小麥 DA1基因家族成員的鑒定及其表達(dá)譜分析

宮盼盼，陳 浩，宋成祥，許書豪，張 杏，茆海亮

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070)

編碼泛素受體的DA1基因不僅在調(diào)節(jié)籽粒大小方面發(fā)揮著重要作用，而且在植物生長發(fā)育和逆境脅迫中也發(fā)揮著舉足輕重的作用[1-4]。DA1基因家族已在多種作物中均有報(bào)道，如在油菜(Brassicanapus)中鑒定到了4個(gè)DA1基因[5]，在大豆(Glycinemax)中鑒定到了11個(gè)DA1基因[3]，在玉米(Zeamays)中鑒定到了6個(gè)DA1基因[6]，在水稻(Oryzasativa)中鑒定到了4個(gè)DA1基因[7]，在棉花(Gossypiumssp.)中鑒定到了21個(gè)DA1基因[8]。DA1基因首先在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)擬南芥AtDA1氨基酸序列第358位點(diǎn)上的精氨酸突變?yōu)橘嚢彼?DA1R358K)時(shí)，種子、花、葉片、長角果等組織或器官的表型性狀變化較大，另外，脫落酸(ABA)可促進(jìn)AtDA1基因的表達(dá)，從而正向調(diào)節(jié)種子的大小[9]。研究發(fā)現(xiàn)，編碼環(huán)狀的E3泛素連接酶DA2可以與DA1蛋白結(jié)合，從而影響籽粒的大小，而控制水稻粒重和粒寬的E3泛素連接酶GW2與DA2蛋白同源，發(fā)揮著相似的功能和作用[10-11]。在擬南芥中有7個(gè)DA1相關(guān)基因(DA1-related,DAR)，它們與DA1基因序列相似性較高，分別定點(diǎn)突變DA1和DAR1時(shí)，種子的大小沒有發(fā)現(xiàn)明顯的差異，但同時(shí)突變則使種子顯著變大，說明二者有功能冗余[2,9]；也有研究發(fā)現(xiàn)，DAR2基因可調(diào)節(jié)生長素的運(yùn)輸，且能影響根分生組織的大小[12-13]，在種子發(fā)芽和葉片轉(zhuǎn)綠過程中也能提高擬南芥根系對鹽脅迫的耐受性[14]。

目前在小麥中已對TaDA1基因在籽粒大小方面進(jìn)行了功能驗(yàn)證[15]，但還未對DA1基因家族進(jìn)行全面系統(tǒng)的鑒定分類和功能研究。本研究在全基因組水平上對小麥DA1基因家族進(jìn)行了鑒定，并從系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件、蛋白互作以及不同組織和逆境、ABA處理下TaDA1s的表達(dá)模式等方面進(jìn)行了分析，以期為深入研究該基因家族在小麥發(fā)育過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥 DA1基因家族鑒定和理化性質(zhì)分析

從PFAM網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)下載DA1-like蛋白的hmm文件(Pfam號：PF12315)，從Ensemble Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/Triticum_aestivum/Info/Index)下載小麥蛋白序列。用HMMER 3.0的隱馬爾科夫模型(HMM)對小麥蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，通過e值(e

1.2 小麥 TaDA1s基因的系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和保守motif分析

用MEGA 7軟件[17]對小麥、水稻和擬南芥DA1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行序列比對，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值為1 000。獲取小麥DA1基因在染色體上內(nèi)含子、外顯子和非編碼區(qū)序列的位置信息，用GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)[18]繪制基因結(jié)構(gòu)圖。用MEME(https://meme-suite.org/meme/)對小麥DA1基因中存在的保守motif進(jìn)行預(yù)測，設(shè)置motif數(shù)量為10個(gè)，motif長度為6～50 aa。用TBtools軟件[19]繪制小麥DA1基因家族的基因進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和motif綜合圖。

1.3 小麥 TaDA1s基因的順式作用元件及其編碼蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析

