• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    矮地茶對(duì)刀豆蛋白A致大鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討

    2022-08-08 02:59:06韓冰程棟梁林世源陳卉張瑋奉建芳吳衛(wèi)桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院廣西桂林5499廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院南寧53000
    中南藥學(xué) 2022年5期
    關(guān)鍵詞:造模提取物乙醇

    韓冰,程棟梁,林世源,陳卉,張瑋,奉建芳,吳衛(wèi)*(. 桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,廣西 桂林 5499;. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南寧 53000)

    據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球肝臟疾病已達(dá)到13 億,影響人類健康發(fā)展并構(gòu)成全球主要的公共衛(wèi)生問題之一[1]。病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷以及遺傳性肝臟疾病是導(dǎo)致急性肝衰竭及死亡的主要病因。肝臟炎癥和肝損傷是免疫細(xì)胞和細(xì)胞趨化、生長、凋亡因子相互作用的結(jié)果,在肝臟疾病的發(fā)展過程中起重要作用[2]。由于肝組織血供豐富、流速慢,免疫細(xì)胞易停留、作用于肝臟,釋放促炎細(xì)胞因子及活性氧簇等分子,這些細(xì)胞因子和免疫應(yīng)答之間的相互作用決定了肝臟病理的發(fā)展[3-4],如不加以干預(yù)治療,會(huì)逐漸演變成肝癌,導(dǎo)致死亡。目前肝臟疾病治療方式以對(duì)癥治療為主,肝移植逐漸在臨床上應(yīng)用,但肝源稀少、治療費(fèi)用高、技術(shù)設(shè)備要求高等限制了其應(yīng)用[5-6],目前尚無特效治療藥物及手段。

    矮地茶為紫金??浦参镒辖鹋Ardisia japonica(Thunb)Blume]的干燥全株,又名平地木、不出林等,廣泛分布于長江流域以南各地[7]?!吨袊幍洹?015年版一部記載矮地茶具有化痰止咳、清利濕熱、活血化瘀的功效,用于新久咳嗽、濕熱黃疸、經(jīng)閉瘀阻、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛。矮地茶主要含有皂苷類、香豆素類、苯醌類和黃酮類等成分,具有止咳平喘、保肝抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性[8-12]?!侗静菥V目》記載其有治療肝炎、急性腎炎、膀胱炎等功效。在廣西、湖南等地區(qū),民間常用矮地茶來治療慢性肝炎,取得了良好的治療效果。但其抗炎保肝作用機(jī)制及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。

    外界異物(病毒、藥物、酒精、化學(xué)品)進(jìn)入體內(nèi),引發(fā)機(jī)體自身免疫應(yīng)答機(jī)制,分化大量炎癥細(xì)胞,浸潤肝臟組織是導(dǎo)致肝損傷的主要原因。刀豆球蛋白 A(Con-A)誘導(dǎo)的肝損傷與病毒性肝炎、自身性免疫性肝病和肝衰竭病理生理過程中的肝臟免疫反應(yīng)極其相似,造模方法已成熟且應(yīng)用較為廣泛[13]。本文以Con-A 誘導(dǎo)的急性肝損傷SD 大鼠為病理模型,探究中藥矮地茶對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制,為矮地茶進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供資料。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物

    SPF 級(jí)雄性SD 大鼠78 只,4 ~5 周齡,體質(zhì)量190 ~230 g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)環(huán)境室溫(23±2)℃,濕度50%~60%。所有大鼠均自由進(jìn)食飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)用所有動(dòng)物均經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):GLMC201703029)。

    1.2 試藥

    矮地茶經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院吳衛(wèi)教授鑒定為紫金??浦参镒辖鹋5母稍锶?;Con-A 試劑盒(批號(hào):SLBT3093,美國Sigma 公司);血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒(批號(hào):20201015)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(批號(hào):20201015)、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(批號(hào):20201015)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào):20200724)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號(hào):20200723)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號(hào):20200723)、CD4+試劑盒(批號(hào):E-EL-R2459c)、CD8+試劑盒(批號(hào):E-EL-R0219c)(南京建成生物工程研究所)。

