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    布地奈德直腸用脂質體溫敏凝膠制備工藝的研究

    2022-08-08 02:59:10楊東亮馬瑞麗趙宇郁滕亮馬桂芝高曉黎新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部烏魯木齊80054新疆醫(yī)科大學藥學院烏魯木齊800慶陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科甘肅慶陽745099
    中南藥學 2022年5期
    關鍵詞:溫敏膠凝脂質體

    楊東亮,馬瑞麗,趙宇郁,滕亮,馬桂芝*,高曉黎(. 新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥學部,烏魯木齊80054;. 新疆醫(yī)科大學 藥學院,烏魯木齊 800;. 慶陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,甘肅 慶陽 745099)

    潰瘍性結腸炎(UC)是結直腸的一種慢性免疫介導的炎癥性疾病[1],病因尚不明確,且暫無法治愈,如果不及時治療,可導致黏膜損傷及結直腸癌等致命并發(fā)癥[2]。在全球范圍內,UC 的發(fā)病率呈上升趨勢[3],近二十余年來,我國UC的就診人數(shù)快速增長[4]。UC 一般均以連續(xù)性分布的方式,從直腸向近端結腸擴展,在中國病變的主要部位為直腸、直-乙狀結腸、左側結腸。糖皮質激素是活動期UC 誘導緩解治療的重要藥物,臨床??诜蜢o脈給予糖皮質激素,但全身用藥易出現(xiàn)藥物不良反應并存在諸多限制,且局部藥物濃度低[5]。布地奈德(budesonide,Bud)是第二代皮質類固醇類激素,具有局部抗炎作用強,全身不良反應少的優(yōu)點,可有效緩解輕中度UC 患者的癥狀[6]。

    目前,臨床常使用吸入用Bud 混懸劑灌腸[7],但混懸劑幾乎沒有生物黏附性,在腸道保留時間短,且?guī)缀醪蝗苡谒?、局部吸收差,影響療效。故本研究利用脂質體的特性增加藥物溶解度、提高黏膜滯留性能、升高靶部位濃度、減少藥物入血[8];同時,利用溫敏凝膠常溫下為液態(tài)、體溫下為凝膠的特點,促進藥物的均勻分布、提高局部黏附性能,以對抗腸道的自蠕動[9-10]。本研究將Bud 制備成脂質體后再進一步制成脂質體溫敏凝膠,使其兼顧脂質體和溫敏凝膠的優(yōu)勢:給藥前為液體狀態(tài),到達給藥部位后均勻分布,后迅速相變?yōu)槟z黏附于腸黏膜,進一步通過脂質體實現(xiàn)靶向作用,提高療效,降低不良反應。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    LC-20AD 高效液相色譜儀(日本島津公司);New Classic MS 分析天平(梅特勒-托利多公司,d =0.01 mg);KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Zetasizer Nano ZS 納米激光粒徑測定儀(英國馬爾文儀器有限公司);PS-1000 磁力攪拌器(東京理化器械株式會社);3-18KS 臺式高速冷凍離心機(SIGMA公司);VCX500 超聲波細胞破碎儀(Sonics &Materials Inc);TP-6 智能透皮試驗儀(天津市鑫洲科技有限公司);PHSJ-3F 雷磁pH 計(上海儀電科學儀器有限公司);NDJ-5S 數(shù)字式黏度計(上海菁海儀器有限公司);Milli-Q 艾柯超純水儀(美國密理博公司)。

    1.2 試藥

    Bud 對照品(上海源葉生物科技有限公司,批號:Y13J7C9082,純度≥ 98%);Bud 原料藥(山東泰華生物科技有限公司,批號:20190906,純度≥ 99%);大豆磷脂(批號:SYSO-200401)、膽固醇(批號:B80859)(上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司);泊洛沙姆407、泊洛沙姆188(北京索萊寶科技有限公司);羥丙基甲基纖維素(上海麥克林生化科技有限公司);醋酸纖維素膜(孔徑:0.45 μm,尺寸:50 mm)(上海市新亞凈化器件廠);甲醇為色譜純,水為超純水,其他試劑均為分析純。