用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)[20]搜索小麥DA1基因家族所有成員的互作基因，在WheatOmics(http://202.194.139.32/idConvert/)網(wǎng)站上進(jìn)行基因ID轉(zhuǎn)換，用Cytoscape軟件[21]繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。用plantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)(基因上游1 500 bp)順式作用元件分析，用TBtools軟件對預(yù)測的結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

1.4 小麥 TaDA1s基因的表達(dá)模式分析

1.5 酵母雙雜交和熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)(驗(yàn)證蛋白互作)

設(shè)計(jì)含有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的同源臂引物(表1)，擴(kuò)增小麥TaDA1-A、TaDA1-2B、TaDAR1-5A和TaGW2基因的CDS序列，分別與pGBKT7和pGADT7載體連接，構(gòu)建酵母雙雜重組載體。將連接在pGBKT7載體上的重組載體分別按Y2HGold轉(zhuǎn)化說明書(唯地生物，上海)的操作轉(zhuǎn)入酵母菌菌株Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布在SD/-Trp和SD/-Trp/X-α-gal/AbA缺陷培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，進(jìn)行毒性試驗(yàn)和自激活檢測。隨后將構(gòu)建好的pGBKT7和pGADT7載體共轉(zhuǎn)化至酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞中，點(diǎn)涂在SD/-Trp/-Leu、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal/AbA/3-AT(QDO/X/A)缺陷培養(yǎng)基上，確定其互作關(guān)系。

設(shè)計(jì)含有SalI和KpnI酶切位點(diǎn)的的同源臂引物(表1)擴(kuò)增小麥TaDA1-A、TaDA1-2B、TaDAR1-5A和TaGW2基因的CDS序列，分別與771-nLUC和772-cLUC載體連接，構(gòu)建LUC重組載體。將重組載體轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，收集菌液，用侵染液(0.01 mol·L-1MES + 0.01 mol·L-1MgCl2+ 1.5×10-5mol·L-1AS)調(diào)整菌液濃度OD600值為1.0，將驗(yàn)證的互作基因菌液按1∶1的體積比混合，利用注射器將菌液注射至煙草葉片，常溫下培養(yǎng)1～2 d后，將熒光素酶底物注射至煙草相應(yīng)位置，每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用分子成像儀(Tanon-5200)觀察熒光信號。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 DA1基因家族成員鑒定結(jié)果

用NCBI Blastp和HMMER兩種方式對小麥全基因組進(jìn)行鑒定，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)12個(gè)小麥DA1基因家族成員。用SMART、Interpro和PFAM在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)12個(gè)DA1蛋白都含有DA1-like結(jié)構(gòu)域。這些基因分布在2B、2D、4A、4B、4D、5A、5B和5D染色體上。序列特征分析發(fā)現(xiàn)，DA1基因家族編碼的蛋白由220～550個(gè)氨基酸組成，分子量在24.78～62.10 kDa之間，等電點(diǎn)在5.68～8.60之間。亞細(xì)胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)，所有DA1家族基因都定位在細(xì)胞核中(表2)。

表2 小麥 DA1基因家族成員特征Table 2 Characteristics of DA1 gene family members in wheat

2.2 小麥 TaDA1s的系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和順式作用元件分析

利用小麥、擬南芥和水稻的DA1基因家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DA1基因家族成員可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四組，TaDA1s分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ組，分別包含3、6和3個(gè)DA1基因(圖1)。由于擬南芥AtDAR3、AtDAR4、AtDAR5、AtDAR6和AtDAR7的序列中不存在UIM結(jié)構(gòu)域，單獨(dú)聚在第Ⅲ組，與小麥DA1基因家族成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 小麥、擬南芥和水稻 DA1基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of DA1 gene family members in wheat,Arabidopsis and rice

根據(jù)小麥TaDA1s基因的CDS序列，分析小麥DA1基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)相關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)除TaDA1-2D1基因只含有5個(gè)外顯子外，其他基因均含有11～12個(gè)外顯子(圖2B)。用MEME在線網(wǎng)站對小麥DA1蛋白中的基序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)TaDA1-2D1只包含DA1-like結(jié)構(gòu)域的基序motif 2、motif 4和motif 5，而其他TaDA1s基因都包含一個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域(motif 1)，一個(gè)或兩個(gè)UIM結(jié)構(gòu)域(motif 7、motif 6或motif 9)和DA1-like結(jié)構(gòu)域(motif 2、motif 3、motif 4和motif 5)，與擬南芥中AtDA1、AtDAR1和AtDAR2蛋白的肽鏈結(jié)構(gòu)一致性較高，表明DA1基因家族成員編碼的蛋白在不同物種中具有保守性(圖2C)。

