新診斷2型糖尿病合并高尿酸血癥患者的臨床特征及腸道菌群變化

陳柔柔，李 娜，赫榮波，鄒 婧，劉 青，張 穎，劉 煜

南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 211100

高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是因嘌呤代謝紊亂而使尿酸生成過多和（或）排泄減少導(dǎo)致的一種代謝性臨床綜合征［1］。HUA 與2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）、代謝綜合征、高血壓、心血管疾病、慢性腎病、痛風(fēng)等密切相關(guān)，是這些疾病發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素［2-6］。研究表明［7］尿酸水平的升高可直接或間接導(dǎo)致空腹血糖水平的升高，且尿酸水平可能與T2DM 的早期發(fā)病機制密切相關(guān)。糖尿病患者常伴有腎臟血流量減少，使腎小球缺氧，并使乳酸的生成增加，進而與尿酸競爭性排泄，從而導(dǎo)致尿酸的排泄減少。此外，糖尿病患者中多數(shù)伴有肥胖癥、脂代謝障礙、胰島素抵抗等，均會影響尿酸代謝。因此，糖尿病與HUA 可能存在共同的發(fā)病基礎(chǔ)。

腸道微生態(tài)作為人體中最大的微生態(tài)系統(tǒng)，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)宿主代謝的一個重要器官，存在于人體腸道的大量微生物被稱為腸道菌群?，F(xiàn)有研究顯示［8］，腸道菌群組成變化與多種疾病均具有相關(guān)性，包括HUA、糖尿病、代謝綜合征、腎臟病、冠心病和腫瘤等。

本研究主要通過對不同病程的T2DM合并HUA的臨床特征進行分析，并進一步分析T2DM 合并HUA的腸道菌群結(jié)果特點，探究T2DM合并HUA的發(fā)生發(fā)展是否與腸道菌群的組成改變相關(guān)，旨在為新診斷T2DM 合并HUA 的微生態(tài)治療提供新的理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象

本研究隨機納入2019年7月—2020年7月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院內(nèi)分泌科及健康管理中心就診的18～80 歲患者，包括單純新診斷T2DM 患者103例和T2DM合并HUA患者98例。T2DM合并HUA 患者中，新診斷的患者29 例，病程1～5 年的患者27例，病程>5年的患者42例。從新診斷T2DM合并HUA組及單純新診斷T2DM組中各選取年齡及性別匹配的患者，納入9例新診斷T2DM合并HUA的患者（DMUA組），8例單純新診斷T2DM的患者（T2DM組），并同期收集年齡及性別匹配的8 例HUA 患者（HUA組）及8例健康志愿者（Control 組），分別采集糞便標(biāo)本。并同時收集所有研究對象的一般資料、實驗室檢查結(jié)果。本研究方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（No2017?SR?001.S2）。

入組標(biāo)準(zhǔn)：①單純HUA患者：年齡18～80歲；參照《2013高尿酸血癥和痛風(fēng)治療的中國專家共識》，正常飲食狀態(tài)的非同日2次的空腹水平所檢測出的血尿酸值：男性血尿酸的水平≥420 μmol/L，女性血尿酸的水平≥360 μmol/L；未用降尿酸藥物。②單純新診斷T2DM患者：年齡18～80歲；參照《中國2型糖尿病防治指南2017 年版》的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；新診斷的2 型糖尿病患者，即12 個月內(nèi)診斷為2 型糖尿病患者（WHO 標(biāo)準(zhǔn)，1999 年）；未用任何藥物，包括降糖及調(diào)脂藥物等。③新診斷T2DM 合并HUA 患者：同時滿足①和②的入組標(biāo)準(zhǔn)。④T2DM 合并HUA 患者：年齡18～80 歲；參照《中國2型糖尿病防治指南2017年版》的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)；正常飲食狀態(tài)的非同日2次的空腹水平所檢測出的血尿酸值：2次的血清尿酸水平男性≥420 μmol/L，女性≥360 μmol/L。T2DM 病程<1 年的患者無用藥史；病史1～5 年的患者僅單用二甲雙胍；病史>5年的患者為單用二甲雙胍或二甲雙胍聯(lián)合基礎(chǔ)胰島素，未用降尿酸、調(diào)脂藥物及利尿劑等。

