超靈敏檢測(cè)血清中葡萄糖的中空介孔普魯士藍(lán)@葡萄糖氧化酶電化學(xué)發(fā)光傳感器

仉華，申聰聰，陳粵華，樊思敏

(河南師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007)

葡萄糖作為生物體內(nèi)能量的主要來(lái)源，對(duì)維持生命健康至關(guān)重要.近年來(lái)，糖尿病的發(fā)病率持續(xù)增加，作為一種常見(jiàn)的致死性慢性疾病可能引發(fā)尿毒癥、高血壓、心血管及并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生命健康[1-3].血液中的葡萄糖含量即血糖，成為糖尿病檢測(cè)的重要靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的葡萄糖檢測(cè)方法有利于實(shí)現(xiàn)糖尿病的早期診斷.目前已報(bào)道的葡萄糖分析方法有比色法、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)法、電化學(xué)發(fā)光法等[1-2,4-6]，其中電化學(xué)發(fā)光技術(shù)(Electrochemiluminescence，ECL)集電化學(xué)傳感和化學(xué)發(fā)光為一體，兼具高靈敏度、操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)時(shí)間快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢驗(yàn)診斷、食品安全檢測(cè)和環(huán)境污染監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景.傳統(tǒng)的電化學(xué)酶?jìng)鞲衅魇峭ㄟ^(guò)天然的葡萄糖氧化酶特異性,高效地催化氧化D-葡萄糖為D-葡萄糖酸內(nèi)酯和H2O2，直接進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)或通過(guò)引入氧化還原介質(zhì)進(jìn)一步催化H2O2氧化生成活性氧級(jí)聯(lián)放大電化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的高選擇性、高靈敏度檢測(cè)，使其成為葡萄糖酶?jìng)鞲衅餮芯孔顝V泛的生物酶之一[7-9].文獻(xiàn)[10]將葡萄糖氧化酶和葡萄糖在溶液中混合直接產(chǎn)生H2O2增強(qiáng)魯米諾的ECL性能,同時(shí)測(cè)定H2O2，葡萄糖及葡萄糖氧化酶的活性.該方法操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用廣泛，然而生成的H2O2與電極反應(yīng)界面距離遠(yuǎn)、易分解,限制了檢測(cè)靈敏度的提高.通過(guò)引入載體固定生物酶不僅可以提高酶的負(fù)載效率，而且還能縮短酶催化反應(yīng)在電極表面的電子傳遞距離.文獻(xiàn)[11]合成具有ECL特性的CdS量子點(diǎn)負(fù)載葡萄糖氧化酶，使得H2O2在電極表面原位生成，有效增強(qiáng)了CdS的發(fā)光效率，但CdS的生物毒性限制了該方法在生物檢測(cè)方面應(yīng)用，同時(shí)生物酶需要適當(dāng)?shù)墓潭ɑ侄蝸?lái)保證其高效的催化活性.隨著納米材料的進(jìn)一步研究，科研工作者通過(guò)開(kāi)發(fā)一系列納米模擬酶催化葡萄糖分解來(lái)檢測(cè)葡萄糖含量，如文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)合成了3D Cu-Flo.@AuNPs復(fù)合納米材料構(gòu)建無(wú)酶葡萄糖ECL傳感器，該方法無(wú)須考慮酶活性因素,拓寬了測(cè)試條件，然而小顆粒的納米材料易團(tuán)聚制約了其催化的穩(wěn)定性.因此，鑒于生物酶良好的催化活性和優(yōu)異的選擇性，設(shè)計(jì)高效、生物安全性好的酶固定化手段能夠顯著提高實(shí)際樣品中葡萄糖的測(cè)定效率.