    1.3 儀器

    KD-TS3A 全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、KDBM Ⅱ生物組織冷凍包埋機(jī)KD-BL 冷凍臺(tái)(浙江科迪儀器設(shè)備有限公司);生物組織攤片烤片機(jī)(湖北伯納醫(yī)療科技有限公司);BX-51 正置熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);iMark 酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad 公司);RE52CS-1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);LC-10N-50A 冷凍干燥機(jī)(上海力辰邦西儀器科技有限公司);GL-88B 渦旋混合器(其林貝爾儀器制造有限公司);ES-A電子天平(天津德安特有限公司);UV-1800 PC紫外分光光度計(jì)(上海美普達(dá)儀器有限公司)。

    2 方法

    2.1 干膏制備

    將中藥矮地茶全草研磨成粗粉,干燥通風(fēng)保存。精密稱定干燥矮地茶粗粉400 g 4 份,置于2000 mL 圓底燒瓶內(nèi),做好標(biāo)記。分別分批加入10 倍量體積的60%、70%、80%、90%乙醇,加熱回流提取兩次,首次2.5 h,末次1.5 h。各提取液分別減壓濃縮,回收乙醇,冷凍干燥得矮地茶60%、70%、80%、90%乙醇提取物干膏40.08 g、40.26 g、39.86 g、40.38 g。每克干膏相當(dāng)于生藥量9.98 g、9.94 g、10.03 g、9.91 g。陰涼干燥處保存,待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用(給藥濃度均以浸膏重量計(jì))。

    2.2 造模及給藥

    2.2.1 矮地茶不同溶劑提取物的藥效學(xué)考察 將36 只SD 大鼠隨機(jī)分為6 組,空白組、模型組及矮地茶干預(yù)組(60%、70%、80%、90%乙醇提取物),每組6 只。空白組和模型組灌服等體積生理鹽水,矮地茶干預(yù)組分別灌服60%、70%、80%、90%乙醇提取物干膏(20 mg·kg-1),1次·d-1,連續(xù)給藥7 d;末次給藥2 h 后,除空白組外,各組大鼠均一次性尾靜脈注射劑量為20 mg·kg-1的Con-A 進(jìn)行造模。造模結(jié)束后的各組大鼠,均禁食不禁水12 h,稱定大鼠體質(zhì)量后取樣。

    2.2.2 矮地茶不同給藥劑量的藥效學(xué)考察 在確定矮地茶提取溶劑(80%乙醇)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行給藥劑量的考察。將30 只SD 大鼠隨機(jī)分為5 組,空白組、模型組及矮地茶低、中、高劑量組(10、20、30 mg·kg-13 種給藥劑量),每組6 只。空白組和模型組灌服等體積生理鹽水,矮地茶干預(yù)組分別灌服對(duì)應(yīng)劑量矮地茶,1 次·d-1,連續(xù)給藥7 d;末次給藥2 h 后,除空白組外,各組大鼠均一次性尾靜脈注射20 mg·kg-1Con-A 造模。造模結(jié)束的各組大鼠,均禁食不禁水12 h,稱定大鼠體質(zhì)量后,異氟烷麻醉,開始取樣。

    2.3 血清ALT、AST、ALP 水平的測(cè)定

    造模12 h 后,將各組SD 大鼠用異氟烷麻醉,酒精消毒,腹主動(dòng)脈取血,使用肝素抗凝,3500 r·min-1離心10 min 后取上清液,-20℃冰箱保存待用。于一周內(nèi)按試劑盒操作檢測(cè)血清ALT、AST、ALP 水平。

    2.4 肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)的測(cè)定

    造模12 h 后,將各組大鼠用異氟烷麻醉,酒精消毒,腹主動(dòng)脈取血后,取肝臟、脾臟稱定質(zhì)量,頸椎脫臼處死大鼠,計(jì)算肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)[肝臟或脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%]。