圖2 小麥 DA1基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系(A)、基因結(jié)構(gòu)(B)和motif(C)分析Fig.2 Phylogenetic tree(A),gene structure(B) and motif(C) analysis of wheat DA1 gene family member

TaDA1s基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，除了含有核心功能響應(yīng)元件(TATA-box、CAAT-box等)和目前未知的其他功能基序外，還含有響應(yīng)逆境環(huán)境、激素以及與生長發(fā)育有關(guān)的元件，暗示這些TaDA1s的表達(dá)可能調(diào)控小麥生長發(fā)育，并受激素和干旱、低溫等環(huán)境的影響(圖3)。

圖3 小麥 DA1基因家族成員順式作用元件分析Fig.3 Cis-acting elements analysis of wheat DA1 gene family members

2.3 TaDA1s的表達(dá)模式分析

2.3.1TaDA1s在不同組織中的表達(dá)模式

根據(jù)小麥公共數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)除TaDA1-2D1在各個(gè)組織不表達(dá)外，其他TaDA1s在各個(gè)組織中均有所表達(dá)。取小麥中國春整個(gè)發(fā)育時(shí)期的不同組織(一葉期的根；一葉期、三葉期和五葉期的葉片和旗葉；幼穗；開花后0、5和15 d的籽粒)進(jìn)行熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)TaDA1s在各個(gè)組織均有表達(dá)，且在根、葉片和幼穗中的表達(dá)量相對較高(表3)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TaDA1-2B和TaDA1-2D在籽粒發(fā)育過程下調(diào)表達(dá)，開花后15 d的表達(dá)量極顯著低于開花后0 d的表達(dá)量；TaDAR1-5A在籽粒發(fā)育過程中上調(diào)表達(dá)，開花后15 d的表達(dá)量極顯著高于開花后 0 d的表達(dá)量；TaDAR1-5B在籽粒發(fā)育過程中呈先下調(diào)后上調(diào)的表達(dá)模式，開花后15 d的相對表達(dá)量最高，顯著高于開花后0 d的表達(dá)量；而TaDAR1-5D、TaDAR2-4B和TaDAR2-4A/4B/4D的表達(dá)量在籽粒發(fā)育開花后5 d最高，與開花后 0 d的表達(dá)量之間差異均達(dá)到顯著或極顯著水平，TaDAR2-4B在開花后15 d的表達(dá)量也極顯著高于開花后0 d的表達(dá)量。暗示TaDA1s可能存在功能分化。

表3 小麥 TaDA1s在不同組織中的相對表達(dá)量Table 3 Relative expression levels of wheat TaDA1s in different tissues

2.3.2TaDA1s在激素處理和逆境脅迫條件下的表達(dá)模式

為進(jìn)一步確定TaDA1s在不同激素處理下的表達(dá)模式，根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素(CTK)、水楊酸(SA)、赤霉素(GA)和茉莉酸內(nèi)酯(JA)等激素處理Fielder小麥葉片后，TaDA1s的相對表達(dá)量變化不明顯，而ABA處理后TaDA1s均下調(diào)表達(dá)。進(jìn)一步通過ABA處理苗期中國春小麥根部，qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因在ABA處理后均下調(diào)表達(dá)，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相吻合(表4)。ABA處理3 h 后TaDA1-2B、TaDA1-2D、TaDA1-4B、TaDAR2-4B和TaDAR2-4A/4B/4D的表達(dá)量與處理0 h后的表達(dá)量之間差異達(dá)顯著或極顯著水平，ABA處理6 h后TaDA1-2B、TaDAR1-4B、TaDAR1-4D、TaDAR1-5A、TaDAR1-5B、TaDAR1-5D和TaDAR2-4A/4B/4D的表達(dá)量與處理0 h后的表達(dá)量之間差異達(dá)顯著或極顯著水平，ABA處理12 h后TaDA1-2B、TaDAR1-4A、TaDAR1-4D、TaDAR2-4B和TaDAR2-4A/4B/4D的表達(dá)量與處理0 h后的表達(dá)量之間差異達(dá)顯著或極顯著 水平。