    2 方法與結果

    2.1 Bud 的含量測定

    2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),以甲醇-水(72∶28)為流動相等度洗脫,檢測波長260 nm,進樣量10μL,流速1 mL·min-1,柱溫25℃。

    2.1.2 溶液的配制 取Bud 對照品適量,精密稱定,置25 mL 量瓶中,加甲醇超聲溶解并定容,即得質量濃度為196.4 μg·mL-1的對照品儲備液。精密移取對照品儲備液適量,用甲醇依次稀釋為0.38、0.77、1.53、3.07、6.14、12.28、24.55、49.1、98.2 μg·mL-1的系列對照品溶液。

    分別取Bud 對照品溶液、Bud 脂質體、Bud脂質體溫敏凝膠1.0 mL,甲醇定容,超聲,以0.22 μm 微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

    制備不含Bud 的空白脂質體、空白脂質體溫敏凝膠,各取1.0 mL,甲醇定容,超聲,以0.22 μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得陰性樣品溶液。

    2.1.3 專屬性考察 取Bud 對照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL,進樣分析,記錄色譜圖,結果見圖1,基質對Bud 測定無干擾[11]。

    圖1 Bud 脂質體及Bud 脂質體溫敏凝膠的HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of Bud liposomes and Bud liposome temperature sensitive gel

    2.1.4 線性關系考察 測定系列對照品溶液,以峰面積(Y)對Bud 質量濃度(X)進行線性回歸,得回歸方程Y=1.59×104X+1.993×103(r=0.9999)。結果表明,Bud 在0.38 ~98.2 μg·mL-1與峰面積線性關系良好。

    2.1.5 方法學考察 取供試品溶液連續(xù)測定6 次,測得精密度RSD為0.30%。于常溫下供試品分別放置0、2、4、6、8、10、12 h,測得穩(wěn)定性RSD為1.1%。平行制備6 份供試品溶液,測得重復性RSD為1.7%。精密量取已知濃度樣品9 份,加低、中、高濃度對照品溶液,測得平均加樣回收率在98.7%~100.2%,RSD均<2.0%。

    2.2 Bud 脂質體的制備

    2.2.1 制備工藝優(yōu)選指標 以包封率、載藥量和粒徑作為考察指標,綜合分析。結合層次分析法確定的權重系數(shù),得到綜合評分Y=包封率/包封率最大值×0.7306+載藥量/載藥量最大值×0.1884+粒徑最小值/粒徑×0.0810[11]。

    2.2.2 Bud 脂質體的制備工藝 根據(jù)Bud 性質,采用逆向蒸發(fā)法制備Bud 脂質體。精密稱取Bud原料藥、膽固醇和大豆磷脂適量于250 mL 圓底燒瓶中,加入20 mL 氯仿超聲使其溶解,再按有機相與水相的體積比加入超純水,水浴超聲10 min形成穩(wěn)定的W/O型乳液,40℃下減壓蒸發(fā)除去有機溶劑,加入超純水,繼續(xù)旋轉蒸發(fā),于冰浴條件下超聲,即得Bud 脂質體,于3 ~5℃保存[12]。

    2.2.3 Bud 脂質體制備工藝單因素的考察 測定各脂質體包封率、載藥量和粒徑,以綜合評分Y為指標,按“2.2.2”項下方法考察膜材比(3∶1、6∶1、9∶1、12∶1 和15∶1)、脂藥比(2∶1、6∶1、10∶1、14∶1 和18∶1)、有機相與水相比例(V有機/V水相為2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 和6∶1)、乳化時間(6、8、10、12 和14 min)、孵育溫度(20、30、40、50 和60℃)、分散時間(10、15、20、25和30 s)等因素對Bud 脂質體綜合指標的影響。結果,在膜材比為9∶1、脂藥比為6∶1、V有機/V水相為4∶1、乳化時間12 min、孵育溫度50 ℃、分散時間15 s 時,所制脂質體包封率較高。

