矮地茶對(duì)刀豆蛋白A致大鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討

韓冰，程棟梁，林世源，陳卉，張瑋，奉建芳，吳衛(wèi)*（. 桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣西 桂林 5499；. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 53000）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球肝臟疾病已達(dá)到13 億，影響人類健康發(fā)展并構(gòu)成全球主要的公共衛(wèi)生問題之一[1]。病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷以及遺傳性肝臟疾病是導(dǎo)致急性肝衰竭及死亡的主要病因。肝臟炎癥和肝損傷是免疫細(xì)胞和細(xì)胞趨化、生長、凋亡因子相互作用的結(jié)果，在肝臟疾病的發(fā)展過程中起重要作用[2]。由于肝組織血供豐富、流速慢，免疫細(xì)胞易停留、作用于肝臟，釋放促炎細(xì)胞因子及活性氧簇等分子，這些細(xì)胞因子和免疫應(yīng)答之間的相互作用決定了肝臟病理的發(fā)展[3-4]，如不加以干預(yù)治療，會(huì)逐漸演變成肝癌，導(dǎo)致死亡。目前肝臟疾病治療方式以對(duì)癥治療為主，肝移植逐漸在臨床上應(yīng)用，但肝源稀少、治療費(fèi)用高、技術(shù)設(shè)備要求高等限制了其應(yīng)用[5-6]，目前尚無特效治療藥物及手段。

矮地茶為紫金?？浦参镒辖鹋Ardisia japonica（Thunb）Blume]的干燥全株，又名平地木、不出林等，廣泛分布于長江流域以南各地[7]?！吨袊幍洹?015年版一部記載矮地茶具有化痰止咳、清利濕熱、活血化瘀的功效，用于新久咳嗽、濕熱黃疸、經(jīng)閉瘀阻、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛。矮地茶主要含有皂苷類、香豆素類、苯醌類和黃酮類等成分，具有止咳平喘、保肝抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性[8-12]?！侗静菥V目》記載其有治療肝炎、急性腎炎、膀胱炎等功效。在廣西、湖南等地區(qū)，民間常用矮地茶來治療慢性肝炎，取得了良好的治療效果。但其抗炎保肝作用機(jī)制及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。

外界異物（病毒、藥物、酒精、化學(xué)品）進(jìn)入體內(nèi)，引發(fā)機(jī)體自身免疫應(yīng)答機(jī)制，分化大量炎癥細(xì)胞，浸潤肝臟組織是導(dǎo)致肝損傷的主要原因。刀豆球蛋白 A（Con-A）誘導(dǎo)的肝損傷與病毒性肝炎、自身性免疫性肝病和肝衰竭病理生理過程中的肝臟免疫反應(yīng)極其相似，造模方法已成熟且應(yīng)用較為廣泛[13]。本文以Con-A 誘導(dǎo)的急性肝損傷SD 大鼠為病理模型，探究中藥矮地茶對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為矮地茶進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供資料。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠78 只，4 ～5 周齡，體質(zhì)量190 ～230 g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（湘）2019-0004]，飼養(yǎng)環(huán)境室溫（23±2）℃，濕度50%～60%。所有大鼠均自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)用所有動(dòng)物均經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：GLMC201703029）。

1.2 試藥

矮地茶經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院吳衛(wèi)教授鑒定為紫金?？浦参镒辖鹋５母稍锶?；Con-A 試劑盒（批號(hào)：SLBT3093，美國Sigma 公司）；血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒（批號(hào)：20201015）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒（批號(hào)：20201015）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號(hào)：20201015）、丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：20200724）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：20200723）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（批號(hào)：20200723）、CD4+試劑盒（批號(hào)：E-EL-R2459c）、CD8+試劑盒（批號(hào)：E-EL-R0219c）（南京建成生物工程研究所）。

1.3 儀器

KD-TS3A 全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、KDBM Ⅱ生物組織冷凍包埋機(jī)KD-BL 冷凍臺(tái)（浙江科迪儀器設(shè)備有限公司）；生物組織攤片烤片機(jī)（湖北伯納醫(yī)療科技有限公司）；BX-51 正置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；iMark 酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）；RE52CS-1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；LC-10N-50A 冷凍干燥機(jī)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；GL-88B 渦旋混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）；ES-A電子天平（天津德安特有限公司）；UV-1800 PC紫外分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 干膏制備

