基于宏基因組學(xué)研究懷地黃對鯉魚腸道微生物群落組成的影響

常緒路，康美如，馮軍廠，張建新

(河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院；河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,河南 新鄉(xiāng) 453007)

水產(chǎn)品養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大以及集約化養(yǎng)殖的出現(xiàn)，帶來經(jīng)濟(jì)效益的同時也導(dǎo)致了水產(chǎn)動物各種疾病的發(fā)生[1].大量化學(xué)類藥物和抗生素的使用對水產(chǎn)動物病害防治起到了一定作用，但也產(chǎn)生了一系列的其他問題，例如藥物殘留、耐藥性產(chǎn)生、環(huán)境污染等[2].為實(shí)現(xiàn)綠色無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)，維持水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展，尋找抗生素替代品是一個重要途徑.中草藥作為一種天然藥物添加劑，具有綠色環(huán)保、無抗藥性等特點(diǎn)，已逐漸成為替代抗生素、其他化學(xué)合成藥物的新一代添加劑[3].

中草藥含有多種有效成分，例如生物堿、多糖類、有機(jī)酸、色素、糖蛋白和氨基酸等.已有研究表明中草藥可以促進(jìn)養(yǎng)殖動物生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抗菌能力[4-7].目前已有多種中草藥做為飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中，并取得較好效果[5-6].其中，地黃作為一種傳統(tǒng)中草藥，含有地黃多糖和環(huán)烯醚萜苷等多種活性物質(zhì)，并具有抗炎、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性[8].在鯉魚基礎(chǔ)飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%懷地黃粉可以調(diào)節(jié)鯉魚免疫相關(guān)基因表達(dá)，增強(qiáng)鯉魚免疫力，提高鯉魚生長性能[9].本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)鯉魚基礎(chǔ)飼料中添加懷地黃多糖可以增強(qiáng)鯉魚非特異性免疫力和抗氧化活性，提高鯉魚對病原菌的抵抗力[6].因此，懷地黃可作為鯉魚免疫增強(qiáng)劑的理想原料.懷地黃作為鯉魚免疫增強(qiáng)劑經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)，不可避免地與鯉魚腸道接觸，其是否會對鯉魚腸道微生態(tài)產(chǎn)生影響，目前未見報(bào)道.因此本研究以鯉魚和懷地黃為材料，針對鯉魚腸道微生物組進(jìn)行剖析，利用宏基因組技術(shù)研究懷地黃對鯉腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為解析懷地黃免疫增強(qiáng)劑的調(diào)控機(jī)理，指導(dǎo)懷地黃添加劑在鯉魚養(yǎng)殖實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚與飼養(yǎng)管理

從河南省新鄉(xiāng)市原陽水產(chǎn)養(yǎng)殖場購買個體均勻、外觀無疾病癥狀的鯉魚，置于河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地魚塘中暫養(yǎng)2周.饑餓處理24 h后，挑選規(guī)格整齊的180尾鯉魚((31.42±0.83)g)隨機(jī)分為2組，分別飼喂以下兩種飼料：對照組(0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 懷地黃+基礎(chǔ)飼料)，實(shí)驗(yàn)組(4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))熟懷地黃粉+基礎(chǔ)飼料)，每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚.其中基礎(chǔ)飼料購置于河南通威飼料公司，配方和營養(yǎng)水平見附表Ⅰ.飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中完成，每天投喂2次，投喂時間分別是8:00和18:00.投喂方法采用飽食投喂并根據(jù)鯉魚食情況加以調(diào)整.養(yǎng)殖期間，水溫控制在26.0～28.0 °C，溶氧不低于6.5 mg/L，pH 7.1～7.4.實(shí)驗(yàn)持續(xù)80 d.

1.2 基因組DNA提取和測序

飼喂周期結(jié)束后分別從對照組和實(shí)驗(yàn)組的每個水槽中隨機(jī)抽取3尾鯉魚，用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇進(jìn)行體表消毒，再用滅菌生理鹽水沖洗數(shù)遍，無菌條件下將腸道取出，收集得到的腸道內(nèi)容物用DNA提取試劑盒(Mobio，美國)提取總DNA.利用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop，美國)測定DNA質(zhì)量.宏基因組測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用高通量測序儀HiSeq?4000 System(Illumina，美國)完成.