健康對照組：年齡18～80 歲；血糖正常，無糖尿病家族史；正常嘌呤飲食狀態(tài)下，尿酸正常；近3 個月內(nèi)未服用微生態(tài)制劑或抗生素；近1 個月內(nèi)無腹瀉及其他胃腸道的疾病史，無胃腸道手術(shù)史；無長期服用藥物史。

排除標(biāo)準(zhǔn)：近3 個月內(nèi)服用微生態(tài)制劑或抗生素者；有腹瀉及其他胃腸道的疾病史；長期酗酒、大量進食動物內(nèi)臟及海產(chǎn)品等習(xí)慣的患者；嚴(yán)重心腦、肝腎功能障礙；1 型或其他類型糖尿??；長期使用的藥物不符合入組標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料及樣本收集

患者臨床信息采集主要通過隨訪問卷、醫(yī)院信息系統(tǒng)等多種途徑獲取患者的基本信息、臨床檢驗結(jié)果和臨床特征。采集研究對象清晨排便后的新鮮糞便標(biāo)本約5 g，置于密閉無菌糞便采集盒內(nèi)，分別編號。所有糞便采集盒的管壁及管帽上均標(biāo)注患者的姓名、編碼等基本信息（油性筆做好標(biāo)記），并于30 min 內(nèi)迅速儲存于-80 ℃低溫冰箱中，避免反復(fù)凍溶。

1.2.2 糞便16S rRNA基因測序

糞便樣本基因組DNA的提取采用SDS方法，并進一步使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA 純度及濃度，隨后將適量的樣品放置在離心管中，用無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。選擇所需進行測序的區(qū)域，采用帶Barcode 特異性引物，16S V3?V4 區(qū)的引物為341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；806R：GGAC?TACNNGGGTATCT AAT，進一步對細(xì)菌的16S rD?NA V3?V4區(qū)進行PCR擴增。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進一步進行等濃度的混樣，并充分混合均勻，選取1×TAE 濃度2%瓊脂糖膠電泳進行純化PCR 的產(chǎn)物，主帶大小選擇在450～550 bp之間的序列，并予割膠回收目標(biāo)條帶。文庫的構(gòu)建采用美國Illumina 公司的TruSeq DNA PCR?Free Library Preparation Kit 建庫試劑盒。經(jīng)過Qubit 的定量及文庫檢測后，將構(gòu)建好的符合后續(xù)測序要求的文庫用NovaSeq6000進一步行上機測序。測序所獲得的信息通過優(yōu)化序列區(qū)分樣本后進行OTU聚類和物種的分類分析。

1.2.3 OTU聚類和物種分類分析

α多樣性分析：主要用于分析組內(nèi)微生物群落的多樣性［9］。本研究采用了chao1 指數(shù)、PD_whole_tree指數(shù)、goods_coverage指數(shù)和ACE指數(shù)進行統(tǒng)計。

β多樣性分析：基于Weighted Unifrac 距離以及Unweighted Unifrac 距離可進行PCoA（Principal Coordinates Analysis）分析［10］，選擇貢獻率最大的主坐標(biāo)的組合作圖后進行展示。若樣本距離越接近，則表示物種的組成結(jié)構(gòu)越相似。

OTU差異顯著性分析：LDA EffectSize（LEfSe）作為發(fā)現(xiàn)和解釋高維度的生物標(biāo)識分析工具之一［11］，可在組與組間尋找出組間的差異顯著物種，本研究用LDA值柱狀分布圖及進化分支圖來顯示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0 的統(tǒng)計學(xué)軟件對本實驗的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對正態(tài)分布計量資料的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，兩組間比較用獨立t檢驗計算，兩組以上用方差分析，對于方差不齊的數(shù)據(jù)采用Wilcoxon 秩和檢驗，組間兩兩比較采用Tukey?HSD 檢驗。通過Qimme 軟件分析Beta 多樣性。分組樣品的物種組成、群落結(jié)構(gòu)進行差異顯著性檢驗采用的是T?test、LEfSe、MetaStat 等統(tǒng)計學(xué)分析方法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征比較

