小麥TaCTSB基因在小麥-條銹菌互作中的功能研究

蔣 軍，岳明星，於立剛，康振生，王曉杰，湯春蕾

(西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室,陜西楊凌 712100)

小麥(L.)是世界各地廣泛種植的糧食作物。減少小麥生長過程中的各種生物和非生物脅迫可為中國乃至全世界的糧食生產(chǎn)提供有力的保證。目前，小麥條銹病已成為限制小麥生產(chǎn)的最大生物威脅，影響著全球糧食安全。小麥條銹病是由小麥條銹菌(f. sp.，)侵染小麥所引起的病害，解析小麥條銹菌的致病機理，挖掘抗病相關(guān)基因?qū)﹂_發(fā)病害防控新策略和持久綠色防控小麥條銹病具有重要意義。

組織蛋白酶B(cathepsin B,CTSB) 屬于木瓜蛋白酶家族，為五大蛋白酶家族之一，是一種具有水解特性的半胱氨酸蛋白酶，其催化作用主要由半胱氨酸和組氨酸兩種氨基酸來實現(xiàn)，在溶酶體降解蛋白質(zhì)途徑中發(fā)揮著必不可少的作用，使蛋白質(zhì)的合成與降解保持動態(tài)平衡。凡對植物細(xì)胞有損傷的生物和非生物脅迫都會誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)的發(fā)生。抑制基因的表達(dá)則可有效抑制PCD的發(fā)生。Hazel等研究發(fā)現(xiàn)，煙草細(xì)胞中CTSB蛋白參與植物的過敏性壞死反應(yīng)(hypersensitive response,HR)，且植物HR過程伴隨著PCD的發(fā)生，同時在衰老過程中起正調(diào)節(jié)作用，而突變體則導(dǎo)致衰老延遲。Raquel等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥種子萌發(fā)過程中，基因在維管中表達(dá)，對維管PCD的發(fā)生起著重要作用。Cai等也發(fā)現(xiàn)，CTSB蛋白在擬南芥中參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的PCD。

以上研究均表明，CTSB蛋白在植物生長過程中起重要作用，但目前對小麥中CTSB蛋白的研究報道較少。因此，本研究對小麥基因在小麥-條銹菌互作過程中的表達(dá)模式進行分析，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時表達(dá)體系對基因的亞細(xì)胞定位和植物壞死情況等進行研究，并利用VIGS技術(shù)初步了解基因在小麥-條銹菌互作過程中的功能，以期深入解析小麥與條銹菌互作的分子機理。

1 材料與方法

1.1 植物材料

煙草品種為本氏煙，培養(yǎng)條件為光照16 h/黑暗8 h，溫度為20 ℃；小麥品種是水源11(含抗條銹病基因)，均由旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室提供，培養(yǎng)條件為光照16 h/黑暗 8 h,溫度為16 ℃。中國小麥條銹菌生理小種CYR31和CYR23均由本實驗室保存。水源11對CYR31為全感型品種。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥基因的克隆

以pCAMBIA1302(含有GFP標(biāo)簽)為表達(dá)載體，酶切位點為Ⅰ和Ⅰ。利用Primer 5軟件設(shè)計基因的一步克隆引物pCAMBIA1302-TaCTSB-F/R，小麥葉片cDNA的合成參照郭雙元等的方法，PCR反應(yīng)以條銹菌CYR31侵染的小麥葉片cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括2×Taq Mix(Takara，大連)20 μL，pCAMBIA1302-TaCTSB-F/R各 1 μL， cDNA模板2 μL，ddHO 16 μL。PCR反應(yīng)程序：96 ℃ 3.5 min； 95 ℃ 45 s，55 ℃ 40 s， 72 ℃ 30 s，33個循環(huán)； 72 ℃ 5 min。用膠回收試劑盒(美基，廣州)回收目標(biāo)條帶，使用ClonExpressOne Step Cloning Kit試劑盒(諾唯贊，南京)將回收產(chǎn)物連接至載體pCAMBIA1302上，獲得pCAMBIA1302-載體，以通用引物pCAMBIA1302-F/R進行測序(表1)，將測序結(jié)果與基因序列用DNAMAN軟件進行比對。比對結(jié)果正確的載體保存于-20 ℃ 冰箱，備用。用MultAlin在線軟件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)進行同源序列比對。用Signalp 5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalp/)在線軟件預(yù)測基因編碼蛋白的信號肽。

