重樓皂苷H誘導耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R細胞凋亡和焦亡的作用研究

孫光強，薛玉葉，陸云陽，杜洋，王媛媛，方菲，紀玉強，程光，湯海峰，*，邱鵬程*

（1. 陜西中醫(yī)藥大學藥學院，陜西 咸陽 712046；2. 空軍特色醫(yī)學中心藥劑科，北京 100142；3. 空軍軍醫(yī)大學藥學系中藥與天然藥物學教研室，西安 710032；4. 西安市第一醫(yī)院中心實驗室，西安 710002；5. 空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院神經外科，西安 710032）

膠質瘤是中樞性惡性腫瘤的一種，目前臨床上主要采用手術聯(lián)合放化療治療，但患者對其一線化療藥物替莫唑胺的耐藥問題不容忽視[1]。同時，膠質瘤具有四高一低的發(fā)病特點，即高發(fā)病率、高復發(fā)率、高死亡率、高致殘率和低治愈率[2]。因此，尋找一種新型的膠質瘤的化療藥物具有十分重要的意義。

細胞焦亡（pyroptosis）是一種細胞炎性程序性死亡方式，主要通過炎癥小體介導包含caspase-1 在內的多種caspase 蛋白的激活，造成包括GSDMD 在內的多種Gasdermin 家族成員發(fā)生剪切和多聚化，造成細胞穿孔，進而引起細胞死亡[3-4]。相比于凋亡（apoptosis），焦亡發(fā)生更快，并伴隨著大量促炎癥因子的釋放[5]。大量的證據(jù)表明細胞焦亡能夠影響腫瘤的發(fā)展，可作為潛在的腫瘤治療策略，為患者開發(fā)基于焦亡的新藥提供思路[6]。

重樓皂苷H（結構式見圖1，paris saponin H，PSH）屬于偏諾皂苷元型甾體皂苷，在百合科重樓屬多種植物中大量存在，本課題組先后從川產南重樓和陜產具柄重樓、狹葉重樓、云南重樓中分離鑒定了該化合物。據(jù)報道，PSH 具有抗腫瘤、抗炎、抗凝等作用[7-8]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PSH 通過A1 和A3 腺苷受體途徑，抑制膠質瘤U251 細胞增殖[9]，但其對耐替莫唑胺膠質瘤的作用機制研究尚無報道，尤其未見其誘導細胞焦亡的報道。故本研究基于細胞凋亡和焦亡對PSH 抗耐藥膠質瘤機制進行初步探討。

圖1 重樓皂苷H 的化學結構式Fig 1 Chemical structure of paris saponin H

1 材料

1.1 細胞來源

耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞株由本課題組前期研究建立成功[10]。

1.2 儀器

超凈工作臺（Thermo Fisher），CO2恒溫培養(yǎng)箱（ESCO 公司），倒置顯微鏡（Olympus），血球計數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司），Multiskan FC 酶標儀（賽默飛公司），流式細胞儀（BD FACSCalibur），透射電子顯微鏡（JEOL，JEM-1400），電泳系統(tǒng)（Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）， 熒光定量PCR 儀（BIONEER，Exicycler 96）， 紫外分光光度計（Thermo，NANO 2000），真空干燥箱（SYSBERY 公司），微量移液器（BIOHIT 公司，Proline），超純水系統(tǒng)（Heal 公司，NW10LVF），超速冷凍離心機（湖南湘儀公司）。

1.3 試藥

重樓皂苷H（寶雞翊瑞生物科技有限公司，純度：99.45%，批號：JOT-11279），CCK-8 試劑盒（Elabscience，批號：E-CK-A362），Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（BD，批號：556547），DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，批號：11965092），胎牛血清（Biological Industries，批號：04-121-1A），胰蛋白酶（Solarbio，批號：T1300），青鏈霉素混合液（Solarbio，批號：P1400），Cleaved-caspase-1 抗體（Cell Signaling Technology，批號：4199T）、N-GSDMD 抗體（abcam，批號：ab215203）、Cleavedcaspase-3 抗體（批號：19677-1-AP）、Bax 抗體（批號：50599-2-AP）、Bcl-2 抗體（批號：12789-1-AP）、IL-1β抗體（批號：16806-1-AP）、IL-18 抗體（批號：10663-1-AP）、NLRP3 抗體（批號：19771-1-AP）、β-actin 抗體（批號：20536-1-AP）（Proteintech），TRIpure（BioTeke，批號：RP1001），BeyoRT II M-MLV 反轉錄酶（碧云天，批號：D7160L），RNase inhibitor（BioTeke，批號：RP5602），2×Taq PCR MasterMix（Solarbio，批號：PC1150），SYBR Green（Solarbio，批號：SY1020），其他試劑均為國產分析純，引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將SHG44R 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8 法檢測細胞活力