立方體結(jié)構(gòu)的普魯士藍(lán)(Prussian Blue，PB)是由鐵和亞鐵氰化物組成的金屬有機(jī)框架材料，能夠作為氧化還原介質(zhì)高效催化H2O2，被稱(chēng)為“人工過(guò)氧化物酶”，在光物理、生物醫(yī)學(xué)和電化學(xué)等領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用.由于其具有良好的生物相容性于2010年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)為鉈的解毒劑[5,13].已有基于PB的過(guò)氧化物酶特性構(gòu)建電化學(xué)葡萄糖酶?jìng)鞲衅饔糜谂R床和環(huán)境分析的報(bào)道[14].為提高催化效率，常引入導(dǎo)電性好的碳納米材料作為載體將PB固定在電極表面，如用PB納米顆粒填充碳納米管，在微碳纖維上垂直排列普魯士藍(lán)/碳納米管復(fù)合物作為超靈敏檢測(cè)葡萄糖的生物載體[15-18].以上方法雖然提高了葡萄糖的檢測(cè)靈敏度，因其需要載體、氧化還原介質(zhì)和GOx,構(gòu)建過(guò)程相對(duì)復(fù)雜.已有文獻(xiàn)報(bào)道HMPB納米顆粒由于空隙多、比表面積大、生物相容性好等優(yōu)勢(shì)被用作腫瘤治療劑的納米載體，具有良好的載藥量和治療性能[13,19-21].HMPB優(yōu)越的載體及過(guò)氧化物酶性質(zhì)為設(shè)計(jì)雙功能HMPB@GOx納米復(fù)合材料，構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光傳感器提供了思路.

本文通過(guò)模板法制備出80 nm左右的立方體PB納米顆粒，控制鹽酸刻蝕時(shí)間調(diào)控合成HMPB的中心空腔大小，并以此作為GOx的載體及H2O2氧化還原介質(zhì)，以魯米諾-H2O2電化學(xué)發(fā)光體系為基礎(chǔ)構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光酶?jìng)鞲衅骷?jí)聯(lián)放大電信號(hào)超靈敏檢測(cè)葡萄糖.為了進(jìn)一步增強(qiáng)電極的導(dǎo)電性及HMPB@GOx在電極表面的負(fù)載效率，本文通過(guò)電沉積技術(shù)將帶正電的導(dǎo)電聚合物聚苯胺(PAA)鍍?cè)陔姌O表面上一層，通過(guò)靜電作用將HMPB@GOx修飾在電極表面構(gòu)建電化學(xué)發(fā)光葡萄糖傳感器.測(cè)試結(jié)果表明，基于HMPB@GOx構(gòu)建的ECL傳感體系在其他電活性物質(zhì)如抗壞血酸(AA),多巴胺(DA)和尿酸(UA)共存時(shí)仍對(duì)葡萄糖具有良好的選擇性，高的靈敏度和低的檢出限，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了實(shí)際血清中葡萄糖含量的測(cè)定.因此，該HMPB@GOx電化學(xué)發(fā)光傳感體系具有成為糖尿病患者血清中葡萄糖便攜檢測(cè)器件的潛力.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料制備

1.1.1PB及HMPB納米顆粒的合成

PB的合成：稱(chēng)取6.0 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和220 mg鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])，加入到80 mL，0.010 mol/L的鹽酸中混合攪勻，并在室溫下攪拌0.5 h得到黃色的溶液.然后將混合溶液放入聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，在烘箱中80 ℃反應(yīng) 24 h，自然冷卻至室溫.最后用一定量丙酮、二次水多次離心、洗滌，得到藍(lán)色的PB納米顆粒.

中空介孔普魯士藍(lán)(HMPB)的合成：在60 mL 1.0 mol/L 的HCl中加入300 mg 的PVP和60 mg 的PB納米顆粒，將混合液密封在聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，140 ℃反應(yīng)4 h.然后用水和乙醇多次離心、洗滌沉淀物，于真空干燥箱中過(guò)夜干燥，得到了HMPB.為驗(yàn)證空心程度對(duì)GOx負(fù)載效率及ECL信號(hào)強(qiáng)度的影響，本文控制刻蝕時(shí)間為0，1.0，2.0,4.5和8.0 h作為對(duì)照合成材料.

1.1.2HMPB@GOx的合成

將10 mg的GOx和1.0 mg的HMPB溶解在0.5 mL的PBS中，在4 ℃條件下震蕩過(guò)夜.用二次水離心、洗滌多次以除去多余的GOx，重新分散在0.5 mL二次水中，制得HMPB@GOx復(fù)合物于4 ℃冰箱中備用.

1.2 材料表征

用日立SU8010場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)PB的微觀表面形貌進(jìn)行表征；通過(guò)JEM-2100高分辨率透射電子顯微鏡(TEM)觀察HMPB材料內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)；利用Zeta電位及阻抗表征HMPB@GOx的復(fù)合材料及ECL傳感體系的構(gòu)建過(guò)程.