根據(jù)低溫[23]和鹽脅迫[24]條件下TaDA1s的公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)TaDA1s在低溫條件下表達(dá)差異較為顯著。進(jìn)一步對中國春小麥苗期進(jìn)行低溫和鹽脅迫處理(表4)，發(fā)現(xiàn)大部分TaDA1s在低溫脅迫處理后均上調(diào)表達(dá)，其中 4 ℃時(shí)TaDA1-2B、TaDAR1-4D、TaDAR2-4B和TaDAR2-4A/4B/4D的表達(dá)量與21 ℃時(shí)的表達(dá)量之間差異均達(dá)顯著或極顯著水平，說明TaDA1s可能參與小麥對低溫脅迫的響應(yīng)。對小麥苗期進(jìn)行不同梯度的鹽濃度處理，發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度的上升，大部分TaDA1s呈先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)模式，所有TaDA1s在0.1 mol·L-1鹽濃度下表達(dá)量最高，其中TaDA1-2B、TaDA1-2D、TaDAR1-4B、TaDA1-4D和TaDAR2-4B的表達(dá)量與CK處理間差異均達(dá)顯著或極顯著水平；在 0.2 mol·L-1鹽濃度下，TaDA1-2B、TaDAR1-5A、TaDAR1-5B、TaDAR1-5D和TaDAR2-4A/4B/4D的表達(dá)量明顯下降，與CK處理間差異達(dá)顯著或極顯著水平。

表4 小麥 TaDA1s在逆境和ABA處理下的相對表達(dá)量Table 4 Relative expression levels of wheat TaDA1s under stress and hormone treatments

2.4 TaDA1s與 TaGW2編碼的蛋白互作驗(yàn)證

Liu等[15]研究結(jié)果表明，TaDA1-A(Traes CSU02G007800)與TaGW2有互作關(guān)系。為了探索小麥DA1基因家族其他成員TaDA1-2B和TaDAR1-5A與TaGW2的互作關(guān)系，本研究使用酵母雙雜交和螢火蟲熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)了解TaDA1-2B、TaDAR1-5A與TaGW2蛋白的互作關(guān)系，并對TaDA1-A和TaGW2蛋白的互作關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TaGW2有較強(qiáng)的自激活現(xiàn)象[25]，TaDA1-A、TaDA1-2B和TaDAR1-5A也有較強(qiáng)的自激活現(xiàn)象。將pGBKT7-TaDA1-A、pGBKT7-TaDA1-2B、pGBKT7-TaDAR1-5A重組載體與空載體pGADT7分別共轉(zhuǎn)至酵母菌中，在QDO/X/A四缺培養(yǎng)基上能夠很好地生長，且有變藍(lán)的跡象，不同濃度的3-AT抑制劑均不能抑制pGBKT7-TaDA1-A、pGBKT7-TaDA1-2B和pGBKT7-TaDAR1-5A的自激活效應(yīng)，因此不能得到TaDA1-A、TaDA1-2B、TaDAR1-5A與TaGW2互作的結(jié)果(圖4A)。進(jìn)一步利用螢火蟲熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)含有TaDAR1-5A與TaGW2的載體共轉(zhuǎn)的農(nóng)桿菌注射煙草后有微弱的熒光信號，說明有微弱的互作效應(yīng)，而含有TaDA1-A、TaDA1-2B與TaGW2的載體注射煙草后沒有發(fā)現(xiàn)熒光信號(圖4B)。

利用STRING數(shù)據(jù)庫對TaDA1s編碼蛋白的互作蛋白進(jìn)行預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)有7個(gè)互作蛋白，但不包括TaGW2。這些互作蛋白的功能主要涉及生長發(fā)育、育性調(diào)控、激素調(diào)控以及逆境響應(yīng)等方面(圖4C)。