1.2.2基因的表達(dá)模式分析

待小麥水源11的幼苗長至二葉一心期，分別接種小麥條銹菌CYR31和CYR23，在0、6、12、18、24、48、120和168 h時間點采集葉片樣品，使用RNA提取試劑盒(美基，廣州)提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

選取基因中的特異性片段(280 bp)，用Primer 5軟件設(shè)計定量引物TaCTSB-qRT-F/R(表1)，以小麥持家基因延伸因子為內(nèi)參，參照郭雙元等的方法進行qRT-PCR分析。

表1 本研究所用的引物

1.2.3 TaCTSB蛋白的煙草亞細(xì)胞定位

使用1.2.1中構(gòu)建完成的pCAMBIA1302-載體進行亞細(xì)胞定位，以pCAMBIA1302-載體為對照，參照Cheng的方法將pCAMBIA1302-載體和pCAMBIA1302-載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101。轉(zhuǎn)化完成后倒置于30 ℃ 培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)3 d，挑取單克隆進行菌落PCR檢測。菌落PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括2×Taq Mix(Takara，大連)7.5 μL；pCAMBIA1302-TaCTSB-F/R各1 μL；ddHO 5.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 2 min。將PCR檢測條帶大小正確的單克隆菌落轉(zhuǎn)至含有100 mg·L卡那霉素和50 mg·L利福平的LB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床中，200 rpm搖培8 h至菌液渾濁后，參照趙聰聰?shù)鹊姆椒ㄟM行農(nóng)桿菌菌液處理，將OD=0.6的農(nóng)桿菌菌液注射到本氏煙煙草葉片中。使用Olympus BX-51共聚焦顯微鏡觀察TaCTSB蛋白的定位情況。由于TaCTSB蛋白含有信號肽，可能會分泌到細(xì)胞外，為了驗證其是否能分泌到胞外發(fā)揮作用，利用30%的NaCl溶液使煙草細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離后，再次觀察熒光分布情況。

1.2.4誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死功能分析

將pCAMBIA1302-、pCAMBIA1302-、pCAMBIA1302-和pCAMBIA1302空載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101中，參照1.2.3中農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)方法和處理方法，將OD=0.6的農(nóng)桿菌菌液注射在同一煙草葉片的不同部位，4 d后拍照，隨后浸泡在無水乙醇中脫色48 h，脫色期間更換 3～4次無水乙醇，脫色完成后再次拍照。試驗以pCAMBIA1302-和pCAMBIA1302空載體作為陰性對照，以pCAMBIA1302-為陽性對照。

1.2.5 VIGS技術(shù)瞬時沉默

用Primer 5軟件設(shè)計特異引物TaCTSB-γ-F/R(表1)，用與1.2.1中相同的載體構(gòu)建方法將目的基因片段連接至經(jīng)I和I雙酶切后的BSMV-γ載體上。用HⅡ?qū)SMV-γ-、BSMV-γ-載體進行線性化；用I對BSMV-α、BSMV-γ載體進行線性化；用I對β載體進行線性化，用RiboMAXTM Large Scale RNA Production System-T7(Promega，美國)將線性化產(chǎn)物進行體外轉(zhuǎn)錄。各取0.5 μL的BSMV-α、BSMV-β載體分別與0.5 μL的BSMV-γ、BSMV-γ∶和BSMV-γ∶按1∶1∶1混合，再加入8.5 μL FES buffer混勻后，在二葉一心期小麥的第二葉正面，接種重組病毒BSMV:、BSMV:00(陰性對照)及BSMV:(陽性對照)。接種病毒后10 d觀察病毒癥狀，在癥狀明顯的小麥第四葉上分別接種小麥條銹菌CYR31和CYR23。采集接種24和120 h兩個時間點的樣品，用于檢測沉默效率。同時采集這兩個時間點的組織樣品，用于組織細(xì)胞學(xué)觀察。接種條銹菌后二周左右觀察產(chǎn)孢情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaCTSB基因的序列特征分析