將中藥矮地茶全草研磨成粗粉，干燥通風(fēng)保存。精密稱定干燥矮地茶粗粉400 g 4 份，置于2000 mL 圓底燒瓶內(nèi)，做好標(biāo)記。分別分批加入10 倍量體積的60%、70%、80%、90%乙醇，加熱回流提取兩次，首次2.5 h，末次1.5 h。各提取液分別減壓濃縮，回收乙醇，冷凍干燥得矮地茶60%、70%、80%、90%乙醇提取物干膏40.08 g、40.26 g、39.86 g、40.38 g。每克干膏相當(dāng)于生藥量9.98 g、9.94 g、10.03 g、9.91 g。陰涼干燥處保存，待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用（給藥濃度均以浸膏重量計(jì)）。

2.2 造模及給藥

2.2.1 矮地茶不同溶劑提取物的藥效學(xué)考察 將36 只SD 大鼠隨機(jī)分為6 組，空白組、模型組及矮地茶干預(yù)組（60%、70%、80%、90%乙醇提取物），每組6 只。空白組和模型組灌服等體積生理鹽水，矮地茶干預(yù)組分別灌服60%、70%、80%、90%乙醇提取物干膏（20 mg·kg-1），1次·d-1，連續(xù)給藥7 d；末次給藥2 h 后，除空白組外，各組大鼠均一次性尾靜脈注射劑量為20 mg·kg-1的Con-A 進(jìn)行造模。造模結(jié)束后的各組大鼠，均禁食不禁水12 h，稱定大鼠體質(zhì)量后取樣。

2.2.2 矮地茶不同給藥劑量的藥效學(xué)考察 在確定矮地茶提取溶劑（80%乙醇）的基礎(chǔ)上，進(jìn)行給藥劑量的考察。將30 只SD 大鼠隨機(jī)分為5 組，空白組、模型組及矮地茶低、中、高劑量組（10、20、30 mg·kg-13 種給藥劑量），每組6 只。空白組和模型組灌服等體積生理鹽水，矮地茶干預(yù)組分別灌服對(duì)應(yīng)劑量矮地茶，1 次·d-1，連續(xù)給藥7 d；末次給藥2 h 后，除空白組外，各組大鼠均一次性尾靜脈注射20 mg·kg-1Con-A 造模。造模結(jié)束的各組大鼠，均禁食不禁水12 h，稱定大鼠體質(zhì)量后，異氟烷麻醉，開始取樣。

2.3 血清ALT、AST、ALP 水平的測(cè)定

造模12 h 后，將各組SD 大鼠用異氟烷麻醉，酒精消毒，腹主動(dòng)脈取血，使用肝素抗凝，3500 r·min-1離心10 min 后取上清液，-20℃冰箱保存待用。于一周內(nèi)按試劑盒操作檢測(cè)血清ALT、AST、ALP 水平。

2.4 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)的測(cè)定

造模12 h 后，將各組大鼠用異氟烷麻醉，酒精消毒，腹主動(dòng)脈取血后，取肝臟、脾臟稱定質(zhì)量，頸椎脫臼處死大鼠，計(jì)算肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)[肝臟或脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%]。

2.5 肝臟組織中 MDA、SOD、HYP、GSH-Px 水平的測(cè)定

剪取肝右小葉同一部位組織，于冰浴中用生理鹽水制成10%肝組織勻漿并離心，取上清液，置-20℃冰箱保存待用。于一周內(nèi)按試劑盒操作檢測(cè)MDA、SOD、GSH-Px 水平。

2.6 HE 染色觀察肝臟組織病理

取肝左葉同一部位組織，修剪為1 cm3大小組織塊，中性甲醛固定，脫水、包埋、常規(guī)制備切片，HE 染色，光鏡下觀察病理切片并拍照。

2.7 ELISA 檢測(cè)淋巴細(xì)胞中的CD4+、CD8+

剪取肝右小葉同一部位組織，于冰浴中用生理鹽水制成10%肝組織勻漿并離心，取上清液，置于-20℃冰箱保存待用。根據(jù)試劑盒操作要求稀釋成相應(yīng)濃度肝組織勻漿進(jìn)行CD4+、CD8+陽性細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行分析，血清與肝臟組織檢測(cè)指標(biāo)以（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊性資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 矮地茶不同溶劑提取物的藥效學(xué)考察