    2.5 肝臟組織中 MDA、SOD、HYP、GSH-Px 水平的測(cè)定

    剪取肝右小葉同一部位組織,于冰浴中用生理鹽水制成10%肝組織勻漿并離心,取上清液,置-20℃冰箱保存待用。于一周內(nèi)按試劑盒操作檢測(cè)MDA、SOD、GSH-Px 水平。

    2.6 HE 染色觀察肝臟組織病理

    取肝左葉同一部位組織,修剪為1 cm3大小組織塊,中性甲醛固定,脫水、包埋、常規(guī)制備切片,HE 染色,光鏡下觀察病理切片并拍照。

    2.7 ELISA 檢測(cè)淋巴細(xì)胞中的CD4+、CD8+

    剪取肝右小葉同一部位組織,于冰浴中用生理鹽水制成10%肝組織勻漿并離心,取上清液,置于-20℃冰箱保存待用。根據(jù)試劑盒操作要求稀釋成相應(yīng)濃度肝組織勻漿進(jìn)行CD4+、CD8+陽性細(xì)胞數(shù)量的測(cè)定。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    應(yīng)用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行分析,血清與肝臟組織檢測(cè)指標(biāo)以(±s)表示,符合正態(tài)分布且方差齊性資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);以P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 矮地茶不同溶劑提取物的藥效學(xué)考察

    3.1.1 不同溶劑提取物對(duì)肝損傷大鼠肝脾指數(shù)的影響 模型組較空白組肝臟、脾臟指數(shù)均顯著升高(P<0.01,P<0.001);與模型組相比,60%、90%乙醇提取物肝臟指數(shù)均無明顯差異。70%、80%乙醇組肝臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)。矮地茶各個(gè)濃度乙醇提物組脾臟指數(shù)較模型組均無明顯差異(見表1)。

    表1 矮地茶不同溶劑提取物對(duì)大鼠肝臟、脾臟指數(shù)的影響Tab 1 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on liver and spleen index in rats

    3.1.2 不同溶劑提取物對(duì)肝損傷大鼠血清AST、ALT 的影響 與空白組相比,模型組大鼠血清AST、ALT 水平顯著升高(P<0.0001);與模型組相比,矮地茶70%、90%乙醇提取物對(duì)AST、ALT 水平無降低作用;60%乙醇提取物物能夠顯著降低AST 水平但對(duì)ALT 水平無影響;80%乙醇提取物組AST、ALT 水平均顯著降低(P<0.01,P<0.001),見圖1。

    圖1 矮地茶不同溶劑提取物對(duì)大鼠血清AST、ALT 的影響Fig 1 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on the serum AST and ALT in rats

    3.1.3 不同溶劑提取物對(duì)肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 HE 染色結(jié)果顯示,模型組肝細(xì)胞索斷裂且排列混亂,細(xì)胞腫脹,細(xì)胞膜邊緣模糊,有炎性細(xì)胞浸潤。80%乙醇提取物組肝索排列較模型組整齊,且細(xì)胞無明顯腫脹(見圖2)。

    圖2 矮地茶不同溶劑提取物對(duì)大鼠肝組織病理變化的影響Fig 2 Effect of different extraction of Ardisiae japonicae herba on hepatic tissue pathological features in rats

    3.2 矮地茶80%乙醇提取物不同給藥劑量的藥效學(xué)考察

    3.2.1 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠肝脾指數(shù)的影響 與空白組相比,模型組肝臟、脾臟指數(shù)顯著增大(P<0.001)。與模型組相比,矮地茶低、中劑量組能降低大鼠肝臟指數(shù)(P<0.05),高劑量組肝臟指數(shù)雖有降低但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。矮地茶低、中、高劑量組脾臟指數(shù)與模型組相比均無顯著差異(見表2)。

    表2 不同給藥劑量對(duì)大鼠肝脾指數(shù)的影響Tab 2 Effect of different doses on liver and spleen index in rats

    3.2.2 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠血清AST、ALT、ALP 的影響 如圖3所示,與空白組相比,模型組血清AST、ALT、ALP 活性顯著升高(P<0.001);與模型組相比,矮地茶低、中、高劑量組均能降低AST、ALT 活性(P<0.05,P<0.01,P<0.001);矮地茶低、中劑量組均能降低ALP 活性(P<0.01)。