基因的CDS序列全長為1 035 bp(GenBank：XM_037573272.1:87-1118)，編碼344個氨基酸。SignalP 5.0分析結(jié)果表明，TaCTSB蛋白N端具有信號肽結(jié)構(gòu)，含有19個氨基酸。在小麥基因組數(shù)據(jù)庫中，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，基因在小麥染色體4A、4B和4D染色體上的DNA序列相似度非常高，其中4A與4B染色體的相似度為97.1%，4B與4D染色體的相似度為98.3%。本試驗克隆所獲得的基因CDS序列為小麥染色體4B染色體上的序列。

2.2 條銹菌侵染小麥過程中TaCTSB基因的表達(dá)模式

qRT-PCR結(jié)果(表2)顯示，無毒性小種CYR23接種小麥后，與接種0 h相比，基因在接種24 h極顯著上調(diào)，在接種48 h顯著下調(diào)，其他時間點的表達(dá)量與接種0 h無顯著差異。毒性小種CYR31接種小麥后，與接種0 h相比，基因在接種18 h顯著下調(diào)，其他時間點的表達(dá)量與接種0 h無顯著差異。說明基因受條銹菌誘導(dǎo)表達(dá)，并在小麥抗條銹菌過程中發(fā)揮一定作用。

表2 TaCTSB基因在小麥與條銹菌互作中的表達(dá)模式

2.3 TaCTSB蛋白的亞細(xì)胞定位

將pCAMBIA1302-重組載體在煙草葉片細(xì)胞中瞬時表達(dá)，以注射含有pCAMBIA1302-載體菌液的葉片作為對照，結(jié)果(圖1A)顯示，含pCAMBIA1302-的細(xì)胞中在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核均可觀察到綠色熒光，而含pCAMBIA1302-的細(xì)胞中僅在細(xì)胞膜附近可觀察到綠色熒光。質(zhì)壁分離后發(fā)現(xiàn)，pCAMBIA1302-的綠色熒光定位于細(xì)胞內(nèi)，而pCAMBIA1302-的綠色熒光主要分布于細(xì)胞外(圖1B)，說明TaCTSB蛋白能分泌至細(xì)胞外，定位于煙草質(zhì)外體。

A：質(zhì)壁分離前；B：質(zhì)壁分離后。黃色和紅色箭頭分別代表胞外和胞內(nèi)。

2.4 TaCTSB蛋白誘導(dǎo)煙草葉片細(xì)胞的壞死情況

為研究TaCTSB蛋白是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，利用農(nóng)桿菌侵染試驗在煙草葉片中瞬時表達(dá)pCAMBIA1302-，4 d后觀察表型并拍照。以pCAMBIA1302-為陰性對照，以pCAMBIA1302-為陽性對照。結(jié)果(圖2)顯示，接種pCAMBIA1302-的部位沒有出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，而接種pCAMBIA1302-的部位與接種pCAMBIA1302-的部位觀察到壞死現(xiàn)象(圖2A)，使用無水乙醇脫色后能更明顯地觀察到壞死現(xiàn)象(圖2B)。說明TaCTSB能夠誘導(dǎo)煙草細(xì)胞壞死。

A：用無水乙醇脫色前；B：用無水乙醇脫色后。a：pCAMBIA1302-TaCTSB；b：pCAMBIA1302-Bax(陽性對照)；c：pCAMBIA1302(陰性對照)；d：pCAMBIA1302-eGFP(陰性對照)。

2.5 VIGS技術(shù)瞬時沉默TaCTSB后的小麥葉片表型

為解析是否能夠影響小麥對條銹菌的抗病性，利用大麥條紋花葉病毒(BSMV)介導(dǎo)的VIGS技術(shù)瞬時沉默。在小麥第二葉分別接種重組病毒BSMV:、BSMV:00和BSMV:，于10 d后觀察病毒癥狀，發(fā)現(xiàn)接種BSMV:的葉片出現(xiàn)明顯的光漂白現(xiàn)象，表明接毒成功(圖3A)。

接種病毒后10 d在小麥第四葉上分別接種條銹菌毒性小種CYR31和無毒性小種CYR23，12～14 d后觀察產(chǎn)孢情況。結(jié)果顯示，接種CYR31的試驗組BSMV:與對照組BSMV:00產(chǎn)孢情況基本相同(圖3A)，說明在親和體系中，沉默對小麥條銹菌侵染寄主植物的影響不明顯。接種CYR23后觀察表型發(fā)現(xiàn)，對照組BSMV:00出現(xiàn)明顯壞死癥狀，而試驗組BSMV:有零星孢子堆出現(xiàn)(圖3A)，說明沉默使小麥的抗病性減弱。