1.3 生物信息學(xué)分析

先對下機(jī)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，通過拆分、剪切以及去除污染序列等方法得到優(yōu)化處理后的序列.優(yōu)化序列利用SOAP denovo(http://soap.genomics.org.cn，Version 1.06)進(jìn)行組裝.隨后利用CD-HIT(http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)構(gòu)建非冗余基因目錄.接著使用MetaGene(http:// metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/)基因預(yù)測軟件從組裝結(jié)果中預(yù)測開放閱讀框架(ORFs)[10]. 將預(yù)測基因與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的非冗余數(shù)據(jù)庫(NR)進(jìn)行比對，進(jìn)行物種注釋及分類.

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)所有的數(shù)據(jù)分析使用SPSS statistics 22(IBM,Armonk,NY,USA)軟件，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示.各組之間的差異分析使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，影響顯著時再進(jìn)行Duncan多重比較.利用R軟件包中的Kruskal-Wallis分析確定兩組微生物種群是否存在顯著性差異.P<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

根據(jù)各個樣品引物標(biāo)簽序列識別各自的雙末端序列，經(jīng)過雙末端拼接、去除引物、質(zhì)量控制和去除嵌合體序列后，共產(chǎn)生了約2.83×109Gb的原始數(shù)據(jù).采用SOAP denovo 軟件對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，通過雙末端序列組裝，6個樣品共獲得6 733 347條contigs，其中每個樣品得到的contigs數(shù)量范圍從1 091 219到1 150 464條不等(附表Ⅱ).使用MetaGene共鑒定得到3 030 851個開放閱讀框架(ORFs).

2.2 鯉魚腸道細(xì)菌、古菌、病毒和真菌的組成

將基因預(yù)測結(jié)果與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp比對，得到對應(yīng)的物種注釋信息.結(jié)果顯示，鯉魚腸道微生物主要包括細(xì)菌、古菌、真核微生物和病毒等.其中，細(xì)菌與真菌含量較多，而古菌與病毒豐度較低(附圖Ⅰ).

根據(jù)測序數(shù)據(jù)，在兩組鯉魚腸道中共檢測到74個細(xì)菌門.對照組鯉魚腸道細(xì)菌主要由梭桿菌門Fusobacteria(65.43%)，變形桿菌門Proteobacteria(23.80%)，擬桿菌門Bacteroidetes(5.87%)和厚壁菌門Firmicutes(2.32%)組成.在飼喂懷地黃鯉魚腸道中，梭桿菌門Fusobacteria(42.79%)，變形桿菌門Proteobacteria(28.93%)、擬桿菌門Bacteroidetes(12.24%)和疣微菌門Verrucomicrobia(7.94%)是主要類群(圖1(a)).在鯉魚腸道中共檢測到7個古細(xì)菌門(圖1(b))，分別屬于廣古菌門Euryarchaeota(70.59%)、奇古菌門Thaumarchaeota(24.12%)、深古菌門Candidatus_Bathyarchaeota(1.65%)、泉古菌門Crenarchaeota(1.10%)、微古菌門Candidatus_Micrarchaeota(1.05%)、洛基古菌門Candidatus_Lokiarchaeota(0.16%)和雷神古菌門Candidatus_Thorarchaeota(0.14%).在鯉魚的腸道中檢測得到19個病毒科.對照組和懷地黃組中病毒群落組成存在差異(圖1(c)).在飼喂懷地黃組中，豐度較高的病毒類群包括長尾噬菌體Siphoviridae(57.14%),肌尾噬菌體Myoviridae(25.45%)和短尾噬菌體Podoviridae(3.70%).而對照組的優(yōu)勢病毒類群為短尾噬菌體Podoviridae(71.55%),肌尾噬菌體Myoviridae(8.45%)和長尾噬菌體Siphoviridae(5.29%).本研究結(jié)果顯示飼喂懷地黃組和對照組鯉魚腸道中主要真菌類群列均為子囊菌門Ascomycota(50.62%，71.56%)和擔(dān)子菌門Basidiomycota(21.56%，12.72%)(圖1(d)).