1.3 ECL傳感器構(gòu)建及電化學(xué)測(cè)試條件優(yōu)化

1.3.1ECL傳感器的構(gòu)建

利用上海辰華電化學(xué)工作站CHI760E，在室溫下采用標(biāo)準(zhǔn)的三電極體系(直徑為3 mm的玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑柱為對(duì)電極)，在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中進(jìn)行電化學(xué)性能測(cè)定.

將用α-Al2O3打磨好玻碳電極浸入25 mmol/L的苯胺溶液(用0.5 mol/L H2SO4稀釋)，在-0.2～1.0 V的電壓范圍內(nèi)掃描5圈，在電極表面制備出聚苯胺(PAA)導(dǎo)電薄膜.移液槍吸取7.5 μL上述制備好的HMPB@GOx復(fù)合納米材料滴加在玻碳電極表面，室溫下干燥備用.

1.3.2條件優(yōu)化

電極表面PAA量的優(yōu)化：將打磨干凈的工作、參比和對(duì)電極浸沒(méi)在苯胺溶液中，通過(guò)控制掃描圈數(shù)分別為1,2,5,10,15,30調(diào)控電極表面PAA的量.將電聚合PAA后的玻碳電極浸入含有50 μmol/L魯米諾和6.7 μmol/L葡萄糖溶液中,設(shè)置光電倍增管高壓為600 V,測(cè)定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度.

pH優(yōu)化：配置pH分別為5.3,6.3,7.0,8.0,8.3,9.0的PBS緩沖液(5 mmol/L磷酸二氫鈉,5 mmol/L磷酸氫二鈉和100 mmol/L氯化鈉),用于魯米諾(0.01 mol/L)的稀釋.將HMPB@GOx修飾好的電極置于含有50 μmol/L魯米諾和6.7 μmol/L葡萄糖溶液中,設(shè)置光電倍增管高壓,測(cè)定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度.

魯米諾濃度優(yōu)化：用PBS(pH 8.3)將魯米諾分別稀釋成10,25,40,50,75和100 μmol/L.將HMPB@GOx修飾好的電極置于魯米諾和6.7 μmol/L葡萄糖溶液中,設(shè)置光電倍增管高壓,測(cè)定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度.

GOx濃度優(yōu)化：將1.0 mg的HMPB和1.0,5.0,10.0,15.0,20.0,30.0 mg的GOx溶解在1.0 mL的PBS中,按照以上步驟合成不同GOx負(fù)載量的HMPB@GOx復(fù)合物并修飾于電極表面.將修飾好的電極置于含有50 μmol/L魯米諾和6.7 μmol/L葡萄糖溶液中，設(shè)置光電倍增管高壓，測(cè)定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度.

PB刻蝕時(shí)間優(yōu)化：將不同刻蝕時(shí)間的HMPB按照以上方法與GOx混合形成HMPB@GOx復(fù)合物并修飾于電極表面，設(shè)置光電倍增管高壓，測(cè)定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度.

1.4 葡萄糖測(cè)定

按照以上最優(yōu)條件，將HMPB@GOx復(fù)合物修飾好玻碳電極浸入含有不同濃度葡萄糖(依次為0，3.3×10-2，3.3×10-1，1.7，3.3，6.7，16.6，50.0，100.0和167.0 μmol/L)的魯米諾溶液中,設(shè)置光電倍增管高壓為600 V，測(cè)定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度.

1.5 選擇性測(cè)定

按照以上最優(yōu)條件，將HMPB@GOx復(fù)合物修飾好玻碳電極浸入pH 8.3的魯米諾溶液中，連續(xù)滴加6.7 μmol/L的葡萄糖，抗壞血酸、尿酸或多巴胺，設(shè)置光電倍增管高壓為600 V，測(cè)定魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度.

1.6 實(shí)際樣品測(cè)定

從新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院取得全血3份，在4 ℃條件下3 000 r/min 離心15 min，取得上層淡黃色血清，分別將血清10倍，100倍，1 000倍，5 000倍和10 000倍稀釋?zhuān)帽痉桨笜?gòu)建的ECL傳感器測(cè)定其葡萄糖含量.選取1 000倍稀釋的血清為實(shí)際樣品，用本方法構(gòu)建的ECL傳感器測(cè)定其葡萄糖含量并與血糖儀測(cè)定結(jié)果做對(duì)比.