    圖3 矮地茶不同給藥劑量對(duì)大鼠血清AST、ALT、ALP 的影響Fig 3 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on the serum AST,ALT and ALP in rats

    3.2.3 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠MDA、SOD、GSH-Px 的影響 如圖4所示,與空白組相比,模型組肝組織GSH-Px、SOD 水平顯著降低(P<0.001),MDA 水平顯著升高(P<0.0001);與模型組相比,矮地茶低、中劑量組均能顯著降低MDA 水平(P<0.05),高劑量組無改善;矮地茶低、中、高劑量組能顯著升高SOD(P<0.001)及GSH-Px 活力水平(P<0.01,P<0.001),中劑量組最為明顯。

    圖4 矮地茶不同給藥劑量對(duì)MDA、SOD、GSH-Px 的影響Fig 4 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on MDA,SOD and GSH-Px

    3.2.4 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠肝組織CD4+、CD8+數(shù)量的影響 如圖5所示,與空白組相比,模型組T 淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量均顯著上升(P<0.05,P<0.001)。與模型組相比,矮地茶各干預(yù)組CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P<0.05,P<0.01)。

    圖5 矮地茶不同給藥劑量對(duì)CD4+、CD8+的影響Fig 5 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on CD4+and CD8+

    3.2.5 不同給藥劑量對(duì)肝損傷大鼠肝組織病理變化的影響 如圖6所示,模型組肝索排列紊亂,有肝索斷裂跡象。細(xì)胞膜邊緣模糊,且細(xì)胞腫脹明顯,伴有大量炎性浸潤。矮地茶各干預(yù)組肝索排列較為整齊,炎性浸潤肉眼可見有所減輕,中劑量組的保護(hù)作用較其他組顯著。

    圖6 矮地茶不同給藥劑量對(duì)大鼠肝組織病理變化的影響Fig 6 Effect of different doses of Ardisiae japonicae herba on hepatic tissue pathological features in rats

    4 討論

    中藥矮地茶為南方地區(qū)民間草藥,常用于治療肝炎,但缺乏相應(yīng)的理論研究。本文通過Con-A 誘導(dǎo)免疫性肝損傷大鼠動(dòng)物模型,探討矮地茶抗炎保肝的藥效及作用機(jī)制,為民間用藥的合理性提供理論依據(jù)。

    本文主要以血清AST、ALT、ALP 水平和HE 病理切片以及肝組織MDA、SOD、GSH-Px、T 淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)來初步探究矮地茶抗Con-A誘導(dǎo)肝損傷藥效及保護(hù)作用機(jī)制。血清AST、ALT、ALP 可以反映肝細(xì)胞受損程度以及線粒體損傷的情況[14],AST 與ALT 存在于肝細(xì)胞質(zhì)與線粒體,并作用于肝臟,當(dāng)肝細(xì)胞受損,這兩種酶便釋放到血液中。本研究發(fā)現(xiàn),矮地茶降低血清中AST、ALT、ALP 水平效果明顯,證明對(duì)Con-A 誘導(dǎo)的肝損傷有一定的保護(hù)作用。

    此前,已有研究證明肝損傷過程中氧化應(yīng)激指標(biāo)異常,MDA 為機(jī)體脂質(zhì)過氧化物的最終產(chǎn)物,可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),間接反映肝細(xì)胞損傷程度。SOD 是源于機(jī)體的活性物質(zhì),能消除機(jī)體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的具有氧化性質(zhì)的一類物質(zhì)即活性氧(ROS),降低由ROS 引起的機(jī)體過氧化產(chǎn)生的肝損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠經(jīng)Con-A 誘導(dǎo)建模后,模型組肝組織中MDA 水平顯著升高,SOD 活力水平顯著降低,提示Con-A可能誘導(dǎo)肝組織細(xì)胞一系列氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制SOD 的活力,從而降低機(jī)體清除ROS 的能力,加重肝細(xì)胞損傷。GSH 是細(xì)胞抗氧化主要成分,在肝臟內(nèi)合成最多,GSH-Px 酶以GSH 為底物,限制脂質(zhì)過氧化,從而預(yù)防細(xì)胞膜受損,減少機(jī)體氧化反應(yīng)產(chǎn)生的自由基對(duì)DNA 的損害,從而對(duì)肝臟起到保護(hù)作用。結(jié)果表明,Con-A 誘導(dǎo)SD 大鼠造模后,GSH-Px 活力顯著降低,矮地茶干預(yù)后,能夠有效降低MDA 水平,升高SOD 活力水平,上調(diào)GSH-Px 活力水平,推測(cè)矮地茶可能通過調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)來應(yīng)對(duì)Con-A 誘導(dǎo)的肝損傷作用。