2.3 懷地黃對鯉魚腸道細(xì)菌、古菌、病毒和真菌組成的影響

測序結(jié)果表明飼料中添加懷地黃顯著提高了鯉魚腸道中疣微菌門Verrucomicrobia(P=0.000 39),浮霉菌門Planctomycete(P=0.019 31)和放線菌門Actinobacteria細(xì)菌的豐度(P=0.049 08).此外，測序結(jié)果顯示飼喂懷地黃后鯉魚腸道中益生菌，例如阿克曼菌Akkermansia,紅假單胞菌Rhodopseudomonas,外硫紅螺菌Ectothiorhodospira,紅酵母Rhodotorula和釀酒酵母Saccharomyces的豐度顯著增加(P<0.05)(附表Ⅲ).另外，飼喂懷地黃的鯉魚腸道中短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌，如糞便桿菌屬Faecalibacterium,擬桿菌屬Bacteroides和梭狀桿菌屬Clostridium的豐度有所增加，但與對照組相比差異不顯著(P>0.05)(附表Ⅲ).

兩組鯉魚腸道中古菌群落組成存在一定差異.測序結(jié)果顯示廣古菌門(Euryarchaeota),深古菌門(Candidatus_Bathyarchaeota)和微古菌門(Candidatus_Micrarchaeota)在飼喂懷地黃組鯉魚腸道中的相對豐度顯著高于對照組鯉魚(P<0.05)(圖2).同時發(fā)現(xiàn)，鯉魚腸道中的優(yōu)勢古菌類群為產(chǎn)甲烷菌(48.15%)，主要包括甲烷細(xì)菌(Methanobacteria),甲烷球菌(Methanococci)和甲烷微菌(Methanomicrobia)等.研究發(fā)現(xiàn)，飼喂懷地黃組鯉魚腸道中甲烷細(xì)菌(Methanobacteria)的相對豐度顯著高于對照組(P<0.05).另外懷地黃組鯉魚腸道中甲烷球菌(Methanococci)和甲烷微菌(Methanomicrobia)的相對豐度也比對照組高，但沒有表現(xiàn)出顯著差異(P>0.05)(附表Ⅲ).通過對宏基因組測序數(shù)據(jù)中病毒序列分析發(fā)現(xiàn)，對照組鯉魚腸道中短尾噬菌體(Podoviridae)的相對豐度顯著高于懷地黃組(P<0.05)(附表Ⅲ).

上述結(jié)果表明，飼料中添加懷地黃改變了鯉魚腸道細(xì)菌、古菌、病毒和真核微生物群落的組成.主坐標(biāo)分析(PCoA)結(jié)果同樣顯示出對照組和飼喂懷地黃組鯉魚腸道微生物群落組成之間存在明顯差異(圖3).同樣，屬水平的系統(tǒng)聚類熱圖分析表明，兩個組之間微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異(附圖Ⅱ).

3 討 論

疾病是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要制約因素.為防治病害，大量的化學(xué)藥品和抗生素被長期、過量使用，這雖然對水產(chǎn)動物病害防治起到了一定作用，但也產(chǎn)生了不容忽視的毒副作用.中草藥作為一種天然的、無抗藥性的新興“綠色添加劑”，受到國內(nèi)外飼料行業(yè)生產(chǎn)者和研究者的廣泛重視，已逐漸成為替代抗生素、其他化學(xué)合成藥物和激素的新一代飼料添加劑.研究表明，中草藥具有促進(jìn)生長、提高免疫力、增強(qiáng)食欲和抗應(yīng)激的作用[10-11].但是，關(guān)于中草藥對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物腸道微生物影響的研究較少.已有研究表明，懷地黃作為飼料添加劑可以促進(jìn)鯉魚的生長并增強(qiáng)其免疫能力，這說明了懷地黃可能是鯉魚養(yǎng)殖過程中的具有應(yīng)用前景的飼料添加劑[10].本研究利用宏基因組學(xué)方法揭示懷地黃對鯉魚腸道菌群組成的影響.