    2.2.4 星點設計-效應面法優(yōu)化制備工藝 在單因素試驗的基礎上,選取脂藥比和V有機/V水相兩個對指標影響較大的因素,設計二因素三水平的星點設計-效應面法優(yōu)化Bud 脂質體制備工藝。因素水平見表1,以綜合評分Y為考察指標,按照星點設計-響應面法設計進行試驗見表2、圖2,方差分析結果見表3。

    表3 方差分析Tab 3 Analysis of variance

    圖2 Bud 脂質體制備工藝優(yōu)化的效應面圖Fig 2 Response surface for optimization of preparation process of budesonide liposomes

    表1 星點設計-效應面法的因素水平表Tab 1 Factor and level of central composite design-response surface method

    采用Design-Expert 10.0.7 軟件對表2數(shù)據(jù)進行擬合,得到綜合評分Y的回歸方程為Y=0.8897 - 0.0854A+ 0.0527B- 5.9275AB-0.0874A2-0.0902B2,模型P<0.01,與數(shù)據(jù)的擬合度好,誤差低,可用于進一步分析與檢測。通過Design-Expert 10.0.7 軟件對優(yōu)選的制備工藝條件進行預測,A=4.5∶1,B=4.0∶1,Y的預測值為0.92。應用Design-Expert 10.0.7 軟件對優(yōu)選的制備工藝條件進行預測,A=4.5∶1,B=4.0∶1,Y的預測值為0.92。結合實際操作條件,初步確定優(yōu)選工藝參數(shù)為:脂藥比4.5∶1,V有機/V水相=4.0∶1,按照優(yōu)選參數(shù),采用逆向蒸發(fā)法制備3 批Bud 脂質體。結果表明,3 批樣本的包封率為(82.15±0.34)%、載藥量為(12.71±0.34)%、粒徑為(273.8±3.4)nm、Y為(0.95±0.01),說明工藝穩(wěn)定可行,重現(xiàn)性好。

    表2 星點設計-效應面法的結果Tab 2 Central composite design-response surface method

    2.3 Bud 脂質體溫敏凝膠的制備

    采用冷溶法制備Bud 脂質體溫敏凝膠。精密稱取泊洛沙姆407(P407)、泊洛沙姆188(P188)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)適量,在磁力攪拌下緩慢加入到一定量的脂質體中,攪拌均勻后,于4 ℃下靜置溶脹24 h,即得。

    2.4 Bud 脂質體溫敏凝膠工藝優(yōu)選指標

    2.4.1 膠凝溫度 采用試管倒置法[13]測定膠凝溫度。試管中加2 mL 凝膠溶液,插入溫度計,置恒溫水浴鍋中,從25 ℃開始緩慢升溫,每隔0.2 ℃將試管傾斜180°以觀察溶液的流動情況。溶液不流動時的最低溫度即為膠凝溫度,重復3次取平均值。

    2.4.2 累積釋放度的測定 采用Franz 擴散池對藥物的累積釋放度進行測定[14]。供給池和接收池間以半透膜隔離。向接收池中加入恒溫至37.5℃的磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)釋放介質,將Franz 擴散池置于37.5℃恒溫水浴磁力攪拌器中。取Bud 脂質體溫敏凝膠1.0 mL,加入到供給池中,放置10 min,待凝膠膠凝后開始攪拌。分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h 各取樣0.4 mL,同時補充恒溫介質0.4 mL。按“2.1.1”項下方法測定Bud含量。

    2.4.3 評價指標——綜合評分法 以膠凝溫度(Y1)和累積釋放度(Y2)的綜合評分(Y)為評價指標[15],其中:

    Y1=膠凝溫度/32 ℃,Y1評分實行分段評分,即:當Y1≥1時,Y1評分=1/Y1×80;當Y1<1 時,Y1評分=Y1×80;

