3個流速，結果1 mL/min流速效果最好。本分離系統(tǒng)在柱溫30°條件下效果最理想。

綜上所述，本試驗首次建立了HPLC測定復方黃蜀葵花噴霧劑中金絲桃苷含量的方法，所建立的金絲桃苷測定方法簡捷、快速、可靠，可用于復方黃蜀葵花噴霧劑的質量控制。