宏基因組測序數(shù)據(jù)表明鯉魚腸道微生物由細(xì)菌、古菌、真核微生物和病毒等組成.數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示鯉魚腸道中細(xì)菌和真核微生物占主導(dǎo)地位，而古菌和病毒僅占很小部分.與其他魚類的研究結(jié)果相似[12]，本研究發(fā)現(xiàn)鯉魚腸道中優(yōu)勢細(xì)菌包括梭桿菌門、變形桿菌門、擬桿菌門.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)鯉魚腸道中梭桿菌門的豐度最高.已有研究表明，梭桿菌門是草魚(Ctenopharyngodonidella)[13]等其他魚類腸道中的優(yōu)勢細(xì)菌.本研究發(fā)現(xiàn)懷地黃可以顯著提高鯉魚腸道中疣微菌門的豐度.研究證實(shí)疣微菌門廣泛地定植于腸道黏液層，其代表性菌株Akkermansiamuciniphila對宿主的營養(yǎng)代謝、疾病抵抗和機(jī)體免疫等方面發(fā)揮著重要作用[14].由以上可以推斷飼料中添加懷地黃制劑可對宿主產(chǎn)生有益效果.研究發(fā)現(xiàn)紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)， 外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira)，釀酒酵母(Saccharomyces)和紅酵母(Rhodotorula)等細(xì)菌和酵母菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用的益生菌[15].本研究發(fā)現(xiàn)飼喂懷地黃的鯉魚腸道中，這些益生菌的相對豐度顯著高于對照組，這表明飼料中添加懷地黃可以增加鯉魚腸道中益生菌的豐度，這將有利于增強(qiáng)鯉魚免疫力，提高鯉魚對疾病的抵抗能力.

短鏈脂肪酸(SCFA)是腸道細(xì)菌發(fā)酵膳食纖維需產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，主要包括丁酸、丙酸和乙酸等.研究證實(shí)SCFA在能源提供、改善腸屏障功能、抗炎以及保護(hù)宿主免受病原菌入侵等方面起著重要作用[16].本研究發(fā)現(xiàn)飼喂懷地黃組鯉魚腸道中一些SCFA產(chǎn)生細(xì)菌(費(fèi)氏桿菌(Faecalibacterium)，擬桿菌(Bacteroides) 和梭狀芽孢桿菌(Clostridium))的豐度顯著高于對照組.其中費(fèi)氏桿菌(Faecalibacterium)代謝產(chǎn)生丁酸鹽可以調(diào)節(jié)腸道激素的分泌，抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和控制有害細(xì)菌的生長，從而利于宿主健康.推測飼喂懷地黃可以增加鯉魚腸道中短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌的豐度，提高腸道中SCFAs的含量，從而利于改善腸道健康狀況，增強(qiáng)鯉魚對疾病的抵抗能力.

關(guān)于腸道古菌的研究受到人們廣泛關(guān)注.研究表明古菌和其它微生物共生于腸道，在宿主的健康方面發(fā)揮著重要作用[17].本研究發(fā)現(xiàn)古菌在鯉魚腸道微生物組中占比較少，產(chǎn)甲烷古菌是鯉魚腸道中豐度最高的一類古菌.產(chǎn)甲烷古菌能夠?qū)溥€原為甲烷，從而促進(jìn)多糖發(fā)酵細(xì)菌的生長，提高飲食的能量利用率.因此推測，懷地黃作為飼料添加劑通過提高鯉魚腸道內(nèi)產(chǎn)甲烷古菌的豐度而提高其營養(yǎng)與能量的利用能力，從而有益于鯉魚生長.

目前，關(guān)于鯉魚腸道病毒群落的研究未見報(bào)道.本研究發(fā)現(xiàn)懷地黃組鯉魚腸道中長尾噬菌體科和肌尾噬菌體的相對豐度顯著高于對照組，這其中的原因有待進(jìn)一步研究.值得注意的是，一些感染魚類的病毒(例如ε逆轉(zhuǎn)錄病毒Epsilonretrovirus)僅在對照組鯉魚腸道中檢測到，而在懷地黃組鯉魚腸道內(nèi)未發(fā)現(xiàn)該病毒的存在.由以上結(jié)果推斷懷地黃可能具有抗病毒的能力，從而增強(qiáng)鯉魚對疾病的抵抗能力.

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)飼料中添加4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))懷地黃可以顯著改變鯉魚腸道細(xì)菌、古菌、病毒和真菌的組成，提高有益微生物的豐度而降低有害微生物的豐度.

附 錄

附表、附圖見電子版(DOI:10.16366/j.cnki.1000-2367.2022.05.017).