3.1.1 不同溶劑提取物對(duì)肝損傷大鼠肝脾指數(shù)的影響 模型組較空白組肝臟、脾臟指數(shù)均顯著升高（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組相比，60%、90%乙醇提取物肝臟指數(shù)均無明顯差異。70%、80%乙醇組肝臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。矮地茶各個(gè)濃度乙醇提物組脾臟指數(shù)較模型組均無明顯差異（見表1）。

表1 矮地茶不同溶劑提取物對(duì)大鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響Tab 1 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on liver and spleen index in rats

3.1.2 不同溶劑提取物對(duì)肝損傷大鼠血清AST、ALT 的影響 與空白組相比，模型組大鼠血清AST、ALT 水平顯著升高（P＜0.0001）；與模型組相比，矮地茶70%、90%乙醇提取物對(duì)AST、ALT 水平無降低作用；60%乙醇提取物物能夠顯著降低AST 水平但對(duì)ALT 水平無影響；80%乙醇提取物組AST、ALT 水平均顯著降低（P＜0.01，P＜0.001），見圖1。

圖1 矮地茶不同溶劑提取物對(duì)大鼠血清AST、ALT 的影響Fig 1 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on the serum AST and ALT in rats

3.1.3 不同溶劑提取物對(duì)肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 HE 染色結(jié)果顯示，模型組肝細(xì)胞索斷裂且排列混亂，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜邊緣模糊，有炎性細(xì)胞浸潤。80%乙醇提取物組肝索排列較模型組整齊，且細(xì)胞無明顯腫脹（見圖2）。

圖2 矮地茶不同溶劑提取物對(duì)大鼠肝組織病理變化的影響Fig 2 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on hepatic tissue pathological features in rats

3.2 矮地茶80%乙醇提取物不同給藥劑量的藥效學(xué)考察

3.2.1 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠肝脾指數(shù)的影響 與空白組相比，模型組肝臟、脾臟指數(shù)顯著增大（P＜0.001）。與模型組相比，矮地茶低、中劑量組能降低大鼠肝臟指數(shù)（P＜0.05），高劑量組肝臟指數(shù)雖有降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。矮地茶低、中、高劑量組脾臟指數(shù)與模型組相比均無顯著差異（見表2）。

表2 不同給藥劑量對(duì)大鼠肝脾指數(shù)的影響Tab 2 Effect of different doses on liver and spleen index in rats

3.2.2 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠血清AST、ALT、ALP 的影響 如圖3所示，與空白組相比，模型組血清AST、ALT、ALP 活性顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，矮地茶低、中、高劑量組均能降低AST、ALT 活性（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；矮地茶低、中劑量組均能降低ALP 活性（P＜0.01）。

圖3 矮地茶不同給藥劑量對(duì)大鼠血清AST、ALT、ALP 的影響Fig 3 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on the serum AST，ALT and ALP in rats

3.2.3 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠MDA、SOD、GSH-Px 的影響 如圖4所示，與空白組相比，模型組肝組織GSH-Px、SOD 水平顯著降低（P＜0.001），MDA 水平顯著升高（P＜0.0001）；與模型組相比，矮地茶低、中劑量組均能顯著降低MDA 水平（P＜0.05），高劑量組無改善；矮地茶低、中、高劑量組能顯著升高SOD（P＜0.001）及GSH-Px 活力水平（P＜0.01，P＜0.001），中劑量組最為明顯。

圖4 矮地茶不同給藥劑量對(duì)MDA、SOD、GSH-Px 的影響Fig 4 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on MDA，SOD and GSH-Px

3.2.4 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠肝組織CD4+、CD8+數(shù)量的影響 如圖5所示，與空白組相比，模型組T 淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量均顯著上升（P＜0.05，P＜0.001）。與模型組相比，矮地茶各干預(yù)組CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 矮地茶不同給藥劑量對(duì)CD4+、CD8+的影響Fig 5 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on CD4+and CD8+

3.2.5 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 如圖6所示，模型組肝索排列紊亂，有肝索斷裂跡象。細(xì)胞膜邊緣模糊，且細(xì)胞腫脹明顯，伴有大量炎性浸潤。矮地茶各干預(yù)組肝索排列較為整齊，炎性浸潤肉眼可見有所減輕，中劑量組的保護(hù)作用較其他組顯著。

