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    蒼耳子治療變應(yīng)性鼻炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析及作用機(jī)制研究

    2022-08-08 02:59:12李丹章秀梅宣自華劉叢彬俞年軍謝冬梅安徽中醫(yī)藥大學(xué)合肥23002安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所合肥23002中藥研究與開(kāi)發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室合肥23002
    中南藥學(xué) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:蒼耳子正丁醇靶點(diǎn)

    李丹,章秀梅,宣自華,劉叢彬,俞年軍,2,3,謝冬梅,2,3*(.安徽中醫(yī)藥大學(xué),合肥 23002;2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院 中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所,合肥 23002;3.中藥研究與開(kāi)發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 23002)

    變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又稱(chēng)過(guò)敏性鼻炎,是特異性個(gè)體的鼻黏膜受到過(guò)敏原的刺激后,IgE 的介導(dǎo)功能被激活而引起的鼻腔慢性炎癥性疾病。西醫(yī)臨床常用包括抗組胺藥物、糖皮質(zhì)激素、口服抗白三烯類(lèi)等藥物進(jìn)行治療,但是不同患者之間可能存在療效差異,且對(duì)持續(xù)性AR 需維持治療[1],因此尋找療效顯著的中藥顯得尤為重要。

    蒼耳子(Xanthii Fructus)為菊科植物蒼耳(Xanthium sibiricumPatr.)的干燥成熟帶總苞的果實(shí),具有散風(fēng)寒、通鼻竅、祛風(fēng)濕的功效[2],為歷代醫(yī)家常用的鼻科要藥?,F(xiàn)代研究表明,蒼耳子含有揮發(fā)油類(lèi)、甾醇類(lèi)、倍半萜內(nèi)酯類(lèi)、水溶性苷類(lèi)、酚酸及其衍生物、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)等化合物[3-6],其抗炎作用已得到相關(guān)學(xué)者的認(rèn)可[7]。但是對(duì)蒼耳子發(fā)揮抗炎活性的機(jī)制仍不清晰,因此本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)蒼耳子治療AR 的主要化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析;同時(shí),通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)得到的通路上的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),探究蒼耳子治療AR 的活性成分及其作用機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

    1.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)篩選 查閱文獻(xiàn),并搜索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMSP,https://tcmspw. com/index. php),整理數(shù)據(jù)庫(kù)中蒼耳子的全部成分。對(duì)搜索得到的化學(xué)成分保存后導(dǎo)入SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)中,進(jìn)行預(yù)測(cè)分析確定出其作用靶點(diǎn);按照Uniprot 編號(hào),在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找對(duì)應(yīng)的gene offical sympol 格式,將其作為靶點(diǎn)基因保存。

    1.1.2 成分-炎癥疾病的交集靶點(diǎn)分析 以“rhinitis”為關(guān)鍵詞,在DisGeNET 相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜索,確定出可能的靶點(diǎn),接著基于中位數(shù)篩選“Relevance score”值,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行搜索得到滿(mǎn)足相關(guān)要求的靶點(diǎn)信息。合并處理提取的信息,刪除其中重復(fù)項(xiàng)后,將對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn 工具中進(jìn)行繪圖處理,從而確定出相關(guān)的交集靶點(diǎn)。

    1.1.3 靶點(diǎn)的GO 及KEGG 通路富集分析 核心靶點(diǎn)確定后導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)中,設(shè)定物種為“人類(lèi)”,開(kāi)展GO 生物功能富集處理,從而確定出生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組成(cell composition,CC)、分子功能(molecular function,MF)富集分析;KEGG 通路在富集研究時(shí)選擇同樣的數(shù)據(jù)庫(kù),將以上確定出的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1 中進(jìn)行相關(guān)性分析,從而得到成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

    1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

    1.2.1 儀器與試藥 SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(ASPEN 公司);RIPA 總蛋白裂解液、BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(ASPEN 公司);ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);GAPDH 抗體(ab37168)(Abcam 公司);PI3K 抗體(CST 4249);Akt 抗體(CST 9272);P-Akt抗體(CST 4060);IL-4 ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):05/2021)、IFN-γELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):05/2021)、IgE ELISA 檢測(cè)試劑盒(批號(hào):05/2021)(上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司)。

