基于CRISPR/Cas13a技術(shù)檢測腫瘤驅(qū)動基因TP53 R248W的研究

鄺振展，肖 斌，孫朝暉，羅 镕，何潔雯，李林海*

1中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510010；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院（清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院）檢驗醫(yī)學(xué)部，廣東 清遠(yuǎn) 511518；3廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗學(xué)院，廣東 廣州 510180；4廣州南方學(xué)院云康醫(yī)學(xué)與健康學(xué)院，廣東 廣州 510970

腫瘤蛋白53（tumor protein 53，TP53）是最重要的抑癌基因之一，其編碼蛋白P53 是胞內(nèi)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控P21、Bcl?2相關(guān)X蛋白（BCL2 asso?ciated X，BAX）等多種靶基因的表達(dá)水平，廣泛參與DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等多種重要進(jìn)程［1］。TP53 功能獲得性突變常導(dǎo)致其抑癌功能的喪失，如R273H、R175H、R248W 等，其中R248W突變不僅導(dǎo)致其抑癌功能喪失，還能夠促進(jìn)腫瘤惡性表型和侵襲，導(dǎo)致患者預(yù)后較差，而有研究發(fā)現(xiàn)阿霉素對攜帶TP53 R248W突變的患者治療更為敏感［2-3］。因此，對TP53 R248W 變異體的檢測不僅有助于預(yù)警腫瘤的發(fā)生發(fā)展，還能指導(dǎo)腫瘤的治療和用藥。目前，組織和血漿中TP53 R248W 的檢測手段主要有數(shù)字PCR、高通量測序、突變擴(kuò)增系統(tǒng)等。數(shù)字PCR 準(zhǔn)確度高，但成本高，對儀器和操作人員要求高；高通量測序靈敏度高但實驗流程復(fù)雜；突變擴(kuò)增系統(tǒng)操作簡單但穩(wěn)定性欠佳，所以亟需尋找一個新的靈敏度高、穩(wěn)定性好及成本低的腫瘤驅(qū)動基因檢測方法［4］。

成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白是近年來火爆的研究熱點，在RNA干擾和基因編輯等領(lǐng)域有著巨大的潛力［5］。其中，CRISPR 相關(guān)蛋白13a（CRISPR?associated protein 13a，Cas13a）是一種新發(fā)現(xiàn)的Ⅱ類、Ⅵ型Cas 效應(yīng)蛋白，其活性由高等真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合（higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide?bind?ing，HEPN）結(jié)構(gòu)域決定［6］。與Ⅱ型Cas9 不同，Cas13a 屬于RNA 酶分子，在CRISPR RNA（crRNA）的引導(dǎo)下，Cas13a 結(jié)合靶RNA，激活HEPN 結(jié)構(gòu)域，從而特異性水解靶RNA 及‘連帶剪切’周圍RNA 分子［7?8］，但當(dāng)Cas13a/crRNA 復(fù)合物與非靶RNA 結(jié)合時，Cas13a的RNA酶特性被抑制［9］。

本研究利用Over?lap PCR 技術(shù)，構(gòu)建TP53 R248W變異體質(zhì)粒作為檢測對象，設(shè)計特異性的靶標(biāo)crRNA，并根據(jù)Cas13a 蛋白的‘連帶剪切’特性，實現(xiàn)對TP53 基因R248W 突變的快速檢測，以期建立新的、快速、簡便以及靈敏的腫瘤驅(qū)動基因檢測方法，為腫瘤的治療及監(jiān)控提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

Cas13a 蛋白（M20201）、FAM 熒光探針（H2001?2023）和本研究設(shè)計的crRNA 購自于廣州博徠斯生物公司，所設(shè)計擴(kuò)增引物由威海四合生物公司合成，具體序列見表1。T7轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（JT101?01）、高保真DNA 聚合酶（AP231?13）、RNA 酶抑制劑（AI101?01）（北京全式金生物）。Top10 感受態(tài)細(xì)胞（B528412）（上海生工生物工程公司）。RAA試劑盒（TABAS03KIT）（TwistDx 生物公司，英國）。T4 連接酶（6022Q）、XhoⅠ限制酶（1094S）及KpnⅠ限制酶（1068S）（TaKaRa 公司，日本）。血漿DNA 提取試劑盒（D3182?03C）（Magen 生物公司，美國）。ABI 9700 PCR儀（賽默飛公司，美國）。熒光檢測儀（Bio?Rad 公司，美國）。TP53 野生型質(zhì)粒、pENTER 空載體由本課題組實驗室提供。