圖6 矮地茶不同給藥劑量對(duì)大鼠肝組織病理變化的影響Fig 6 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on hepatic tissue pathological features in rats

4 討論

中藥矮地茶為南方地區(qū)民間草藥，常用于治療肝炎，但缺乏相應(yīng)的理論研究。本文通過Con-A 誘導(dǎo)免疫性肝損傷大鼠動(dòng)物模型，探討矮地茶抗炎保肝的藥效及作用機(jī)制，為民間用藥的合理性提供理論依據(jù)。

本文主要以血清AST、ALT、ALP 水平和HE 病理切片以及肝組織MDA、SOD、GSH-Px、T 淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)來初步探究矮地茶抗Con-A誘導(dǎo)肝損傷藥效及保護(hù)作用機(jī)制。血清AST、ALT、ALP 可以反映肝細(xì)胞受損程度以及線粒體損傷的情況[14]，AST 與ALT 存在于肝細(xì)胞質(zhì)與線粒體，并作用于肝臟，當(dāng)肝細(xì)胞受損，這兩種酶便釋放到血液中。本研究發(fā)現(xiàn)，矮地茶降低血清中AST、ALT、ALP 水平效果明顯，證明對(duì)Con-A 誘導(dǎo)的肝損傷有一定的保護(hù)作用。

此前，已有研究證明肝損傷過程中氧化應(yīng)激指標(biāo)異常，MDA 為機(jī)體脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物，可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，間接反映肝細(xì)胞損傷程度。SOD 是源于機(jī)體的活性物質(zhì)，能消除機(jī)體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的具有氧化性質(zhì)的一類物質(zhì)即活性氧（ROS），降低由ROS 引起的機(jī)體過氧化產(chǎn)生的肝損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)Con-A 誘導(dǎo)建模后，模型組肝組織中MDA 水平顯著升高，SOD 活力水平顯著降低，提示Con-A可能誘導(dǎo)肝組織細(xì)胞一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制SOD 的活力，從而降低機(jī)體清除ROS 的能力，加重肝細(xì)胞損傷。GSH 是細(xì)胞抗氧化主要成分，在肝臟內(nèi)合成最多，GSH-Px 酶以GSH 為底物，限制脂質(zhì)過氧化，從而預(yù)防細(xì)胞膜受損，減少機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基對(duì)DNA 的損害，從而對(duì)肝臟起到保護(hù)作用。結(jié)果表明，Con-A 誘導(dǎo)SD 大鼠造模后，GSH-Px 活力顯著降低，矮地茶干預(yù)后，能夠有效降低MDA 水平，升高SOD 活力水平，上調(diào)GSH-Px 活力水平，推測(cè)矮地茶可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)來應(yīng)對(duì)Con-A 誘導(dǎo)的肝損傷作用。

研究表明，Con-A 誘導(dǎo)肝損傷動(dòng)物模型主要是通過活化T 淋巴細(xì)胞致免疫性肝損傷，Con-A刺激T 淋巴細(xì)胞，激活肝臟組織免疫反應(yīng)，CD4+、CD8+兩種T 淋巴細(xì)胞集聚肝門區(qū)，釋放炎癥因子攻擊肝組織，致使肝細(xì)胞壞死、凋亡，肝組織受損[3，13]。CD4+為輔助T 細(xì)胞（Th 細(xì)胞）的總稱，Th 細(xì)胞受刺激后會(huì)分化成Th0、Th1、Th2 等，這些被活化得的淋巴細(xì)胞會(huì)分泌IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子，炎癥因子浸潤肝細(xì)胞導(dǎo)致?lián)p傷產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+兩種T 淋巴細(xì)胞在模型組較空白組表達(dá)顯著升高，矮地茶干預(yù)組能夠降低CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞表達(dá)，抑制T 淋巴細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群，改善免疫功能紊亂，降低炎癥因子對(duì)于肝臟組織的浸潤，起到保護(hù)肝臟組織的作用。

綜上，矮地茶80%乙醇提取物中20 mg·kg-1劑量組在降低AST、ALT、ALP、MDA、CD4+、CD8+水平，在升高GSH-Px、SOD 水平最為顯著。本文通過Con-A 誘導(dǎo)免疫性肝損傷大鼠動(dòng)物模型，探討矮地茶抗炎保肝的藥效及作用機(jī)制，為民間用藥的合理性提供理論依據(jù)。