    研究表明,Con-A 誘導(dǎo)肝損傷動(dòng)物模型主要是通過活化T 淋巴細(xì)胞致免疫性肝損傷,Con-A刺激T 淋巴細(xì)胞,激活肝臟組織免疫反應(yīng),CD4+、CD8+兩種T 淋巴細(xì)胞集聚肝門區(qū),釋放炎癥因子攻擊肝組織,致使肝細(xì)胞壞死、凋亡,肝組織受損[3,13]。CD4+為輔助T 細(xì)胞(Th 細(xì)胞)的總稱,Th 細(xì)胞受刺激后會(huì)分化成Th0、Th1、Th2 等,這些被活化得的淋巴細(xì)胞會(huì)分泌IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ等炎癥因子,炎癥因子浸潤肝細(xì)胞導(dǎo)致?lián)p傷產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+兩種T 淋巴細(xì)胞在模型組較空白組表達(dá)顯著升高,矮地茶干預(yù)組能夠降低CD4+、CD8+T 淋巴細(xì)胞表達(dá),抑制T 淋巴細(xì)胞分化,調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞亞群,改善免疫功能紊亂,降低炎癥因子對(duì)于肝臟組織的浸潤,起到保護(hù)肝臟組織的作用。

    綜上,矮地茶80%乙醇提取物中20 mg·kg-1劑量組在降低AST、ALT、ALP、MDA、CD4+、CD8+水平,在升高GSH-Px、SOD 水平最為顯著。本文通過Con-A 誘導(dǎo)免疫性肝損傷大鼠動(dòng)物模型,探討矮地茶抗炎保肝的藥效及作用機(jī)制,為民間用藥的合理性提供理論依據(jù)。