    Y2=∣Q2h-20%∣+∣Q6h-50%∣+∣Q12h-80%∣,Y2評分=Y2min/Y2×20;

    Y=Y1評分+Y2評分。Y值越大指標越好。其中,Q2h、Q6h、Q8h分別為2 h、6 h、8 h 后的累積釋放度;Y2min為Y2最小值。

    2.5 單因素對處方用量的考察

    2.5.1 P407 用量的考察 固定處方中其他用量,分別加入14%、16%、18%、20%、22%、24%的P407 制備Bud 脂質體溫敏凝膠,測定膠凝溫度分別為38.8、36.2、33.5、31.0、30.0、29.0℃。表明隨著P407 用量的增加,膠凝溫度逐漸降低,當P407 的用量小于16%時,溫敏凝膠在37℃仍未發(fā)生膠凝。

    2.5.2 P188 用量的考察 固定處方中其他用量,分別加入1%、2%、3%、4%、5%、6%的P188制備Bud 脂質體溫敏凝膠,測定膠凝溫度分別為28.9、30.8、33.5、35.5、37.2、39.0℃。表明隨著P188 用量的增加,膠凝溫度逐漸增大,當P188 的用量大于5%時,溫敏凝膠在37.5℃仍未發(fā)生膠凝。

    2.5.3 HPMC 用量的考察 固定處方中其他用量,分別加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的HPMC 制備Bud 脂質體溫敏凝膠,測定膠凝溫度分別為34.3、34.0、33.8、33.6、33.5℃。表明隨著HPMC 用量的增加,膠凝溫度逐漸減小,但減小的趨勢不顯著。

    2.6 正交試驗優(yōu)選溫敏凝膠的處方組成

    根據(jù)單因素試驗,確定各因素的水平,以“2.4.3”項下Y為綜合評價指標,進行L16(45)正交試驗,因素水平見表4,正交試驗結果見表5,方差分析見表6。

    表4 正交試驗設計的因素水平(%)Tab 4 Factor and level of orthogonal test (%)

    由表5及表6中可知,處方中各因素對Bud脂質體溫敏凝膠質量的影響程度依次為AB >A >C >B,優(yōu)選水平組合為A3B3C1,即優(yōu)選處方為P407 用量20%、P188 用量4%、HPMC 用量0.4%。

    表5 正交試驗設計與結果Tab 5 Orthogonal test

    表6 方差分析Tab 6 Variance analysis

    2.7 最佳工藝的驗證

    按優(yōu)化的最佳工藝條件平行制備3 批樣品,平均膠凝溫度為(33.1±0.1)℃;平均體外累積釋放度Q2h(13.6±0.2)%、Q6h(41.6±0.4)%、Q12h(72.6±1.1)%;平均綜合評分(90.12±0.43);分別用超純水將3 批樣本稀釋10 倍,置于NDJ-5S數(shù)字式粘度計樣品池中,通過Zetasizer Nano ZS納米激光粒徑測定儀對其粒徑和Zeta 電位進行測定,每個樣平行測3 次。分別用超純水將3 批樣本稀釋10 倍,置于NDJ-5S 數(shù)字式粘度計樣品池中,通過Zetasizer Nano ZS 納米激光粒徑測定儀對其粒徑和Zeta 電位進行測定,每個樣平行測3次。平均粒徑為(285.2±6.7)nm,平均Zeta 電位為-(45.8±5.3)mV,分布見圖3。制備的脂質體的平均粒經和平均Zeta 電位分別為(273.8±3.4)nm 和-(31.9±2.16)mV,可知制成脂質體溫敏凝膠后粒徑和Zeta 電位絕對值有增大的趨勢,但影響不明顯。經驗證該Bud 脂質體溫敏凝膠在體溫條件下能迅速膠凝,且累積釋藥性能良好。

