AAV基因治療藥物生產(chǎn)車間工藝設計探討及案例分析

羅賢宇

（中國電子系統(tǒng)工程第二建設有限公司武漢分院， 武漢 430012)

近年來，隨著國外基因治療產(chǎn)品陸續(xù)獲批上市，國內(nèi)基因治療企業(yè)持續(xù)投入研究，在國家相關產(chǎn)業(yè)政策大力支持下，國內(nèi)基因治療市場規(guī)模迅速增長，迅速擴大的市場規(guī)模衍生出充足的基因治療產(chǎn)品研發(fā)需求，為CDMO企業(yè)發(fā)展提供廣闊空間?；蛑委熕幬颎MP車間的設計和建設也將迎來巨大的市場，目前國內(nèi)對于此類新型藥物的GMP車間設計尚未頒布正式的法規(guī)，設計中存在不同的見解，特別是對于涉及生物安全多樣的AAV基因治療藥物車間，如何做好良好的工藝設計是行業(yè)的一個熱議話題。

1 AAV工藝生產(chǎn)流程

AAV生產(chǎn)工藝主要有質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293系列細胞和桿狀病毒轉(zhuǎn)染昆蟲細胞兩種，本文主要討論質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞的工藝路徑。生物原液生產(chǎn)工藝流程描述如 下：

（1）種子復蘇；（2）細胞擴增；（3）生物反應器培養(yǎng)；（4）生物反應器轉(zhuǎn)染；（5）深層過濾；（6）超濾濃縮；（7）層析1；（8）層析2；（9）置換緩沖液；（10）除菌過濾。

2 生物安全分析

2.1 生物安全定級

本項目涉及到的生物活性物質(zhì)主要有293細胞，質(zhì)粒、AAV病毒，根據(jù)《中華人民共和國藥典》（2020版三部）、《人間傳染的病原微生物名錄》、《NIH_Guidelines for Research lnvolving Recombinant DNA Molecules》、ATCC等規(guī)定[1-3]，就高不就低的原則，293細胞生物安全等級為BSL-2，質(zhì)粒生物安全等級為BSL-1、AAV病毒生物安全等級為BSL-2。

2.2 生物安全防護措施

生物安全主要防護措施，根據(jù)國內(nèi)外不同的法規(guī)要求[4-11]，對比主要的硬件設計要求差異，結(jié)合AAV基因治療藥物生產(chǎn)車間的特點（車間涉及大量病毒培養(yǎng)，且存在局部暴露操作），同時考慮防止產(chǎn)品交叉污染的問題，建議對生產(chǎn)車間設計防護措施如表1所示。

表1 AAV基因治療藥物生產(chǎn)車間生物安全防護要求Tab.1 Biosafety protection requirements of AAV gene therapy drug production workshop

3 車間功能區(qū)劃及人物流組織

3.1 主要功能間的劃分

原液車間主要功能間劃分：根據(jù)工藝流程將（1）種子復蘇和（2）細胞擴增等有直接細胞暴露操作的功能作為第一個功能間（接種間），同時接種間還兼有建庫功能；將（3）生物反應器培養(yǎng)、（4）生物反應器轉(zhuǎn)染、（5）深層過濾等在生物反應器中密閉培養(yǎng)轉(zhuǎn)染，且同空間內(nèi)存在細胞和病毒的功能作為第二個功能間（擴增間）；將（6）超濾濃縮、（7）層析1、（8）層析2，等一系列有病毒純化操作的下游純化工藝作為第三個功能間（粗純間）；將（9）置換緩沖液（10）除菌過濾等最后一步超濾及原液灌裝作為第四個功能間（精純間）。主要功能間劃分見圖1。