比較98 例T2DM 合并HUA 患者不同糖尿病病程（病程<1 年、1～5 年和>5 年）的臨床特征，結(jié)果顯示，不同病程患者的年齡、低密度脂蛋白、并發(fā)癥發(fā)生率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。新診斷T2DM合并HUA 組（病程<1 年）比病程大于5 年組的低密度脂蛋白顯著升高（P<0.05），年齡及并發(fā)癥發(fā)病率顯著降低（P<0.05，表1）。

表1 不同病程T2DM合并HUA的一般情況及臨床資料比較分析Table 1 General clinical data of patients with T2DM complicated with HUA in different stages（n=98）

比較新診斷T2DM 合并HUA 與單純新診斷T2DM患者的臨床特征，結(jié)果顯示新診斷T2DM合并HUA 組的糖化血紅蛋白水平顯著降低（P<0.05），而總膽固醇、甘油三酯、胰島素、C 肽水平、血清尿酸、空腹葡萄糖、動脈硬化指數(shù)及脂肪肝發(fā)生率顯著升高（P<0.05，表2）。

表2 新診斷T2DM合并HUA與單純新診斷T2DM的比較分析Table 2 Comparison of newly diagnosed T2DM patients with HUA and newly diagnosed T2DM patients

2.2 DMUA組與T2DM組、HUA組及Control組的腸道菌群分析

2.2.1 臨床資料比較

4組研究對象的年齡、性別、體重指數(shù)（BMI）、轉(zhuǎn)氨酶無明顯差異（P>0.05）。DMUA 組與T2DM 組、HUA 組及Control 組相比，高密度脂蛋白降低，甘油三酯顯著增高（P<0.05）。DMUA 組與T2DM 組、HUA 組相比，其動脈硬化指數(shù)亦明顯升高（P<0.05，表3）。

表3 研究對象的一般情況及臨床資料比較Table 3 General clinical data of patients

2.2.2 基于OTU的韋恩圖

4 組樣本共同存在的OTU 有318 個，而特有的OTU中，T2DM為38個，HUA為33個，DMUA為32個。在4 組樣本中大部分的菌落是相似的，但又同時存在各自特有的差異性菌落（圖1）。

圖1 OTU的韋恩圖Figure 1 Venn diagram of OTU

2.2.3 α多樣性分析

圖2 所示的是描述組內(nèi)樣本的多樣性曲線，即稀釋曲線（rarefaction curve），該曲線直接反映出所測序的數(shù)據(jù)量的合理性，并間接反映出其樣本物種的豐富度，曲線趨于平坦時，表示所測序的數(shù)據(jù)量漸進合理。4組糞便樣本細(xì)菌稀釋曲線末端相對平坦，檢測樣本可滿足后續(xù)實驗。

圖2 OTU指數(shù)稀釋曲線Figure 2 OTU exponential dilution curve

α多樣性分析結(jié)果顯示，α多樣性指數(shù)中chao1指數(shù)、ACE 指數(shù)、PD_whole_tree 指數(shù)及goods_coverage指數(shù)比較，DMUA組、T2DM組及HUA組與Control組相比均顯著降低（P<0.01，圖3），但DMUA 組與T2DM組及HUA組相比，α多樣性指數(shù)均無明顯差異。

圖3 各組腸道菌群α多樣性指數(shù)箱式圖Figure 3 Box diagram of α diversity index of intestinal flora in each group