    1.2.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)健康SD 大鼠60 只,雌雄各半,體質(zhì)量200 ~250 g [濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,許可證號(hào):SCXK(魯)20190003]。

    1.2.3 藥物的制備 蒼耳子藥材購(gòu)于安徽省亳州藥材市場(chǎng),經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)謝冬梅副教授鑒定為菊科植物蒼耳(Xanthium sibiricumPatr.)成熟帶總苞的果實(shí)。取蒼耳子藥材500 g,自然干燥后粉碎,參考文獻(xiàn)中的煎煮法進(jìn)行提取,獲得蒼耳子石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取部位[8]。

    1.2.4 AR 模型大鼠的復(fù)制 參照課題組前期的造模方法[9]制備AR 大鼠模型?;A(chǔ)致敏階段:以150 mg 雞卵清蛋白(ovalbumin,OVA)作為抗原,15 g 氫氧化鋁粉末作為佐劑,兩者共同混懸于50 mL 生理鹽水中,作為致敏劑。采用腹腔注射的方法,每只大鼠注射致敏劑1 mL,隔日1次,共進(jìn)行7 次基礎(chǔ)致敏,用時(shí)14 d,正常組大鼠腹腔注射等容積的生理鹽水。局部刺激階段:第15 ~21日采用滴鼻法,以2% OVA 生理鹽水溶液滴入大鼠兩側(cè)鼻孔,每側(cè)50 μL,每日1 次,正常組大鼠以等容積的生理鹽水進(jìn)行滴鼻。造模成功后,需要以2%OVA 生理鹽水溶液隔日滴鼻維持對(duì)鼻部的刺激以及過(guò)敏性癥狀直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

    1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 將造模成功的大鼠重新隨機(jī)分成模型組、氯雷他定組、石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組和總水提物組。各給藥組大鼠通過(guò)灌胃分別給予相應(yīng)的藥物,每日1 次,共給藥14 次。氯雷他定給藥劑量為2 mg·kg-1;石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位受試物以及總水提物的給藥劑量為5 g(生藥)·kg-1,各組大鼠的給藥體系均為1 mL/100 g。模型組和正常組大鼠灌胃給予等容積的生理鹽水。

    1.2.6 鼻黏膜組織病理觀察 末次給藥1 h 后,用10%水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血后剝除上頜骨部的皮膚,取出整個(gè)鼻甲后放入4%甲醛固定,制作病理切片,在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照、分析。

    1.2.7 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥1 h 后,用10%水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血5 ~10 mL,在離心管中靜置2 h 后,3000 r·min-1離心10 min,收集血清,于-20℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩z測(cè)前取出,室溫下放置1 h 后按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,分別對(duì)大鼠血清中IgE、IL-4 和IFN-γ的含量進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.8 Western blot 實(shí)驗(yàn) 取大鼠鼻腔黏膜組織,采用液氮研磨法,以1∶10 比例(0.1 g 組織∶1 mL裂解液)進(jìn)行研磨,12 000 r·min-1離心10 min,取上清液,用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。制備樣品,采用SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒制備10%的分離膠和5%的濃縮膠,上樣,電泳,PVDF 轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉2 h 后加一抗,其中內(nèi)參1∶5000,其他抗體1∶1000,過(guò)夜,TBST 沖洗3次,加入二抗1∶5000,TBST 沖洗3 次,ECL 發(fā)光液顯影。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

    在研究過(guò)程中基于SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,同時(shí)利用GraphPad Prism6.0 軟件工具進(jìn)行繪圖,連續(xù)變量用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間結(jié)果差異進(jìn)行單因素方差分析,計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)通過(guò)百分比描述,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

    2.1.1 成分庫(kù)的構(gòu)建與篩選 搜索蒼耳子化學(xué)成分,共得到138 種化學(xué)成分,去掉無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的成分,共得到了23 個(gè)潛在有效成分,其中羧基蒼術(shù)苷、洋薊素(1,3-二咖啡??鼘幩幔?、N-反式-阿魏酰酪胺、噻嗪二酮在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息,故蒼耳子最終得到19 個(gè)潛在有效成分,具體信息見(jiàn)表1。