    猜你喜歡
    造模提取物乙醇
    蟲草素提取物在抗癌治療中顯示出巨大希望
    中老年保健(2022年2期)2022-08-24 03:20:44
    乙醇和乙酸常見考點(diǎn)例忻
    中藥提取物或可用于治療肥胖
    中老年保健(2021年5期)2021-12-02 15:48:21
    腎陽虛證動(dòng)物模型建立方法及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展
    脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型造模方法及模型評(píng)價(jià)
    濕熱證動(dòng)物模型造模方法及評(píng)價(jià)研究
    神奇的落葉松提取物
    紫地榆提取物的止血作用
    中成藥(2017年10期)2017-11-16 00:50:27
    楊木發(fā)酵乙醇剩余物制備緩釋肥料
    白地霉不對(duì)稱還原1-萘乙酮制備(S) -1-萘基-1-乙醇
    久久国产精品男人的天堂亚洲| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久人人爽人人片av| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 精品一品国产午夜福利视频| 久久青草综合色| 国产熟女午夜一区二区三区| 中文字幕人妻丝袜制服| 高清视频免费观看一区二区| 国产在线观看jvid| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费看十八禁软件| 黄色视频不卡| 人妻一区二区av| 乱人伦中国视频| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产av国产精品国产| 亚洲成国产人片在线观看| 日本午夜av视频| 人成视频在线观看免费观看| 国产在线观看jvid| 一区二区三区激情视频| 脱女人内裤的视频| 亚洲综合色网址| 观看av在线不卡| 亚洲av欧美aⅴ国产| 久久久国产精品麻豆| 成人国产一区最新在线观看 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一区二区三区四区激情视频| 制服人妻中文乱码| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 人成视频在线观看免费观看| 永久免费av网站大全| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品一品国产午夜福利视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲av美国av| av欧美777| 天天影视国产精品| 国产爽快片一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 99热全是精品| 97人妻天天添夜夜摸| 9191精品国产免费久久| 黄色毛片三级朝国网站| 久久久久久久久免费视频了| √禁漫天堂资源中文www| 狂野欧美激情性xxxx| 国产极品粉嫩免费观看在线| 青草久久国产| 亚洲五月婷婷丁香| 国产黄频视频在线观看| 亚洲黑人精品在线| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲精品美女久久av网站| 热99久久久久精品小说推荐| avwww免费| 黄色 视频免费看| 婷婷色av中文字幕| 欧美日韩亚洲高清精品| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 在现免费观看毛片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 最近手机中文字幕大全| 一本大道久久a久久精品| 9191精品国产免费久久| 一本大道久久a久久精品| 9色porny在线观看| 久久久精品94久久精品| 多毛熟女@视频| 男女国产视频网站| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产成人免费观看mmmm| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 免费在线观看黄色视频的| 黄色怎么调成土黄色| 久久精品亚洲av国产电影网| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 午夜福利影视在线免费观看| 一级毛片我不卡| 精品少妇内射三级| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 人人澡人人妻人| 中国国产av一级| 一级毛片电影观看| 夫妻午夜视频| 大片电影免费在线观看免费| 精品欧美一区二区三区在线| 在线av久久热| 婷婷丁香在线五月| 中文字幕色久视频| 大片电影免费在线观看免费| 国产成人啪精品午夜网站| 成人国语在线视频| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 成人国产av品久久久| 中文字幕av电影在线播放| 在线观看国产h片| 校园人妻丝袜中文字幕| 高清不卡的av网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 黄色a级毛片大全视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一级片'在线观看视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 一级片免费观看大全| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 色婷婷av一区二区三区视频| 伦理电影免费视频| 黄色怎么调成土黄色| av国产精品久久久久影院| 国产1区2区3区精品| 中文字幕高清在线视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 欧美性长视频在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 超碰97精品在线观看| 久久久久久久国产电影| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜福利一区二区在线看| 久久av网站| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 男人爽女人下面视频在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久人人爽人人片av| 午夜视频精品福利| tube8黄色片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲av美国av| 国产男女超爽视频在线观看| 免费观看av网站的网址| 国产精品国产三级专区第一集| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲免费av在线视频| 国产精品 欧美亚洲| 脱女人内裤的视频| 美女福利国产在线| 亚洲av片天天在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产欧美日韩一区二区三区在线| videos熟女内射| 一个人免费看片子| 国产91精品成人一区二区三区 | 一边亲一边摸免费视频| 69精品国产乱码久久久| 一区二区av电影网| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美日韩福利视频一区二区| 一级毛片电影观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 日韩人妻精品一区2区三区| 91国产中文字幕| 欧美日韩福利视频一区二区| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 精品欧美一区二区三区在线| 中文字幕最新亚洲高清| 99九九在线精品视频| 免费日韩欧美在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 尾随美女入室| 免费看十八禁软件| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美中文综合在线视频| 国产成人av激情在线播放| 国产1区2区3区精品| 狂野欧美激情性bbbbbb| 老司机靠b影院| 精品一区二区三卡| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 大陆偷拍与自拍| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲国产av影院在线观看| 