    圖3 Bud 脂質體溫敏凝膠的粒徑(A)和 Zeta 電位分布(B)Fig 3 Particle size(A)and Zeta potential distribution(B)of Bud liposome temperature sensitive gel

    2.8 穩(wěn)定性初步考察

    按最佳處方工藝制備Bud 脂質體溫敏凝膠,置密閉西林瓶中,于4℃冰箱避光保存,分別于第0、15、30、45、60日取樣,觀察外觀性狀,測定膠凝溫度及藥物含量。結果表明在考察的時間范圍內,Bud 脂質體溫敏凝膠外觀、膠凝溫度、含量、粒徑和Zeta 電位無明顯變化,可滿足后續(xù)藥效學和藥動學的研究要求。

    3 討論

    Bud 為親脂性藥物,幾乎不溶于水,難以有效分散于水溶性凝膠中,故將其包裹于脂質體,以有效分散于溫敏凝膠中,從而發(fā)揮緩釋、局部靶向作用[16]。Bud 脂質體溫敏凝膠,在常溫下為自由流動的液體,在灌腸后可快速均勻分布于降結腸、乙狀結腸、直腸,后在體溫調節(jié)下迅速膠凝,黏度升高以對抗腸道自蠕動。另外,脂質體還可提高局部黏膜的滯留量,減少全身作用[8]。包封率、載藥量、粒徑、分散指數(shù)、電位等均為評價脂質體制備工藝的指標,一方面指標過多容易導致試驗難度增加;另一方面,預試驗中各考察因素對分散指數(shù)和電位并無顯著影響,故選擇包封率、載藥量和粒徑為指標,采用加權后綜合評分進行全面評價,不僅能全面反映各檢測指標對脂質體的重要程度,也能直觀反映整體制備工藝[11]。

    膠凝溫度是溫敏凝膠的一個重要指標,溫敏凝膠灌腸后,若在病灶部位短時間內不能相變,會因腸道自蠕動作用而漏出,且凝膠所載藥物會發(fā)生突釋,降低制劑的緩釋作用,因此選擇膠凝溫度在30 ~34℃為宜[16]。為保證該直腸給藥系統(tǒng)在室溫下為液態(tài),便于給藥和分布,進入直腸后迅速的膠凝,本研究以32℃為膠凝溫度的參考溫度[17]。然而,制劑質量的好壞不只取決于膠凝溫度,還與合適溫度下藥物能否充分釋放有關。故本研究在單因素篩選出各基質的合理范圍后,繼以膠凝溫度和累積釋放度的綜合評分為指標,使優(yōu)選出的Bud 脂質體溫敏凝膠在生理溫度下迅速膠凝,發(fā)揮良好的釋藥作用。

    在篩選處方時,P407 的質量分數(shù)影響最為顯著,這與P407 在處方中的作用與貢獻是一致的。泊洛沙姆分子是排列整齊的Z 字形結構。當溫度升高時,Z 字形結構可能轉變?yōu)槔p繞緊密的折疊結構,而且纏繞越來越緊密,形成更黏稠的凝膠[18]。P407 是由聚氧乙烯(PEO)、聚氧丙烯(PPO)組成的PEO-PPO-PEO 非離子型三嵌段共聚物,其中PEO 與PPO 的質量比為7∶3。加入P188 后,相對增加了PEO 的比例而降低了PPO的比例,升高了體系的膠凝溫度。但P188 的用量過大時,本身已膠束化的P188 分子亦可參與凝膠構成,又導致體系膠凝溫度降低。因此要調節(jié)P407 的膠凝溫度需選擇P188 合適的用量[19]。本研究還發(fā)現(xiàn)P407 與P188 存在較為顯著的交互作用,其對指標的影響甚至大于P407 與P188 各自的影響。

    雖然本研究對該直腸定向給藥制劑進行了初步研究,但對于其生物有效性、安全性尚待進一步研究,以期為UC 患者提供可靠的藥物制劑。

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