    表1 蒼耳子潛在有效成分Tab 1 Potential active components inXanthii Fructus

    2.1.2 化合物靶點(diǎn)的篩選 將搜集到的化學(xué)成分導(dǎo)入SwissADME 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swissadme.ch),對(duì)搜集到的蒼耳子活性成分進(jìn)行篩選,將篩選得到的化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入SwissTargetPrediction(www.sib.swiss)數(shù)據(jù)庫(kù),預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn);按照Uniprot 編號(hào),在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中查找對(duì)應(yīng)的gene offical sympol 格式,將其作為靶點(diǎn)基因保存。將篩選的各活性成分化合物的靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)照,得到各個(gè)活性成分的潛在抗炎靶點(diǎn)基因,綜合后獲得217 個(gè)蒼耳子潛在抗炎靶點(diǎn)基因。

    2.1.3 成分-疾病的交集靶點(diǎn)分析 以“rhinitis”為關(guān)鍵詞,在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)到有關(guān)疾病候選靶點(diǎn)10 275 個(gè),通過(guò)“Relevance score”取中位數(shù)(n≥12.43),篩選得到2803 個(gè)相關(guān)疾病靶點(diǎn)。藥物與疾病的交集靶點(diǎn)共108 個(gè),提示這些靶點(diǎn)可能是蒼耳子抗鼻炎作用的潛在靶點(diǎn)。

    2.1.4 成分-疾病靶點(diǎn)的 GO 生物功能及 KEGG 信號(hào)通路富集分析 將得到的108 個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù),物種選擇為“人類(lèi)”,共確定1859 個(gè)GO 條目(P<0.01),其中BP 有1632 個(gè)條目,主要涉及白細(xì)胞遷移(leukocyte migration)、積極調(diào)控細(xì)胞遷移(positive regulation of cell migration)、對(duì)受傷的反應(yīng)(response to wounding)、細(xì)胞對(duì)激素刺激的反應(yīng)(cellular response tohormone stimulus);CC 有99 個(gè)條目,主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)、膜區(qū)域(membrane region)、溶酶體(lysosome)等;MF 有128 個(gè)條目,主要涉及蛋白激酶活性(protein kinase activity)、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(phosphotransferase activity)、生長(zhǎng)因子結(jié)合(growth factor binding)、受體配體活動(dòng)(receptor ligand activity)。每項(xiàng)取P值前10 位條目,見(jiàn)圖1。

    圖1 成分-疾病靶點(diǎn)的GO 生物功能富集分析Fig 1 GO biological enrichment analysis of component-disease targets

    將比對(duì)得到的108 個(gè)核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù),限定物種為“人類(lèi)”,對(duì)其進(jìn)行KEGG信號(hào)通路功能富集分析,共確定292 個(gè)條目(P<0.01),根據(jù)-log10(P)值的大小取前20位KEGG 信號(hào)通路,見(jiàn)圖2。主要涉及癌癥通路、乙型肝炎、MAPK 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等。以上通路表明,蒼耳子活性成分與抗炎作用密切相關(guān),詳見(jiàn)表2。

    圖2 KEGG 富集分析氣泡圖Fig 2 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis

    表2 成分-疾病靶點(diǎn)的KEGG 信號(hào)通路(前20 條)Tab 2 KEGG signaling pathways of component-disease targets (top 20 items)

    2.1.5 成分-靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 上述的20條通路,包含108 個(gè)靶點(diǎn),涉及19 個(gè)成分,將其導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1 軟件,構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。紅色圓形為中藥蒼耳子,紫色正方形為蒼耳子的主要活性成分,黃色菱形為關(guān)鍵靶點(diǎn),綠色六邊形為關(guān)鍵通路,圖形面積大小和顏色深淺與Degree 值成正比,如圖3所示。根據(jù)Degree 值,排名前5 位的靶點(diǎn)為CASP3、TP53、TNF、MYC、PIK3CG。以上信息提示這些靶點(diǎn)可能是蒼耳子發(fā)揮抗炎作用的重要靶點(diǎn)。

    圖3 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Component-target-pathway network diagram