圖1 工藝流程框圖Fig.1 Process flow diagram

3.2 主要功能間布局及工藝流線

生物原液生產(chǎn)車間功能間布局有多種模式，基于AAV生產(chǎn)從起始物料到最終原液均含有生物活性物質(zhì)，且種類多，為避免不同產(chǎn)品和批次之間的交叉污染，參考法規(guī)的要求[12-13]，對于涉及暴露操作的功能間，每個功能間僅同時允許存在一個批次的產(chǎn)品進行生產(chǎn)，不同功能間之間需要采取有效的措施（如密封轉(zhuǎn)移、房間壓差控制、不得跨越房間操作、人員不得交叉走動、滅菌與消毒、單向流傳遞等），避免物料、產(chǎn)品和廢棄物的差錯和混淆。在設計中考慮使用雙走道模式，對于主要生產(chǎn)功能間設置進入走道和退出走道，人物進出均實施嚴格單向流動，人員物料均從進入走道進入功能間，接觸過活性物質(zhì)的人、器具、污物、潔具等均從退出走道集中退出，經(jīng)過退更、高溫滅活、化學滅活等措施退出生產(chǎn)車間。具體的功能間分區(qū)及人物流組織見示意圖2。

圖2 功能間分區(qū)及人物流Fig.2 Functional zoning and process flows

3.3 潔凈區(qū)的劃分

中國和歐盟潔凈區(qū)分級為：一般生產(chǎn)區(qū)，D級潔凈區(qū)（靜態(tài)ISO 8級，動態(tài)無要求）、C級潔凈區(qū)（靜態(tài)ISO 7級，動態(tài)ISO 8級）、B級潔凈區(qū)（靜態(tài)ISO 5級，動態(tài)ISO 7級）、A級潔凈區(qū)（靜態(tài)ISO 5級，動態(tài)ISO 5級）。美國FDA生物制品潔凈分區(qū)為：NC區(qū)（Unclassified）、CNC區(qū)（Controlled Not Classified）、ISO 8級區(qū)（動態(tài)）、動態(tài)ISO 7級區(qū)（動態(tài)）、ISO 5級區(qū)（動態(tài)）。按從嚴考慮的原則，根據(jù)中國GMP、歐盟GMP和美國FDA的cGMP要求綜合考慮[14]，本項目的潔凈區(qū)分級分為：NC區(qū)、CNC區(qū)、D級潔凈區(qū)、C級潔凈區(qū)、A級潔凈區(qū)。

3.4 人員凈化策略

結(jié)合本次項目實況，采用嚴格單向流布局，更衣人員單向流動，更衣策略如下：

人員從室外NC區(qū)進入車間，在總更區(qū)進行更鞋、脫外衣、穿CNC工作服，經(jīng)過CNC走廊，進入潔凈區(qū)更衣間；在潔凈區(qū)一更更鞋、洗手，二更不脫衣，直接套穿潔凈工作服，手消后進入潔凈生產(chǎn)區(qū)，退出潔凈區(qū)時脫去潔凈工作服，保留CNC工作服退到CNC區(qū)。

3.5 物品凈化策略

為防止生產(chǎn)過程中造成交叉污染，應設置獨立的物流進入生產(chǎn)區(qū)域的入口，避免與人流交叉。對原輔料、設備備件、器具、衣物以及設備安裝及檢修等走向應作合理規(guī)劃。潔凈室使用的原輔料、包裝材料和其他物品入口應設置物料凈化用室或設施；進入無菌潔凈室的原輔料、包裝材料和其他物品還應在入口設置滅菌設施。

3.6 產(chǎn)品退出策略

各產(chǎn)品在潔凈區(qū)的物料傳遞手段同原輔料流向的處理手段相當。值得注意的是，部分成品退出涉及到產(chǎn)品表面附著有生物活性物質(zhì)，直接退出可能會污染其他無生物活性物質(zhì)區(qū)域，所以產(chǎn)品退出時結(jié)合產(chǎn)品的特性具體考量，采用消毒液擦拭滅活或VHP滅活對表面的活性物質(zhì)進行滅活。

3.7 污物退出策略

各生產(chǎn)區(qū)產(chǎn)生的帶生物活性的物品（包括廢棄污物、衣物、潔具、器具支撐桶等）經(jīng)過雙扉濕熱滅菌柜或雙扉VHP滅菌柜進行滅活，滅活后移出生產(chǎn)區(qū)。無生物活性的污物可通過潔凈傳遞窗傳出，或者通過物流氣閘逆向退出。