2.2.4 β多樣性分析

基于Unweighted Unifrac 距離分析顯示，DMUA組較Control 組和HUA組菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異（表4）；另外，基于Weighted Unifrac距離分析結(jié)果表明，DMUA組較T2DM組（P=0.002 4）和HUA組（P=0.01）均有明顯差異（表4）。圖4 的PCoA 結(jié)果表明，4組樣本的離散較好，推斷組間菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

圖4 基于weight unifrac距離的PCoAFigure 4 PCoA based on weight Unifrac distance

表4 用Weighted Unifrac 及Unweighted Unifrac 分析β多樣性差異Table 4 Weighted Unifrac and Unweighted Unifrac were used to analyze β diversity（P值）

2.2.5 腸道菌群物種組成分析

圖5A 顯示的是各組研究對象在門分類水平的相對分布柱狀圖。各組豐度排名前4 的物種，Con?trol組是厚壁菌門（68.25%）、擬桿菌門（22.89%）、變形桿菌門（4.65%）、放線菌門（3.26%），T2DM組是厚壁菌門（49.98%）、擬桿菌門（38.58%）、變形桿菌門（7.68%）、放線菌門（3.30%），HUA 組是擬桿菌門（46.81%）、厚壁菌門（33.28%）、變形桿菌門（12.99%）、梭桿菌門（4.74%），DMUA 組是厚壁菌門（53.55%）、擬桿菌門（29.46%）、變形桿菌門（13.01%）、放線菌門（2.75%）。其中，DMUA 組與HUA 組相比，厚壁菌門比例顯著升高，而擬桿菌門比例顯著下降。

在屬水平上（圖5B），豐度排名前4的物種，Control組是勞特氏菌屬（13.83%）、擬桿菌屬（12.42%）、普拉梭菌屬（10.85%）、巨單胞菌屬（7.62%），T2DM 組是擬桿菌屬（27.26%）、普拉梭菌屬（14.16%）、巨單胞菌屬（6.72%）、勞特氏菌屬（4.36%），HUA 組是擬桿菌屬（37.16%）、普拉梭菌屬（13.36%）、克雷伯氏菌屬（8.46%）、Parabacteroides（5.59%），DMUA 組是擬桿菌屬（20.62%）、巨單胞菌屬（17.85%）、普拉梭菌屬（10.40%）、腸桿菌科未確定菌屬（9.92%）。其中，DMUA組與HUA組相比，巨單胞菌屬（P=0.039 9）比例升高，而擬桿菌屬（P=0.003 06）和勞特氏菌屬（P=0.002 46）比例降低。

圖5 門水平和屬水平的相對分布情況Figure 5 Relative distribution of phylum level and genus level

2.2.6 各組間OTU差異顯著性分析

DMUA 組與HUA 組相比（圖6 A、B），普雷沃氏菌科（f_Prevotellaceae）和巨單胞菌屬（g_Megamo?nas）顯著增加，而擬桿菌門（p_Bacteroidetes）、擬桿菌綱（c_Bacteroidia）、擬桿菌目（o_Bacteroidales）、擬桿菌科（f_Bacteroidaceae）、擬桿菌屬（g_Bacteroi?des）、坦納菌科（f_tannerellaceae）和g_Parabacteroi?des明顯減少。

DMUA 組與Control 組相比（圖6 C、D），梭菌綱（c_Clostridia）、梭菌目（o_Clostridiales）、消化鏈球菌科（f_Peptostreptococcaceae）、g_Romboutsia 顯著減少。

圖6 DMUA組與Control組、HUA組的LDA值分布柱狀圖和進化分支圖Figure 6 Histogram of LDA value distribution and evolutionary branching of DMUA group，Control group and HUA group