国产视频首页在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 丝袜脚勾引网站| 国产爽快片一区二区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲七黄色美女视频| 日韩伦理黄色片| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 国产精品一区二区在线不卡| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 超碰成人久久| 久久久久久人人人人人| 欧美精品高潮呻吟av久久| 捣出白浆h1v1| 电影成人av| 精品久久久久久电影网| 亚洲精品国产色婷婷电影| 好男人视频免费观看在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产在线一区二区三区精| 搡老岳熟女国产| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产高清国产精品国产三级| 91精品伊人久久大香线蕉| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费黄频网站在线观看国产| 丰满饥渴人妻一区二区三| 在线 av 中文字幕| 自线自在国产av| 在线天堂中文资源库| 人体艺术视频欧美日本| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人91sexporn| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产在视频线精品| 一级黄色大片毛片| 日本五十路高清| 岛国毛片在线播放| 久久久久久久久久久久大奶| 久久99精品国语久久久| 99热网站在线观看| 免费在线观看日本一区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产一区有黄有色的免费视频| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产片内射在线| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产成人免费观看mmmm| 色视频在线一区二区三区| 欧美日韩av久久| 欧美日韩亚洲高清精品| h视频一区二区三区| 天天添夜夜摸| 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级毛片 在线播放| 一区二区三区四区激情视频| 性色av一级| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品一区二区免费欧美 | av国产久精品久网站免费入址| 麻豆乱淫一区二区| 精品人妻在线不人妻| cao死你这个sao货| 亚洲免费av在线视频| netflix在线观看网站| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲av片天天在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 熟女av电影| 久久精品成人免费网站| 激情五月婷婷亚洲| 9热在线视频观看99| 91成人精品电影| 黄色视频不卡| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 老司机影院成人| 无遮挡黄片免费观看| 看十八女毛片水多多多| 麻豆国产av国片精品| www.精华液| a 毛片基地| 国产免费又黄又爽又色| 久久女婷五月综合色啪小说| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲成人手机| 亚洲精品国产区一区二| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲成色77777| 亚洲五月婷婷丁香| 夫妻午夜视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久国产欧美日韩av| 大陆偷拍与自拍| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人av激情在线播放| 麻豆乱淫一区二区| 宅男免费午夜| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 99国产精品一区二区三区| 丁香六月天网| 色网站视频免费| 大香蕉久久成人网| 夫妻午夜视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 青春草视频在线免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产一区亚洲一区在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 大型av网站在线播放| 国产男人的电影天堂91| 无限看片的www在线观看| 丁香六月天网| 永久免费av网站大全| 高清av免费在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品国产一区二区三区四区第35| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美中文综合在线视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产成人精品久久久久久| 久久久久视频综合| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 大话2 男鬼变身卡| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 婷婷色综合www| 国产亚洲精品第一综合不卡| 男女之事视频高清在线观看 | 色播在线永久视频| 91成人精品电影| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 少妇人妻久久综合中文| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 乱人伦中国视频| 国产有黄有色有爽视频| 国产日韩欧美视频二区| 久久久精品免费免费高清| 国产成人精品久久久久久| av网站在线播放免费| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品国产亚洲av涩爱| bbb黄色大片| 久久精品久久精品一区二区三区| 999精品在线视频| 亚洲中文av在线| 在线av久久热| 免费日韩欧美在线观看| 久热这里只有精品99| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 女人精品久久久久毛片| 九色亚洲精品在线播放| 免费看不卡的av| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 欧美 日韩 精品 国产| 国产成人精品在线电影| 最新在线观看一区二区三区 | 三上悠亚av全集在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成年动漫av网址| 最新的欧美精品一区二区| 中文字幕av电影在线播放| 欧美+亚洲+日韩+国产| 大陆偷拍与自拍| 欧美中文综合在线视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久国产精品人妻蜜桃| 晚上一个人看的免费电影| 国产免费现黄频在线看| 精品久久蜜臀av无| 女性被躁到高潮视频| 精品一品国产午夜福利视频| 日韩大码丰满熟妇| 国产99久久九九免费精品| 亚洲 国产 在线| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产精品三级大全| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 人妻一区二区av| 一区在线观看完整版| av电影中文网址| av视频免费观看在线观看| 后天国语完整版免费观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 99国产精品一区二区三区| 国产av一区二区精品久久| 欧美精品一区二区免费开放| 久久 成人 亚洲| 国产亚洲精品第一综合不卡| 在线看a的网站| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 一本色道久久久久久精品综合| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 丝袜美腿诱惑在线| 男女国产视频网站| 亚洲图色成人| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产成人啪精品午夜网站| 国产高清视频在线播放一区 | 日韩免费高清中文字幕av| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲精品日本国产第一区| 男人添女人高潮全过程视频| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品久久久久久电影网| 一级毛片电影观看| 老司机亚洲免费影院| 97在线人人人人妻| 国产一卡二卡三卡精品| 老司机影院毛片| 七月丁香在线播放| 91九色精品人成在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 国产在线一区二区三区精| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩av免费高清视频| 亚洲av综合色区一区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 在线观看国产h片| 亚洲 国产 在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 男男h啪啪无遮挡| 青春草视频在线免费观看| 观看av在线不卡| 日本欧美国产在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 又黄又粗又硬又大视频| 蜜桃在线观看..| 国产成人91sexporn| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 我的亚洲天堂| 亚洲国产欧美在线一区| www.精华液| 人妻一区二区av| 成年人免费黄色播放视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产成人一区二区在线| bbb黄色大片| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| av欧美777| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 热re99久久国产66热| 97在线人人人人妻| 日韩人妻精品一区2区三区| 免费在线观看日本一区| 在线观看人妻少妇| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日日摸夜夜添夜夜爱| 波多野结衣av一区二区av| 交换朋友夫妻互换小说| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 午夜免费成人在线视频| 亚洲精品自拍成人| 在线观看免费高清a一片| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久亚洲精品不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产高清不卡午夜福利| 黑人欧美特级aaaaaa片| 十八禁高潮呻吟视频| 成人手机av| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲成色77777| 国产视频首页在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 日日摸夜夜添夜夜爱| 在线观看免费视频网站a站| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲国产精品一区三区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美在线一区亚洲| 久久精品国产综合久久久| 深夜精品福利| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久人人97超碰香蕉20202| 成人黄色视频免费在线看| 九色亚洲精品在线播放| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久久久网色| avwww免费| 欧美日韩福利视频一区二区| av国产久精品久网站免费入址| 久久狼人影院| 后天国语完整版免费观看| 丰满少妇做爰视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 在线看a的网站| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲精品在线美女| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日日夜夜操网爽| 久久亚洲国产成人精品v| 精品久久蜜臀av无| 老司机靠b影院| 51午夜福利影视在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲,欧美,日韩| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 飞空精品影院首页| 只有这里有精品99| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品一区二区在线观看99| 男女国产视频网站| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 成人手机av| 水蜜桃什么品种好| 国产有黄有色有爽视频| 看免费av毛片| 两个人免费观看高清视频| 少妇人妻久久综合中文| 妹子高潮喷水视频| cao死你这个sao货| 色播在线永久视频| 欧美人与善性xxx| 激情五月婷婷亚洲| 免费少妇av软件| 亚洲国产av影院在线观看| 在线观看www视频免费| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产不卡av网站在线观看| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产成人精品久久二区二区91| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99re6热这里在线精品视频| 91麻豆av在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 视频区图区小说| 欧美日韩黄片免| 成人手机av| 亚洲三区欧美一区| 美女大奶头黄色视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 捣出白浆h1v1| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 新久久久久国产一级毛片| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 欧美日韩福利视频一区二区| 免费看av在线观看网站| 国产色视频综合| 国产亚洲av高清不卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 最近中文字幕2019免费版| 丝袜美足系列| 看十八女毛片水多多多| 久久99热这里只频精品6学生| 精品少妇黑人巨大在线播放| 天堂8中文在线网| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产成人免费观看mmmm| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲三区欧美一区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 一级黄片播放器| 两性夫妻黄色片| 老司机亚洲免费影院| 欧美xxⅹ黑人| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 婷婷色综合www| 免费观看人在逋| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久9热在线精品视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲精品第二区| 这个男人来自地球电影免费观看| a级毛片黄视频| 亚洲av日韩在线播放| 欧美日韩av久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 妹子高潮喷水视频| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久久久久久大尺度免费视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产精品成人在线| 欧美成人午夜精品| 最新的欧美精品一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产黄频视频在线观看| 国产高清视频在线播放一区 | 制服诱惑二区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 少妇人妻久久综合中文| av欧美777|