表1 突變株的構(gòu)建引物、RAA引物、crRNA序列和探針序列Table 1 Mutant strain primer，RAA primer，crRNA sequence and probe sequence

1.2 方法

1.2.1 TP53 R248W標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以野生型TP53質(zhì)粒為模板，使用TP53?F&Rm和Fm&TP53?R兩對引物分別擴(kuò)增TP53 R248W突變位點前后段序列，使擴(kuò)增前后段序列均攜帶有R248W點突變，然后進(jìn)行重疊（Over?lap）PCR將上述兩個片段融合。融合產(chǎn)物經(jīng)限制酶XhoⅠ和KpnⅠ雙酶切后，使用T4 連接酶將它與pENTER 載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Top10細(xì)胞，取菌液進(jìn)行測序鑒定。

1.2.2 PCR或RAA擴(kuò)增TP53 R248W變異體

本研究使用兩對擴(kuò)增引物Primer1（R248W?RAA?F&R248W?RAA?R1）和Primer2（R248W?RAA?F&R248W?RAA?R2），利用PCR 或重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增技術(shù)（recombinase aided amplification，RAA）擴(kuò)增技術(shù)，按說明書指導(dǎo)擴(kuò)增出含TP53 R248W 突變序列片段。PCR 的擴(kuò)增體系如下：TP53 R248W 質(zhì)粒（1 μmol/L）1 μL，前、后引物混合物（10 μmol/L）2 μL，高保真聚合酶混合物25 μL，純水22 μL。將上述試劑充分混勻后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 的擴(kuò)增程序如下：98 ℃預(yù)熱5 min，然后98 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃30 s，循環(huán)40 次，最后72 ℃孵育10 min。RAA的擴(kuò)增體系如下：TP53 R248W質(zhì)粒（1 μmol/L）1 μL，前、后引物混合物2 μL，RAA反應(yīng)液29.5 μL，MgCl22.5 μL，純水15 μL。將上述試劑充分混勻后，加入RAA干粉管中，然后39 ℃孵育20 min。

1.2.3 CRIPSR/Cas13a 方法對TP53 R248W變異體檢測

對步驟1.2.2 的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，體系如下：擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，crRNA（1 μmol/L）1 μL，Cas13a蛋白（10 μmol/L）1 μL，熒光探針（10 μmol/L）1 μL，T7轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，T7 buffer（5×）4 μL，NTP 2 μL，無RNA酶純水補足反應(yīng)體系至20 μL，混勻后置于Bio?Rad CFX 熒光檢測儀，37 ℃檢測1 h，記錄各時間段的相對熒光值（relative fluorescence unit，RFU）。

1.2.4 CRIPSR/Cas13a檢測體系中crRNA濃度的優(yōu)化

將crRNA 梯度稀釋成5 個濃度，使檢測反應(yīng)體系中的crRNA 終濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 μmol/L。除crRNA 外，CRIPSR/Cas13a 檢測反應(yīng)體系如步驟1.2.3。

1.2.5 CRIPSR/Cas13a 方法對不同突變率TP53 R248W的檢測

將濃度為1×103、1×104、1×105、1×106拷貝數(shù)（copies）/μL的TP53 R248W質(zhì)粒分別與1×107copies/μL的TP53 野生株混合1∶1 混合，形成突變頻率為0.01%、0.1%、1%、10%，取2 μL混合物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用上述優(yōu)化的CRIPSR/Cas13a方法進(jìn)行檢測。

1.2.6 CRIPSR/Cas13a方法對模擬血漿ctDNA的檢測

將濃度為1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108copies/μL 的TP53 R248W 質(zhì)粒取1 μL 分別與1 mL 經(jīng)基因檢測無TP53 突變的人血漿混合，構(gòu)建TP53 R248W 突變基因濃度分別為1×100、1×101、1×102、1×103、1×104、1×105copies/μL的模擬血漿。使用血漿DNA提取試劑盒，按說明書操作提取模擬血漿ctDNA，取2 μL 模擬血漿ctDNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，隨后使用上述優(yōu)化的CRIPSR/Cas13a方法進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料經(jīng)K?S正態(tài)性檢驗，若呈正態(tài)分布，采用方差分析或者t檢驗，若呈偏態(tài)分布，采用非參數(shù)Mann?Whit?neyU檢驗。計數(shù)資料用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TP53 R248W變異體質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)PCR 點突變技術(shù)，利用兩對攜帶TP53 R248W（C>T）點突變的引物，將TP53野生型序列擴(kuò)增成前后2個片段，這兩片段均含有突變位點序列，以及前段的3′端及后段5′端存在互補序列（圖1A），然后使用Over?lap PCR 將2個基因片段融合成完整的TP53 R248W 變異體（圖1B），經(jīng)與pENTER 質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化入Top10 感受態(tài)，測序結(jié)果顯示TP53 R248W變異體質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 TP53 R248W突變株構(gòu)建電泳結(jié)果與測序結(jié)果Figure 1 The result of electrophoresis and sequencing of TP53 R248W mutant strain