4 實際案例分析

4.1 功能區(qū)劃及人物流組織

圖3為功能區(qū)劃及人、物流組織示意圖。

圖3 A車間功能區(qū)劃及人、物流組織Fig.3 Functional zoning and process flows

功能區(qū)劃：本項目一層為AAV原液車間，層高5.5 m，面積約為1 200 m2，車間東北角為設置為人、流入口，西北角設置為物流入口，西南角設置為污物出口，在車間整體布局上實現(xiàn)人流、物流、污物流空間上互不交叉，減少人物流的交叉污染。北面作為空調(diào)、空壓、制水、強電、弱電、水管井、氣瓶間、衛(wèi)生間等NC輔助區(qū)的布置；西面為發(fā)電機房、滅活間、廢棄物間等NC輔助區(qū)布置；NC區(qū)的人員均從室外進入，無需從CNC進入，避免工程操作人員進機房檢修對生產(chǎn)操作區(qū)造成影響；東面為辦公總更等輔助區(qū)布置。

人員流向設計：人員從東北角的人廳進入車間，上完衛(wèi)生間后，在辦公區(qū)域放下個人物品，通過總更衣?lián)Q上CNC工作服進入CNC區(qū)，再通過潔凈更衣進入潔凈輔助支持區(qū)，之后人員通過人氣閘進入各個工藝功能間的生產(chǎn)崗位，操作完的人員通過退出氣閘退到統(tǒng)一的退出走道，再通過退更間去除身上攜帶活性物質(zhì)的潔凈服后返回CNC區(qū)，通過總更退回辦公等NC區(qū)域，人員在接觸活性物質(zhì)的工藝功能間單向流動，通過退更手消等凈化措施后退出生產(chǎn)區(qū)，最大限度減少交叉污染。

物（原輔包材、污物）流向設計：物流從西北角電梯進入，通過貨梯廳的氣閘進入CNC走道，再通過物凈氣閘進入潔凈輔助支持區(qū)，物料在各自的配液間進行稱量配液后，通過物氣閘進入各個工藝功能間的生產(chǎn)崗位，操作完的廢棄物、器具、潔具、器具支撐桶等通過退出氣閘統(tǒng)一退到退出走道，再通過濕熱滅菌柜或VHP滅菌柜滅活后退到廢棄物間和清洗滅菌間，廢棄物通過傳遞窗從廢棄物間（CNC）直接傳遞到廢棄物暫存間（NC）；器具滅活后傳入清洗滅菌間，清洗滅菌后再傳入各功能間使用；衣物滅活后轉(zhuǎn)移到洗衣間，通過雙扉工衣清洗烘干機清洗后進入整衣間，整理打包滅菌后傳到更衣間使用。

產(chǎn)品流向設計：主要功能間由東到西依次為接種、培養(yǎng)、粗存、精純，起始細胞通過傳遞窗進入接種間，過程中的培養(yǎng)液和純化液通過傳遞窗、穿墻管道等手段，工藝物流由東到西，原液從物流入口再返回到倉庫。

4.2 潔凈分區(qū)及壓差設計

潔凈分區(qū)：本項目的潔凈區(qū)分級分為：NC區(qū)、CNC區(qū)、D級潔凈區(qū)、C級潔凈區(qū)、A級潔凈區(qū)。NC區(qū)主要為生產(chǎn)區(qū)之外的功能間，包括輔助機房、辦公、衛(wèi)生間以及室外相關的部分，NC區(qū)不作管控；CNC區(qū)為生產(chǎn)車間的輔助區(qū)域，人員需要通過總更進入，物品需要經(jīng)過外清脫包進入，CNC區(qū)作人物流、粉塵粒子、溫濕度管控；D級區(qū)主要作為CNC區(qū)與C級區(qū)的人物凈化過渡，本項目不存在實際的D級功能間；C級區(qū)為主要的操作功能間，涉及原輔料暴露操作的功能間以及配套的走道及配套功能間；A級區(qū)（靜態(tài)）主要為活性物質(zhì)直接暴露的區(qū)域以及粉塵暴露對人員有危害的區(qū)域，本項目主要為生物安全柜和負壓稱量罩。具體見表3和圖4。