取對數(shù)生長期的SHG44R 細胞接種于96 孔板中。待細胞貼壁后，加入不同濃度用DMSO 配制的PSH，培養(yǎng)不同時間后，棄上清液，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h，用酶標儀在450 nm 波長下測量各孔的吸光度（OD）值，計算細胞存活率。

2.3 透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化

取對數(shù)生長期的SHG44R 細胞，PBS 洗滌，加入6 μg·mL-1的PSH，培養(yǎng)24 h 后收集細胞，用2%戊二醛溶液固定2 h，隨后PBS 洗滌2 次，每次10 min。然后在1% 四氧化鋨溶液中固定2 h。用乙醇梯度脫水后，將細胞包埋在環(huán)氧樹脂中并切成 50 ～60 nm 的切片。切片用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。透射電子顯微鏡分析切割樣品。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的SHG44R 細胞，接種于6 孔板中，待細胞完全貼壁后，加入不同質量濃度的PSH（6、12 μg·mL-1）處理24 h。收集細胞，按照Annexin V-FITC/PI 雙染色細胞凋亡檢測試劑盒進行細胞凋亡雙染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.5 Western blot 法檢測凋亡相關蛋白表達

將細胞消化后接種于6 孔板中，待細胞貼壁后，加入不同質量濃度的PSH（6、12 μg·mL-1）處理細胞24 h。收集細胞制備蛋白樣品，10%聚丙烯胺-SDS 凝膠電泳后轉至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST 洗3 次，加入二抗室溫孵育1 h，PBST 洗3 次。加入ECL 化學發(fā)光液后放入全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中曝光。

2.6 RT-qPCR 檢測焦亡相關mRNA 表達

取對數(shù)生長期的SHG44R 細胞，接種于6 孔板中，待細胞完全貼壁后，加入3 μg·mL-1的PSH 處理24 h。收集細胞，加入Trizol 試劑提取總RNA。反轉錄制備cDNA，除去培養(yǎng)基，PBS 洗1次，除去PBS，每組加入1 mL Trizol 后放置于冰面，輕搖使Trizol 試劑充分接觸5 min。RT-qPCR檢測PSH 給藥組（3 μg·mL-1）與對照組SHG44R細胞caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3的mRNA 的表達，采用2-△△CT法計算mRNA 相對表達量。

caspase-1：Forward，ATTACAGACAAGGGTGCT；Reverse，CTTTCGGAATAACGGAGT；

caspase-11：Forward，GCACAATGGGCTCTATCT；Reverse，CAGTCGTTCTATGGTGGG；

GSDMD：Forward，GGTTAGGAAGCCCTCAAGC；Reverse，CATGGCATCGTAGAAGTGG；

IL-1β：Forward，TATTACAGTGGCAATGAGG；Reverse，ATGAAGGGAAAGAAGGTG；

IL-18：Forward，ATAGCCAGCCTAGAGGTA；Reverse，ATCAGGAGGATTCATTTC；

NLRP3：Forward，CCCCGTGAGTCCCATTA；Reverse，GACGCCCAGTCCAACAT；

β-actin：Forward，GGCACCCAGCACAATGAA；Reverse，TAGAAGCATTTGCGGTGG。

2.7 統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均采用Graphpad prism 8 軟件完成，數(shù)據(jù)以±s表示，組間差異通過單因素方差分析檢驗（One-way ANOVA），P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 PSH 對耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞活力的影響

采用CCK-8 法檢測不同劑量PSH 處理24、48、72 h 對細胞存活率的影響，結果表明PSH抑制SHG44R 細胞增殖具有時間和劑量依賴性。PSH 在24 h 對SHG44R 的IC50＝6.986 μg·mL-1，見圖2。

圖2 PSH 對SHG44R 細胞活力的影響Fig 2 Effect of PSH on the cell viability of SHG44R cells

3.2 PSH 對耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞形態(tài)學影響

如圖3所示，與正常組相比，PSH 組出現(xiàn)核染色質固縮、核膜皺褶，細胞器集中，出現(xiàn)凋亡小體，表明PSH 可誘導細胞凋亡。此外，細胞內容物滲漏，細胞膜有輕微損傷，提示PSH 可能誘導耐替莫唑胺膠質瘤細胞焦亡。

圖3 PSH 對SHG44R 細胞形態(tài)學影響Fig 3 Effect of PSH on the cell morphology of SHG44R cells

3.3 PSH 誘導耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞凋亡

為了進一步證實PSH 介導耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞凋亡，采用流式細胞術檢測給予PSH 后細胞凋亡率的變化。結果表明PSH 呈劑量依賴性地誘導細胞凋亡（見圖4）。

圖4 PSH 對SHG44R 細胞凋亡的影響（n ＝3）Fig 4 Effect of PSH on the cell apoptosis of SHG44R cells（n ＝3）