2.2 CRISPR/Cas13a 聯(lián)合PCR 或RAA技術(shù)檢測TP53 R248W突變株

根據(jù)TP53 R248W變異體序列設(shè)計兩對擴(kuò)增引物（Primer 1和Primer 2）。對于Primer 1和Primer 2，PCR 和RAA 技術(shù)均成功擴(kuò)增出約110 bp 和368 bp的片段（圖2A）。使用CRISPR/Cas13a 方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明，在10 min內(nèi)，各組RFU值均達(dá)到平臺期，但基于Primer 1 擴(kuò)增的片段，TP53 R248W變異體的RFU 值與野生型相比無顯著性差異（P>0.05）；而基于Primer 2 擴(kuò)增的片段，變異體的RFU值顯著高于野生型（P<0.001，圖2B、C）。

圖2 Primer1和Primer2擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果及CRISPR/Cas13a檢測結(jié)果Figure 2 The result of electrophoresis and CRISPR/Cas13a for Primer1 and Primer2 amplification product

2.3 不同濃度crRNA對TP53 R248W變異體檢測結(jié)果的影響

為了探究不同濃度的crRNA對TP53 R248W變異體檢測結(jié)果的影響，對crRNA 進(jìn)行了梯度濃度稀釋，并分別進(jìn)行CRISPR/Cas13a檢測。結(jié)果表明，在0.05～0.25 μmol/L 范圍內(nèi)，隨著crRNA 濃度的增加，RFU值也隨之增大，其中crRNA濃度達(dá)到0.20 μmol/L及以上時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），表明crRNA 濃度的上升會提高TP53 R248W 變異體的檢測強(qiáng)度（圖3）。

圖3 不同濃度crRNA對CRISPR/Cas13a檢測強(qiáng)度的影響Figure 3 The effect of different crRNA concentrations for CRISPR/Cas13a detection

2.4 CRISPR/Cas13a 檢測不同突變頻率的TP53 R248W

為探究CRISPR/Cas13a方法對不同突變頻率的TP53 R248W 的檢測效果，通過按比例混合TP53 野生型和R248W變異體質(zhì)粒，獲得了不同突變頻率的變異體。以混合質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增含突變位點的序列片段（圖4A）。使用CRISPR/Cas13a 技術(shù)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示，不同突變頻率的變異體檢測結(jié)果RFU 值顯著高于野生型，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中，本研究方法最低可以檢測出突變頻率為0.01%的混合質(zhì)粒（含有1×103copies 的變異體），表明TP53 基因野生型的存在基本不影響TR248W變異體的檢出（圖4B）。

圖4 CRISPR/Cas13a對不同突變頻率TP53 R248W的檢測Figure 4 CRISPR/Cas13a detection to different mutation frequency of TP53 R248W

2.5 CRISPR/Cas13a對模擬血漿ctDNA的檢測

為探究CRISPR/Cas13a 技術(shù)對模擬血漿ctDNA的檢測效果，以模擬血漿ctDNA 為模板，擴(kuò)增含突變位點的序列片段（圖5A）。使用CRISPR/Cas13a技術(shù)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示，當(dāng)血漿中的TP53 R248W 變異體濃度達(dá)到1×104copies/μL，其RFU 值明顯高于野生型血漿，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明本研究方法最低能檢測出模擬血漿中濃度為1×104copies/μL的TP53 R248W變異體（圖5B）。

圖5 CRISPR/Cas13a對模擬血漿ctDNA的檢測Figure 5 CRISPR/Cas13a detection to mimic plasma ctDNA