    2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

    2.2.1 鼻黏膜組織病理變化 各組大鼠鼻黏膜組織經(jīng)HE 染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察,結(jié)果正常組大鼠鼻黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)完整,血管正常,組織未發(fā)生水腫,無(wú)浸潤(rùn)的嗜酸性粒細(xì)胞(見(jiàn)圖4A);模型組大鼠鼻黏膜上皮組織發(fā)生脫落,血管擴(kuò)張充血,組織出現(xiàn)水腫,可見(jiàn)大量的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖4B);氯雷他定組及總水提液組大鼠鼻黏膜上皮組織基本完整,未見(jiàn)明顯擴(kuò)張的小血管,有少量浸潤(rùn)的嗜酸性粒細(xì)胞(見(jiàn)圖4C及4D);石油醚組大鼠鼻黏膜上皮組織脫落不明顯,小血管充血擴(kuò)張,伴有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖4E);乙酸乙酯組大鼠鼻黏膜上皮組織脫落,血管擴(kuò)張,組織水腫,可見(jiàn)大量浸潤(rùn)的嗜酸性粒細(xì)胞(見(jiàn)圖4F);正丁醇部位組大鼠鼻黏膜上皮組織結(jié)構(gòu)較為完整,血管無(wú)明顯擴(kuò)張的現(xiàn)象,有嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖4G)。

    圖4 各組大鼠鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)變化比較(HE 染色,×200)Fig 4 Morphological changes in the nasal mucosa of the rats in each group(HE staining,×200)

    2.2.2 對(duì)大鼠血清中IgE、IL-4 及IFN-γ水平的影響

    各組大鼠血清中IgE、IL-4 及IFN-γ水平見(jiàn)表3。模型組大鼠血清中IgE 和IL-4 水平均明顯高于正常組,IFN-γ水平明顯低于正常組。與模型組相比,氯雷他定組、正丁醇組和總水提液組大鼠血清中IgE水平均明顯低于模型組;石油醚組和乙酸乙酯組無(wú)顯著性差異;各給藥組大鼠血清IL-4 水平較模型組含量均顯著降低,IFN-γ水平明顯升高。

    表3 各組大鼠血清中IL-4、IFN-γ 及IgE 的水平(n =8)Tab 3 Level of IL-4,IFN-γ and IgE in the rat serum in each group(n =8)

    2.2.3 鼻黏膜組織PI3K、P-AKT、AKT 蛋白表達(dá)水平 與正常組相比,模型組PI3K 表達(dá)明顯增加;與模型組相比,石油醚組,乙酸乙酯組與總水提液組PI3K 表達(dá)無(wú)顯著性差異;正丁醇組PI3K 表達(dá)顯著降低。與正常組相比,模型組P-AKT 表達(dá)顯著增加;與模型組相比,石油醚組、總水提液組和正丁醇組P-AKT 蛋白表達(dá)明顯降低,乙酸乙酯組P-AKT 蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異;與正丁醇組相比,總水提液組和氯雷他定組P-AKT 蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異,石油醚組和乙酸乙酯組P-AKT 蛋白表達(dá)顯著性增加。各組大鼠AKT 總蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

    圖5 各組大鼠鼻黏膜組織PI3K、P-AKT、AKT 蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig 5 Relative expression levels of PI3K,P-Akt and AKT in the nasal mucosal of the rats in teach group

    3 討論與結(jié)論

    AR 作為一種常見(jiàn)的免疫異常類(lèi)疾病,全球患有AR 者已超過(guò)5 億,目前已成為主要的呼吸道慢性炎性疾病,給患者的生活質(zhì)量和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)了負(fù)面影響[10]。中醫(yī)認(rèn)為AR 屬于“鼻鼽”的范疇,認(rèn)為正氣不足、外邪侵襲是導(dǎo)致鼻鼽發(fā)生的主要原因[11]。機(jī)體免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視、防御、調(diào)控機(jī)體的作用,這與“中醫(yī)正氣”抵御外邪入侵、驅(qū)邪外出、修復(fù)調(diào)節(jié)能力及維持臟腑經(jīng)絡(luò)的功能相似。因而治療AR 需“扶正祛邪”,增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力。蒼耳子作為一味傳統(tǒng)中藥材,已在臨床上使用上千年,常被廣泛用作發(fā)散風(fēng)寒藥,其最主要功效為“通鼻竅”作用,被稱(chēng)為“鼻科要藥”。蒼耳子臨床常用于治療鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵等病癥,具有很好的療效,但是對(duì)其藥效作用機(jī)制仍需要不斷研究。