3.4 PSH 對耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞凋亡的蛋白的影響

采用Western blot 法檢測不同劑量PSH 處理后細胞凋亡相關蛋白的表達。結果表明，給予PSH 可使Bax、Cleaved-caspase-3 蛋白上調，Bcl-2 蛋白下調（見圖5）。

圖5 PSH 對SHG44R 細胞凋亡關鍵蛋白的影響Fig 5 Effect of PSH on the key proteins of cell apoptosis in SHG44R cells

3.5 PSH 誘導耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞焦亡

如圖6所示， 與正常組相比，PSH 組caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18和NLRP3 的mRNA 表達量顯著增加。進一步采用Western blot 法檢測不同劑量PSH 處理后細胞焦亡相關蛋白的表達。結果表明，給予PSH 使Cleaved-caspase-1、Cleaved-N-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3 蛋白上調（見圖7）。蛋白表達和基因水平結果一致，說明PSH 可誘導耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞焦亡。

圖6 PSH 對SHG44R 細胞焦亡GSDMD 通路相關mRNA 表達的影響（n ＝3）Fig 6 Effect of PSH on the expression of mRNA related to the GSDMD pathway of pyroptosis of SHG44R cells（n ＝3）

圖7 PSH 對SHG44R 細胞焦亡GSDMD 通路相關蛋白的影響Fig 7 Effect of PSH on GSDMD pathway pyroptosis-related proteins in SHG44R cells

4 討論

耐藥是膠質瘤臨床治療面臨的重要問題。天然產物是抗腫瘤先導化合物的重要來源[11]，從中藥中尋找具有抗耐藥膠質瘤作用的活性成分具有重要意義。既往研究已報道重樓皂苷抗腫瘤的多種作用機制，主要包括抑制增殖、凋亡、影響遷移與侵襲、阻滯細胞周期、聯(lián)合一線化療藥物輔助治療、逆轉腫瘤耐藥、氧化應激、改變腫瘤細胞膜通透性、抑制胞內藥物外流，抑制血管增生、誘導自噬等[7-8，12]。但關于重樓皂苷對細胞焦亡等新型細胞死亡方式的影響的報道較少。本研究結果顯示，PSH 可抑制耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞增殖，誘導SHG44R 細胞凋亡和焦亡。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，是多數(shù)重樓皂苷引起腫瘤細胞死亡的常見機制[13-14]。其中內源性通路是由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白調節(jié)，如Bcl-2 蛋白家族蛋白[15-16]，當 Bax/Bcl-2 比值發(fā)生變化，線粒體通透性增加，線粒體破裂，促凋亡蛋白細胞色素C 將從線粒體釋放到細胞質，激活下游caspase 家族[17-18]。caspase-8 和caspase-9 作為caspase 的啟動子，最終激活下游凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3，通過裂解細胞底物誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，與正常組相比，重樓皂苷H 可顯著上調SHG44R 細胞中凋亡相關蛋白Cleavedcaspase-3、Bax 表達水平，顯著降低Bcl-2蛋白表達水平，表明重樓皂苷H 可誘導SHG44R 細胞凋亡。

細胞焦亡在體外抑制腫瘤細胞增殖和體內腫瘤生長中起著關鍵作用[19]。與其他細胞死亡方式相比，具有獨特的形態(tài)和機制[20-21]。Gasdermin 家族蛋白是細胞焦亡的關鍵效應分子，其誘導細胞焦亡的機制比較明確，同時也是其經典途徑[22]。一方面，在外界的刺激下，細胞內的模式識別受體（NLR）作為感受器，識別信號，通過接頭蛋白ASC 與Pro-caspase-1 結合，形成多蛋白復合物，激活caspase-1，活化的caspase-1 一方面切割GSDMD，形成含有GSDM-NT 活性域的肽段，誘導細胞膜穿孔，細胞破裂，釋放內容物，引起炎癥反應；另一方面，活化的caspase-1 對IL-1β和IL-18 前體進行切割，形成有活性的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，募集炎癥細胞聚集，擴大炎癥反應其是由炎性小體組裝介導的，伴隨著GSDMD裂解及IL-1β和IL-18 的釋放[23]。本研究結果顯示，與正常組相比，PSH 可顯著上調SHG44R 細胞中caspase-1、caspase-11、GSDMD、IL-1β、IL-18、NLRP3 的mRNA 表達水平，同時上調Cleavedcaspase-1、Cleaved-N-terminal-GSDMD、IL-1β、IL-18 和NLRP3，表明重樓皂苷H 可誘導耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞焦亡。

綜上所述，PSH 能夠抑制耐替莫唑胺膠質瘤SHG44R 細胞增殖，誘導其細胞凋亡與焦亡。