A：酵母雙雜交試驗(yàn)，QDO/X/A：含有X-α-gal和AbA的四缺培養(yǎng)基；3-AT：HIS3蛋白競爭性抑制劑3-氨基-1,2,4-三唑；pGBKT7-53 + pGADT7-T為試驗(yàn)陽性對照，pGBKT7+pGADT7為試驗(yàn)陰性對照。B：螢火蟲熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)，TaDEP1-nLUC + cLUC-52為試驗(yàn)陽性對照(試驗(yàn)數(shù)據(jù)未發(fā)表)，紅色圓圈內(nèi)為菌液注射區(qū)域。C：TaDA1s蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

3 討 論

本研究利用生物信息學(xué)的方法，在小麥參考基因組上鑒定到了12個(gè)DA1家族基因(不包含未知染色體上的同源基因)，這些基因結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相對穩(wěn)定，具有較高的功能保守性。小麥和擬南芥DA1基因家族成員的進(jìn)化樹分析結(jié)果與玉米和擬南芥DA1基因家族成員的進(jìn)化樹分析結(jié)果相一致[6]，進(jìn)一步證實(shí)單子葉植物DA1基因的進(jìn)化關(guān)系更近。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TaDA1-2D1基因編碼的氨基酸片段較短，只含有DA1-like結(jié)構(gòu)域，且在小麥生長發(fā)育的各個(gè)階段都不表達(dá)，推測TaDA1-2D1可能為假基因。結(jié)合序列比對的結(jié)果，TaDA1-2D1蛋白序列全長與TaDA1-2D的部分序列同源性高度一致，只有兩個(gè)堿基的差異，由此推測，該基因在進(jìn)化過程中沒有完全復(fù)制，進(jìn)而造成其基因片段部分丟失[26-27]。

目前關(guān)于DA1基因控制植物器官大小的研究在多種作物中均有報(bào)道[3,5-9,15]，但DA1基因在逆境方面的研究還相對較少。Zhao等[3]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)大豆GsoDA1基因能夠提高擬南芥對鹽脅迫的抗性。本研究對TaDA1s順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，TaDA1s基因啟動(dòng)子區(qū)含有許多響應(yīng)低溫的元件，轉(zhuǎn)錄組和qRT-PCR結(jié)果分析也表明，低溫能促進(jìn)TaDA1s基因的表達(dá)，說明TaDA1s在低溫環(huán)境中發(fā)揮著一定作用。本研究中TaDA1s在鹽濃度為0.1 mol·L-1的處理下表達(dá)量上升，說明TaDA1s對鹽脅迫環(huán)境中也發(fā)揮著一定作用。同時(shí)，TaDA1s基因?qū)TK、SA、GA、JA等激素沒有明顯響應(yīng)，主要受ABA的負(fù)向調(diào)控，與擬南芥中ABA正向調(diào)控DA1基因的機(jī)制相反[9]。這為小麥DA1基因家族在逆境和激素響應(yīng)方面的研究提供一定的參考價(jià)值。

TaDA1-A是位于未知染色體上的含有DA1-like結(jié)構(gòu)域的基因。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TaGW2和TaDA1-A存在轉(zhuǎn)錄自激活效應(yīng)，通過不同3-AT濃度梯度進(jìn)行篩選仍不能確定TaDA1-A與TaGW2的互作關(guān)系。而在Liu等[15]的試驗(yàn)中，是通過將TaDA1-A基因CDS的前297 bp片段截短進(jìn)行TaDA1-A與TaGW2酵母雙雜交驗(yàn)證工作，而本研究使用的是TaDA1-A基因CDS全長序列，這可能是造成結(jié)果不一致的原因。通過熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，TaDAR1-5A與TaGW2有微弱的互作關(guān)系，而TaDA1-A、TaDA1-2B與TaGW2在煙草中沒有發(fā)現(xiàn)互作現(xiàn)象。通過數(shù)據(jù)庫對TaDA1s互作基因進(jìn)行搜索，共找到7個(gè)互作基因，但不包括TaGW2，該工作還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。