表3 功能間潔凈分區(qū)表Tab.3 Clean zoning of function room

壓差設計：壓差的合理設置能有效保證產(chǎn)品不被污染，同時也需要兼顧生物安全活性物質(zhì)不泄漏到環(huán)境，對外界造成影響，設計的基本原則為NC區(qū)不控制壓差，CNC區(qū)基準壓差按+5 Pa控制，有污染區(qū)域為負壓；D級區(qū)按17.5 Pa設置，比CNC高12.5 Pa，在實際運行中考慮到±2.5 Pa波動，能有效保證D級區(qū)比CNC高10 Pa的有效控制；C級區(qū)按30 Pa的基準進行設置，保證比D級大于10 Pa，同時考慮±2.5 Pa波動，C級區(qū)內(nèi)不同功能間的壓差設置按5 Pa的壓差考慮，主要功能間通過進入氣閘與退出氣閘分別與進入走道和退出走道相連，進入氣閘設置為正壓氣泡型氣閘，退出氣閘設置為負壓陷阱型氣閘，有生物安全活性物質(zhì)直接暴露的功能間相對于相鄰的有開門的功能間形成相對負壓，防止有生物安全活性物質(zhì)泄漏。平面壓差布置詳見圖4。

圖4 車間潔凈分區(qū)及壓差布置Fig.4 Clean partition and differential pressure layout of workshop

4.3 生物安全防護設計

本項目使用到的生物安全活性物質(zhì)主要有293細胞（BSL-2）、質(zhì)粒（BSL-1）、AAV病毒（BSL-2）。當一個房間存在兩種以上的物質(zhì)時，生物安全按高級別實行，各主要功能間存在的活性物質(zhì)如表4所 示。

表4 功能間生物安全定級表Tab.4 Biosafety classification of function room

主要功能間直接接觸生物活性物質(zhì)，全部定義為P2防護等級，與主要功能間直接相連的人氣閘、物氣閘、退出氣閘、退出走道、滅活間、傳遞窗、濕熱滅活柜、VHP滅活柜等間接接觸活性物質(zhì)的空間，從嚴要求也全部定義為P2防護等級。P2防護區(qū)對周邊區(qū)域形成相對負壓，空調(diào)為直排風型，排風上屋面經(jīng)過高效過濾后高空排放；活性廢水通過專用管道進入滅活罐收集后通過高溫滅活后再進行污水處理；人員通過專用的人員正壓氣閘穿上防護服后進入，通過統(tǒng)一的退出走道和退更氣閘退出，退出時人員進行退更和手消毒，物品經(jīng)過專用的物品正壓氣閘進入，廢棄物、衣物、潔具、器具支撐桶等通過雙扉濕熱滅菌柜或雙扉VHP滅菌柜滅活后退出到廢棄物間和清洗間，原液和樣品用消毒液表面消殺后通過傳遞窗傳出，有效保證生物活性物質(zhì)不外泄。防護區(qū)30 m范圍內(nèi)均設置緊急淋浴裝置。具體區(qū)域劃分見圖5。

圖5 車間生物安全分區(qū)Fig.5 Biosafety zoning of workshop

5 結(jié)束語

本文結(jié)合國內(nèi)外法規(guī)，從工藝流程、功能區(qū)劃、人物流組織、生物安全等方面對基因治療藥物生產(chǎn)車間進行分析，但目前國內(nèi)尚未有商業(yè)化的基因治療藥物產(chǎn)品上市，正式的指導性法規(guī)也尚未頒布，在車間的設計中，尚存在一定的不確定性，所以在設計中，應該更加嚴格地考慮GMP原則以及生物安全的防護要求，使得建成的車間可以適用于未來的法規(guī)要求。