    蒼耳子臨床使用多為水煎煮法,本研究旨在研究蒼耳子水提取部位中的有效成分對(duì)AR 的影響。蒼耳子經(jīng)過(guò)水煎煮法后依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取,咖啡酸、肉桂酸、阿魏酸、香草酸、綠原酸和丁二酸等水溶性成分,可出現(xiàn)在各個(gè)萃取部位中[8]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得到PIK3CA、AKT1、MAPK1 等108 個(gè)蒼耳子核心治療AR 的靶點(diǎn),GO 分析結(jié)果主要涉及磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖等。KEGG分析結(jié)果得到292 條通路,主要有涉及癌癥通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、乙型肝炎、MAPK 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路等。其中PI3K-Akt 信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,廣泛存在于細(xì)胞中,調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及分化等功能。有研究表明PI3K-Akt 信號(hào)通路參與了炎性痛的形成與發(fā)展,在炎癥部位損失組織及脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá),阻斷或抑制PI3K/Akt/NF-κB 信號(hào)通路可緩解和減輕炎性痛的發(fā)生發(fā)展[12]。

    本研究通過(guò)給予大鼠蒼耳子不同提取部位,探究其作用機(jī)制,對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。AR 發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)Th1/Th2 平衡與AR 的發(fā)病過(guò)程有著密切的聯(lián)系,IL-4 和IFN-γ等Th 細(xì)胞因子參與了AR 的發(fā)病過(guò)程,并且對(duì)AR 的發(fā)生發(fā)展具有重要的影響。IL-4 和IFN-γ間存在著拮抗關(guān)系,能夠互相調(diào)節(jié),Th1 細(xì)胞釋放的IFN-γ可以抑制Th2 的活化,進(jìn)而抑制IgE 的產(chǎn)生。當(dāng)γ-干擾素的釋放量缺少時(shí),Th2 細(xì)胞因子功能亢進(jìn),分泌的IL-4 增多,誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞釋放IgE,導(dǎo)致AR 發(fā)生[13]。通過(guò)觀察鼻黏膜病理學(xué)變化可以科學(xué)地反映AR 的變化情況,并且可以直接根據(jù)AR 大鼠鼻黏膜組織病理變化及血清中IL-4、IFN-γ及IgE 濃度判斷造模是否成功。本研究綜合分析各種檢測(cè)指標(biāo)的結(jié)果,蒼耳子水提液經(jīng)萃取得到的正丁醇部位可以減輕AR 大鼠打噴嚏、流鼻涕等過(guò)敏性癥狀,改善鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)的變化,降低血清中IL-4 和IgE 的水平,升高IFN-γ的水平,可能是蒼耳子發(fā)揮治療AR 的作用的活性部位。KEGG 結(jié)果表明PI3K/AKT 通路為蒼耳子治療AR 的關(guān)鍵通路。袁家勝[14]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)敲除小鼠的CCR3基因可以降低PI3K/AKT 信號(hào)通路的激活水平,緩解小鼠AR癥狀。Chen 等[15]發(fā)現(xiàn)屋塵螨(HDM)提取物刺激的鼻上皮細(xì)胞(NEC)和體外刺激得到的AR 模型小鼠鼻黏膜組織中均發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 通路表達(dá)被激活。PI3K/AKT 通路和中性粒細(xì)胞關(guān)系密切,其下游因子對(duì)中性粒細(xì)胞的趨化和存活有重要影響。PI3K/AKT 通路可以通過(guò)活化HIF-1α,來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的活性;調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的功能;調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AR 模型大鼠鼻黏膜組織中PI3K 和P-AKT 蛋白表達(dá)增加,AKT 總蛋白含量無(wú)明顯變化。給予藥物治療干預(yù)后,各給藥組PI3K、P-AKT蛋白表達(dá)下調(diào)且正丁醇組的蛋白表達(dá)量下調(diào)最為顯著。由此推斷,蒼耳子正丁醇部位可抑制PI3K蛋白表達(dá),而使得AKT 蛋白磷酸化被抑制,減輕鼻部炎性癥狀。

    綜上,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了治療AR 的靶點(diǎn)與通路,通過(guò)鼻黏膜組織HE 染色,血清炎癥因子IL-4、IFN-γ及IgE 及鼻黏膜組織中PI3K、AKT、P-AKT 蛋白的檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,初步揭示了蒼耳子正丁醇部位治療AR 的作用機(jī)制,為后期繼續(xù)探索其治療AR 機(jī)制提供理論依據(jù)。

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