3 討論

本研究的一般臨床資料對比中顯示新診斷T2DM 合并HUA 更容易合并脂代謝異常，并容易導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪堆積。現(xiàn)有多項研究均證實腸道菌群與糖尿病、高尿酸血癥及脂代謝存在相關(guān)性［7-8，12-14］，所以我們推斷腸道菌群與新診斷T2DM 合并HUA的發(fā)生發(fā)展及其脂代謝異常可能存在一定的關(guān)系。在進一步的腸道菌群分析中，DMUA組與HUA組相比，厚壁菌門、普雷沃氏菌科和巨單胞菌屬顯著增加，而擬桿菌（門、綱、目、科、屬）、坦納菌科和Parabacteroides 菌屬明顯減少。DMUA 組與Control組相比，其梭菌綱、梭菌目、消化鏈球菌科、Rombout?sia菌屬顯著減少。

Shao 等［15］的有關(guān)痛風(fēng)的糞便菌群及其代謝組學(xué)結(jié)果顯示，痛風(fēng)患者的擬桿菌屬等一些條件致病菌的數(shù)量明顯增加，且與尿酸排泄、嘌呤代謝及炎癥反應(yīng)相關(guān)的代謝產(chǎn)物也發(fā)生明顯改變。痛風(fēng)患者腸道菌群中存在的擬桿菌和梭狀芽胞桿菌的變化，提示了腸道中主導(dǎo)菌群可能對原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展存在重要作用［16］。此外，擬桿菌門、變形桿菌門和梭狀芽孢桿菌類還被證實與胰島素抵抗及糖尿病相關(guān)［17］。在本研究中，DMUA 組的擬桿菌較HUA 組顯著減少，同時其梭菌綱、梭菌目比Control組明顯減少，因擬桿菌及梭菌與尿酸代謝及胰島素抵抗均存在相關(guān)性，其豐度的變化有可能進一步促進新診斷T2DM合并HUA的發(fā)生與發(fā)展。

據(jù)文獻報道［18-21］，勞特氏菌屬產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能同時影響血糖及尿酸水平。在本研究中，DMUA 組與HUA 組在屬水平相比較，其勞特氏菌屬比例顯著降低，提示勞特氏菌屬豐度的減少可能是參與新診斷T2DM 合并HUA 發(fā)生發(fā)展的相關(guān)因素。

因代謝性疾病發(fā)病早期與厚壁菌門、梭菌綱和梭菌目的豐度變化存在相關(guān)性［22］。在本研究中，DMUA 組與Control 組的腸道菌群對比中，其厚壁菌門減少，梭菌綱、梭菌目顯著減少，故推測DMUA組與Control 組之間存在的差異菌豐度的變化可能是導(dǎo)致新診斷T2DM 合并HUA 的發(fā)病因素之一。在使用LEFSe 方法的分析中未發(fā)現(xiàn)DMUA 組與T2DM組存在明顯差異菌，這可能與兩組患者的病程均較短有關(guān)，因本次試驗樣本量較少，后續(xù)可擴大樣本量進一步分析。

臨床資料對比中，新診斷T2DM 合并HUA 組比病程>5年組的低密度脂蛋白顯著升高（P=0.02），因在入組標(biāo)準(zhǔn)的用藥史中病史1～5年的患者單用二甲雙胍及病史>5 年的患者為單用二甲雙胍或二甲雙胍聯(lián)合基礎(chǔ)胰島素，考慮二甲雙胍對脂代謝存在一定的影響，且同時會受到年齡及性別等混雜因素的影響，后續(xù)可進一步增加對照組及擴大樣本量對相關(guān)指標(biāo)進一步分析。

綜上，DMUA 組所存在的腸道菌群豐度及組成的差異可能是新診斷T2DM 合并HUA 的發(fā)生及發(fā)展的重要影響因素之一。但由于腸道菌群復(fù)雜多樣，影響菌群因素眾多，本研究存在一定的局限性，仍需進一步擴大實驗樣本數(shù)量，可對影響的相關(guān)因素進一步細(xì)化，探索腸道菌群與新診斷T2DM 合并HUA之間的深層次關(guān)系，后續(xù)可對差異菌行代謝組學(xué)分析進一步了解細(xì)胞通路、能量傳遞等代謝途徑是否產(chǎn)生變化，以期探索新診斷T2DM合并HUA的診斷、預(yù)防及治療的方法。