2 結(jié)果與討論

2.1 ECL傳感器構(gòu)建及機(jī)理探究

HMPB金屬有機(jī)框架大的比表面積和過(guò)氧化物酶特性在葡萄糖、H2O2等生物分子檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用.因此，本文基于HMPB@GOx復(fù)合物原位生成并迅速催化H2O2分解設(shè)計(jì)了一種ECL傳感器用于葡萄糖的超靈敏檢測(cè).圖1為HMPB@GOx復(fù)合物的合成及表征圖.以K3[Fe(CN)6]和PVP為原料合成了立方體PB納米顆粒，通過(guò)調(diào)控HCl刻蝕時(shí)間獲得合適的中空介孔普魯士藍(lán).然后將HMPB與葡萄糖氧化酶(GOx)混合過(guò)夜，形成HMPB@GOx復(fù)合納米材料(圖1(A))，并將該復(fù)合納米材料通過(guò)靜電吸附修飾在電聚合PAA的玻碳電極表面構(gòu)建葡萄糖傳感器.通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)，透射電子顯微鏡(TEM)對(duì)PB及HMPB的形貌及內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，從圖1(B,C)可以看出，合成的PB是粒徑為80 nm左右均勻的立方體，刻蝕后HMPB的棱角變得柔和且中間出現(xiàn)大的空腔結(jié)構(gòu)，表明刻蝕成功.進(jìn)而通過(guò)Zeta電位和電極表面阻抗譜的變化來(lái)探究HMPB@GOx復(fù)合物的形成及ECL傳感器的構(gòu)建過(guò)程，結(jié)果表明，帶負(fù)電荷PB經(jīng)過(guò)刻蝕，質(zhì)子由于靜電吸附殘留在HMPB中使其所帶負(fù)電荷急劇減少，當(dāng)GOx與HMPB復(fù)合之后，所帶的負(fù)電荷反而增加，這是由于帶較多負(fù)電荷的GOx負(fù)載在HMPB的空腔及表面增加了復(fù)合物的Zeta電勢(shì)(圖1(D))，證明HMPB@GOx成功合成.提高導(dǎo)電性及酶在電極表面的固載效率是增強(qiáng)電化學(xué)傳感器靈敏度的關(guān)鍵因素，本文通過(guò)測(cè)定工作電極表面的阻抗探究電化學(xué)傳感器的構(gòu)建過(guò)程，如圖1(E)所示，相比干凈的玻碳電極，電聚合PAA之后阻抗有所減小，當(dāng)HMPB@GOx修飾在電極表面后阻抗顯著增大(內(nèi)插圖為玻碳電極和聚合PAA后的放大圖)，這是由于導(dǎo)電聚合物PAA薄膜的引入加速了溶液中電荷在電極表面的聚集和電子的轉(zhuǎn)移速率，而HMPB表面負(fù)載大量的生物分子GOx抑制了電子的快速轉(zhuǎn)移，表明基于HMPB@GOx的葡萄糖電化學(xué)傳感器構(gòu)建成功.

2.2 條件優(yōu)化

測(cè)試條件的優(yōu)化對(duì)ECL傳感器靈敏度、穩(wěn)定性提高至關(guān)重要，本文主要從電聚合PAA量、電解液pH、發(fā)光試劑魯米諾濃度、GOx在HMPB上的負(fù)載量和HMPB的刻蝕時(shí)間等方面進(jìn)行測(cè)試條件優(yōu)化.

2.2.1電聚合PAA量的優(yōu)化

玻碳電極作為ECL傳感器的反應(yīng)基底，適當(dāng)?shù)母男阅茱@著增強(qiáng)魯米諾的ECL的發(fā)光強(qiáng)度.本文通過(guò)控制電聚合時(shí)間對(duì)電極表面PAA的量進(jìn)行優(yōu)化，如圖2(A)所示，從0到5圈隨著聚合時(shí)間的增加ECL強(qiáng)度逐漸增大，隨后ECL強(qiáng)度迅速降低，這是由于PAA厚度過(guò)大使反應(yīng)物與電極之間的距離變大減緩其電子轉(zhuǎn)移速率，實(shí)驗(yàn)證明電聚合5圈PAA的電極對(duì)HMPB@GOx吸附量及導(dǎo)電性能最好.圖2(B)為PAA電聚合過(guò)程的循環(huán)伏安圖，第一次電位掃描時(shí)苯胺聚合的氧化峰電位出現(xiàn)在較低的0.80 V，該電位與鉑電極和石墨烯電極(0.76 V)基本一致，在隨后的循環(huán)中，此電位保持不變，但電流隨循環(huán)次數(shù)的增加而增大.當(dāng)電位反向掃描時(shí)，曲線上出現(xiàn)兩個(gè)還原峰，其峰電流強(qiáng)度也隨著掃描次數(shù)的增加而增大，這是由于電極表面生成聚苯胺量在增加，這兩個(gè)還原峰是由生成的氧化摻雜態(tài)聚苯胺的還原而引起的.