為確定目的基因的沉默效率，在接種后24和120 h取樣，qRT-PCR結(jié)果(圖3B)顯示，接種毒性小種CYR31的葉片上，的表達(dá)量分別下降了42%和52%；接種無毒性小種CYR23的葉片上，的表達(dá)量分別下降了39%和70%，差異均達(dá)到顯著水平。這表明已經(jīng)被部分沉默，觀察到的表型變化是由沉默所引起的。

A：接種病毒后的病毒癥狀以及沉默葉片接種條銹菌CYR31和CYR23的表型；B：在沉默TaCTSB植株上檢測親和體系和非親和體系的沉默效率，*表示相同時間二者差異顯著(P<0.05)。

進一步對接種CYR23后24和120 h的小麥葉片進行組織細(xì)胞學(xué)觀察，統(tǒng)計小麥葉片活性氧面積、壞死面積以及條銹菌菌絲長度和菌落面積，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，與對照組BSMV:00相比，接種BSMV:病毒的葉片細(xì)胞中活性氧面積和壞死面積在接種后24和120 h均顯著降低，條銹菌菌絲長度和菌落面積在接種后120 h顯著增加，進一步說明了沉默降低了小麥對條銹菌的抗性，促進了條銹菌的生長發(fā)育。

SV：氣孔下囊。圖6同。

圖5 接種條銹菌CYR23后沉默TaCTSB植株上的壞死情況

IH：初生菌絲；H：吸器。

表3 接種CYR23后小麥葉片的組織細(xì)胞學(xué)觀察統(tǒng)計

3 討 論

小麥條銹菌作為活體營養(yǎng)寄生真菌，侵染過程中通過形成吸器侵入寄主細(xì)胞，并且通過吸器將效應(yīng)蛋白分泌到宿主細(xì)胞中，以此為媒介參與寄主的物質(zhì)交換和信息交流。在此過程中，植物會表達(dá)一系列抗病相關(guān)基因以抵抗條銹菌侵入，明確在小麥-條銹菌互作過程中發(fā)揮功能的抗病相關(guān)基因，對防治小麥條銹病意義重大。

CTSB最早發(fā)現(xiàn)于動物細(xì)胞的溶酶體中，隨后陸續(xù)在多種細(xì)胞器中被發(fā)現(xiàn)(如溶酶體、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)外體)，其參與生物的多種病理反應(yīng)，尤其是在維持蛋白合成與降解的動態(tài)平衡中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在動物PCD過程中，CTSB通常從溶酶體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中；而植物CTSB則分泌到質(zhì)外體中，在分泌時被激活。本研究進行煙草亞細(xì)胞定位與質(zhì)壁分離觀察，發(fā)現(xiàn)TaCTSB蛋白能夠分泌到煙草細(xì)胞質(zhì)外體中，這與前人的研究結(jié)果一致，但其分泌至胞外后將如何發(fā)揮其作用，仍待進一步研究。

在煙草中抑制CTSB蛋白的活性及沉默基因的表達(dá)，可抑制非宿主細(xì)菌誘導(dǎo)的HR反應(yīng)，削弱煙草的非寄主抗性，最終導(dǎo)致植物抗病性減弱，表明基因參與了植物非寄主抗性相關(guān)的PCD過程。同時，基因的基因表達(dá)能夠減弱馬鈴薯和晚疫病菌基因瞬時共表達(dá)引起的HR反應(yīng)，表明CTSB蛋白在病菌效應(yīng)蛋白介導(dǎo)的與免疫相關(guān)的HR反應(yīng)過程中也具有重要作用。本研究利用VIGS技術(shù)瞬時沉默小麥基因，導(dǎo)致小麥葉片活性氧面積和細(xì)胞壞死面積下降，削弱了小麥的抗病性，揭示了基因在小麥抗條銹病中的正調(diào)控作用，這為創(chuàng)制持久抗病材料奠定了堅實 基礎(chǔ)。