3 討論

Cas13a 蛋白在體外具有RNA 酶活性，因此，研究者探索了其在病原微生物核酸檢測及基因分型中具有潛在的應(yīng)用價值［10-12］。Gootenberg 等［13］通過對Cas13a 蛋白、RNA熒光探針及側(cè)向?qū)游鲈嚰埖穆?lián)合使用，成功對登革熱或和寨卡病毒單鏈RNA進(jìn)行了檢測。Fozouni 等［14］為提高Cas13a 蛋白對SARS?CoV?2 病毒核酸檢測的靈敏度，在同一反應(yīng)中使用多個crRNA，并且通過一個手持小型設(shè)備，實現(xiàn)快速便攜地獲取結(jié)果。Ke 等［15］為降低Cas13a 蛋白的脫靶效應(yīng)，在crRNA 的3′末端添加發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并將改進(jìn)的技術(shù)成功應(yīng)用在乙肝病毒DNA 的分型。本文探究了CRISPR/Cas13a 技術(shù)可否對多態(tài)性核酸（如TP53 R248W）進(jìn)行鑒別，從而為腫瘤驅(qū)動基因的檢測提供新的幫助。

本研究設(shè)計了兩對擴(kuò)增引物Primer1和Primer2，其擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為110 bp和368 bp。結(jié)果顯示CRISPR/Cas13a 技術(shù)不能檢測Primer1 的擴(kuò)增產(chǎn)物，而可以有效檢測Primer2 的擴(kuò)增產(chǎn)物，說明靶RNA長度可能影響CRISPR/Cas13a 的的檢測效能，推測是較短的靶標(biāo)RNA 與Cas13a/crRNA 形成的復(fù)合物所獲得的自由能不能激活Cas13a的RNA酶活性［15］。

為了探究不同擴(kuò)增方法對CRISPR/Cas13a技術(shù)的影響，本研究使用了PCR 和RAA 兩種擴(kuò)增技術(shù)。結(jié)果表明CRISPR/Cas13a檢測結(jié)果沒有因擴(kuò)增方法不同而顯示出差異。一般而言，RAA方法不需要專用的儀器，實驗時間短，大多30 min內(nèi)可完成擴(kuò)增，但目前測試價格比較昂貴；PCR 需要專用的PCR儀，實驗所需時間長，但價格相比RAA 便宜［16］。目前，腫瘤驅(qū)動基因檢查對結(jié)果報告時間沒有太高的要求，因此擴(kuò)增技術(shù)可以選用更為便宜的PCR方法。

據(jù)報道，crRNA的間隔序列在重復(fù)序列的3′端，且長度為28 nt時，功能發(fā)揮最佳［17］，因此，本研究的crRNA間隔序列也設(shè)計在重復(fù)序列的3′端且長度為28 nt，并通過CRISPR/Cas13a 檢測結(jié)果證實了這一結(jié)論。同時報道稱，當(dāng)crRNA與靶RNA結(jié)合出現(xiàn)堿基配對錯誤時，Cas13a 依舊具有RNA 酶活性，這對多態(tài)性 單核苷酸（single nucleotide polymorphism，SNP）的鑒定造成了干擾［18］。因此，本研究將R248W 突變堿基設(shè)計在crRNA 的間隔序列的5′末端，并引入新的錯配堿基C，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)crRNA 的間隔序列的5′末端與野生型RNA之間有兩個錯配堿基，而與變異體RNA 之間只有一個錯配堿基時，可以有效地區(qū)分野生型和變異體。另外，本研究發(fā)現(xiàn)crRNA 濃度與CRISPR/Cas13a 檢測強(qiáng)度呈正相關(guān)，在0.05～0.25 μmol/L 范圍內(nèi)，crRNA 濃度越高，CRISPR/Cas13a檢測強(qiáng)度越大。

通過混合TP53 野生型和R248W 變異體，構(gòu)建了不同突變頻率的TP53 R248W 變異體，結(jié)果顯示CRISPR/Cas13a 方法最低可檢出突變頻率為0.01%的TP53 R248W 變異體（1×103copies），與同類型報道檢測的靈敏度相當(dāng)［13］。最后，通過對模擬血漿ctDNA的檢測，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas13a檢測方法可以在血漿中檢測出濃度為1×104copies/μL的TP53 R248W變異體，為下一步臨床樣本的檢測提供重要依據(jù)。

綜上所述，本研究建立的CRISPR/Cas13a檢測方法能夠快速、靈敏且高效地檢出TP53 R248W 變異體，有效區(qū)分TP53 R248W 變異體與TP53 野生型，從而為TP53 R248W突變腫瘤的診斷及治療提供極大幫助。另外，本研究建立的方法學(xué)也可應(yīng)用于其他腫瘤驅(qū)動基因變異體的檢測，從而為腫瘤基因檢測提供了新的、多樣性的技術(shù)手段。