2.2.2測(cè)試pH的優(yōu)化

魯米諾作為化學(xué)發(fā)光的主體，其ECL強(qiáng)度與電解液pH有關(guān)，為提高該ECL葡萄糖傳感器的靈敏度，本文對(duì)電極修飾后測(cè)試pH進(jìn)行優(yōu)化.如圖2(C)所示，pH在5.3～7.0范圍內(nèi)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光信號(hào)較弱，堿性環(huán)境下魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度迅速增大，至pH為8.3時(shí)達(dá)到最大，之后ECL強(qiáng)度迅速降低，這是由于葡萄糖氧化酶在強(qiáng)堿性條件下會(huì)迅速失活，因此選擇pH為8.3作為最優(yōu)的測(cè)試條件.

2.2.3魯米諾濃度的優(yōu)化

魯米諾作為電化學(xué)發(fā)光體，其濃度大小是決定其ECL強(qiáng)度最主要的因素.如圖2(D)所示，增加魯米諾濃度可增強(qiáng)ECL發(fā)光，當(dāng)其濃度為50 μmol/L時(shí)，ECL信號(hào)強(qiáng)度最高，即該傳感器靈敏度最大.這是由于在等量的共反應(yīng)劑條件下，高濃度的魯米諾會(huì)發(fā)生部分聚集，限制了其ECL的增強(qiáng)幅度.

2.2.4GOx負(fù)載量的優(yōu)化

GOx作為葡萄糖的特異性催化劑，HMPB上的負(fù)載量的優(yōu)化是提高電化學(xué)發(fā)光性能重點(diǎn)考察因素之一.圖2(E)結(jié)果表明，隨著GOx質(zhì)量濃度增大，在HMPB表面上的負(fù)載效率增加，質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)負(fù)載量適中，其催化性能最優(yōu)，當(dāng)GOx質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，電極表面電子的傳遞速率降低，而且包裹在內(nèi)部的HMPB不能有效催化H2O2分解使得ECL強(qiáng)度迅速降低.

2.2.5HMPB刻蝕時(shí)間優(yōu)化

HMPB比表面積的優(yōu)化是提高GOx負(fù)載量的關(guān)鍵，本文通過(guò)調(diào)控HCl對(duì)PB的刻蝕時(shí)間來(lái)控制HMPB空腔大小.圖2(F)結(jié)果表明，隨著刻蝕時(shí)間的增加HMPB的空腔逐漸增大，對(duì)GOx的負(fù)載量增多，能夠有效增強(qiáng)魯米諾的ECL強(qiáng)度，4.0 h為最佳.當(dāng)刻蝕時(shí)間達(dá)到4.5 h時(shí)，HMPB的產(chǎn)率和ECL強(qiáng)度均迅速降低，表明部分PB被刻蝕完全，HMPB的立方結(jié)構(gòu)出現(xiàn)殘缺導(dǎo)致負(fù)載的GOx的泄露.當(dāng)刻蝕時(shí)間為8.0 h時(shí)，PB被刻蝕完全，無(wú)法形成HMPB.

2.3 葡萄糖測(cè)定

在上述最優(yōu)條件下，該HMPB@GOx傳感器對(duì)葡萄糖進(jìn)行了定量測(cè)定.如圖3所示，ECL強(qiáng)度隨著葡萄糖濃度增加逐漸增強(qiáng)，僅在4 s達(dá)到最大，且ECL強(qiáng)度在葡萄糖濃度為3.3×10-2～167.0 μmol/L范圍成良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.99，檢出限為2.1×10-2μmol/L(LOD=3S/N)，這與以往報(bào)道的葡萄糖檢測(cè)體系相比，表現(xiàn)出較高的靈敏度和較低的檢測(cè)限(表1).這是由于雙功能的HMPB作為GOx的載體在不降低酶活性的前提下提高了GOx在電極表面的固載效率，同時(shí)催化原位生成的H2O2快速分解產(chǎn)生活性氧使得魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度級(jí)聯(lián)放大，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖的超靈敏測(cè)定.

表1 葡萄糖檢測(cè)方法與報(bào)道的ECL葡萄糖生物傳感器分析性能比較

2.4 選擇性和穩(wěn)定性研究

生物體液中存在多種電化學(xué)活性的物質(zhì)，如抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)和多巴胺(DA)等，這些物質(zhì)在葡萄糖檢測(cè)過(guò)程中會(huì)成為重要的干擾因素.因此，良好的葡萄糖選擇性是血糖檢測(cè)非常重要的指標(biāo).如圖4(A)所示，加入6.7 μmol/L的 AA，DA，UA后，該傳感器的ECL強(qiáng)度幾乎不發(fā)生變化，當(dāng)加入6.7 μmol/L葡萄糖后，傳感器的ECL強(qiáng)度顯著增加,結(jié)果表明,AA，DA，UA對(duì)葡萄糖檢測(cè)的影響可忽略不計(jì)，該傳感器具有良好的抗干擾能力.同時(shí)，考察了該ECL傳感器的穩(wěn)定性，在6.7 μmol/L的葡萄糖溶液中經(jīng)過(guò)19次循環(huán)，ECL強(qiáng)度仍保持在95%以上，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.74%(圖4(B))，表明傳感器具有較好的穩(wěn)定性及抗干擾能力.

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

為評(píng)價(jià)該傳感器在實(shí)際樣品中的檢測(cè)能力，分別將正常人的血清用PBS緩沖溶液(pH=8.3)10倍，100倍，1 000倍，5 000倍和10 000倍稀釋后檢測(cè)葡萄糖含量.如圖5所示,ECL強(qiáng)度與血清稀釋倍數(shù)在100～10 000倍范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性相關(guān)性系數(shù)R2=0.97,說(shuō)明本文構(gòu)建的傳感器對(duì)血清中的葡萄糖檢測(cè)非常靈敏.實(shí)際工作中，選取1 000倍稀釋的血清作為實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)試(表2)，結(jié)果與臨床結(jié)果基本吻合，表明基于HMPB@GOx構(gòu)建的ECL傳感器具有臨床檢測(cè)的應(yīng)用潛力.

表2 1 000倍稀釋血清中葡萄糖測(cè)定

3 結(jié) 論

本文通過(guò)簡(jiǎn)單的水熱-刻蝕法合成了一種立方結(jié)構(gòu)的中空介孔HMPB納米顆粒，控制刻蝕時(shí)間調(diào)控其空腔及比表面積，負(fù)載大量的GOx制備出HMPB@GOx納米復(fù)合物，進(jìn)而結(jié)合經(jīng)典的魯米諾-H2O2電化學(xué)發(fā)光體系構(gòu)建超靈敏葡萄糖傳感器.電化學(xué)測(cè)試結(jié)果表明該ECL傳感體系對(duì)葡萄糖的檢測(cè)范圍為3.3×10-2～167.0 μmol/L，檢測(cè)限低至2.1×10-2μmol/L，成功檢測(cè)實(shí)際血清中的葡萄糖含量.而且該傳感體系在其他電活性物質(zhì)如抗壞血酸(AA)，多巴胺(DA)和尿酸(UA)共存時(shí)仍對(duì)葡萄糖具有良好的選擇性和穩(wěn)定性.這些優(yōu)異特性主要?dú)w因于具有良好生物相容性的HMPB作為載體大量負(fù)載高活性的GOx催化葡萄糖氧化在電極表面原位生成H2O2，進(jìn)而作為H2O2的模擬酶迅速催化H2O2分解產(chǎn)生活性氧，級(jí)聯(lián)增強(qiáng)魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度.本研究拓寬了酶及納米材料在H2O2,葡萄糖檢測(cè)中的應(yīng)用，該傳感器檢測(cè)速度快、構(gòu)造簡(jiǎn)單、靈敏度高，具有開(kāi)發(fā)糖尿病患者血清中葡萄糖便攜檢測(cè)器件的潛力.