基于同步輻射顯微CT的腎結石微觀結構特征研究

解瑩馨, 王一惟, 薛艷玲， 鄧 彪， 彭冠云*

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院腎內(nèi)科， 上海 200011

2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科， 上海 200011

3. 中國科學院上海高等研究院上海光源中心， 上海 201204

4. 中國科學院上海應用物理研究所， 上海 201204

引 言

泌尿系結石是全球的泌尿系統(tǒng)常見病、 多發(fā)病， 據(jù)統(tǒng)計， 約11%男性和7%女性罹患腎結石[1-2]。 泌尿系統(tǒng)任何部位均可發(fā)生結石但常原發(fā)于腎。 我國腎結石患病率稍低于歐美洲國家， 男性約為10.3%， 女性約為6.6%[3]。 雖然腎結石的診斷及治療技術在過去的幾十年中已取得很大的進步， 但其發(fā)病率和復發(fā)率仍高居不下， 且發(fā)病率有日漸上升的趨勢[3]。 結石可導致腎積水， 損傷腎功能， 甚至誘發(fā)出現(xiàn)危及生命的情況， 如嚴重的泌尿系感染和終末期腎病等[4-6]。 因此， 增加對于腎結石發(fā)病機制認識以便開展針對性的治療方法是提高治療腎結石成功率的關鍵。

腎結石病因較復雜， 結石形成機制尚不清楚， 目前提出了各種各樣的有關腎結石病因的學說， 主要是從人體種族遺傳、 疾病、 代謝和飲食習慣等方面研究結石病因， 從而產(chǎn)生不同種類的結石， 再確定治療方案。 對結石本身的研究， 主要集中在結石的成分上。 腎結石主要以含鈣結石為主， 其中又以草酸鈣結石最多， 約占腎結石的(65.9%～90%)[7-8]。 然而， 若能直觀觀察到結石的內(nèi)部結構， 并根據(jù)這些結構特征推斷出結石的形成和成長軌跡， 無疑能對治療患者腎結石和預后起到重要作用。 因傳統(tǒng)的研究手段難以無損獲得結石的內(nèi)部結構， 目前， 還不曾見到腎結石微觀結構相關報道。 而高分辨率顯微CT特別是同步輻射X射線顯微CT的出現(xiàn)， 無疑能為這一研究提供最先進的檢測手段[5-7]。

上海同步輻射光源作為第三代優(yōu)質(zhì)同步輻射光源， 具有高光子通量、 高準直性、 高極化性、 高相干性及寬頻譜范圍等優(yōu)點， 其配合高分辨的X射線探測器可實現(xiàn)精確、 靈敏的組織結構信息的快速、 無損檢測， 在保持標本完整性的前提下， 清晰再現(xiàn)樣品內(nèi)部的三維顯微結構， 從而克服了傳統(tǒng)的二維切片技術存在破壞組織結構的完整性、 無法準確獲得組織結構的三維空間信息和基質(zhì)成份等局限性。 X射線成像及生物醫(yī)學應用光束線站(BL13W1)是上海光源首批運行的七條線站之一。 該線站利用插入件扭擺器作為光源， 以雙晶單色器將白光轉為單色光， 主要開展單色X射線成像實驗研究， 發(fā)展了多種X射線成像方法， 如吸收成像、 同軸相襯成像等， 從而克服了傳統(tǒng)的二維組織學切片染色技術存在破壞組織結構的完整性、 無法準確獲得組織結構的三維空間信息和基質(zhì)成份等局限性， 為本研究提供了先進可靠的技術手段[9-10]。

本研究以不同患者腎結石為探測目標， 依托上海同步輻射光源， 通過利用同步輻射X射線顯微CT技術， 探測腎結石結構， 為進一步深入研究結石病因的形成與生長機制以及腎結石的科學防治提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料

收集草酸鈣腎病患者的結石32例， 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院提供。

1.2 方法

在上海光源BL13W1光束線站進行顯微CT掃描。 BL13W1為Wiggler光源， 最大束斑尺寸為45 mm(H)×5 mm(V) @30 m@20 keV， 光子通量密度為6×10 phs·s-1·mm-2@20keV@Si111, 光子能量可調(diào)范圍在8～72.5 keV， 能量分辨率(ΔE/E)為<5×10-3， 該線站采用同軸法其系統(tǒng)極限分辨率可達亞微米級。

選擇能量26 keV, CCD單像素尺寸為3.25 μm， 樣品到CCD距離13 cm。 所獲取的圖像用ImageJ軟件進行分析。

2 結果與討論

結石內(nèi)部結構差異明顯， 可歸納為6種類型(圖1)： Ⅰ兩相密實型； Ⅱ結晶型； Ⅲ連續(xù)多層沉積型; Ⅳ非連續(xù)多層沉積型； Ⅴ鑲嵌式多孔型； Ⅵ復合型。 其特征如下：

Ⅰ兩相密實型： 結石由密度差異明顯的兩相組成， 結石內(nèi)部基本密實或有少量空隙， 沒有明顯的層狀結構。 Ⅱ結晶型： 分Ⅱa型和Ⅱb型， Ⅱa型顆粒和結晶體相對均勻分散， 孔隙較多； Ⅱb型中結晶體顆粒分布在結石的一側， 而結石另一側密度差異相對較少， 孔隙相對較少， 結石棱角清晰。 Ⅲ連續(xù)多層沉積型： 具有明顯的層狀結構， 且層狀結構連續(xù)。 Ⅳ非連續(xù)多層沉積型： 有明顯的層狀結構， 層狀結構斷裂不連續(xù)。 Ⅴ鑲嵌式多孔型： 結石由密度差異較大的兩相組成， 有較多的不同尺寸大小的孔隙分布在結石之中。 Ⅳ復合型： 兼連續(xù)多層沉積型和鑲嵌式多孔型結構， 連續(xù)多層沉積部分分層明顯， 且分層連續(xù)、 致密， 少孔隙； 而多孔部分孔隙多， 成蜂窩狀。

圖1 腎結石顯微CT結構(6種類型， 標尺為200 μm)

腎結石形成機制復雜， 形成過程包括成核、 生長、 聚集、 固相轉化等幾個階段， 然而目前越來越多的研究者強調(diào)腎小管上皮細胞與結石晶體間的相互影響， 即只有在腎小管上皮損傷情況下， 尿中的鈣晶體才能夠黏附、 生長和聚集， 形成結石。 在近期的研究中發(fā)現(xiàn)結石中存在許多尿蛋白, 主要包括骨橋蛋白(OPN)、 Tamm-Horsfall蛋白(THP)、 尿凝血酶原片段1(UPTF1) 、 腎鈣蛋白(NC)等, 這些蛋白與腎結石的形成關系密切[10-12]。 假設基質(zhì)蛋白與礦物質(zhì)， 如混凝土中的水泥和沙石， 基質(zhì)蛋白能起到黏結膠合作用。 因腎結石復發(fā)率高， 獲得結石的微觀結構， 分析患者產(chǎn)生不同的種類的結石， 積極探索結石的生長機制， 科學確定治療和預后方案， 無疑能有助于腎結石更為有效的治療。

研究表明， 顯微CT無損檢測能獲取到清晰的腎結石內(nèi)部結構。 腎結石內(nèi)部的結構有較大差異， 表明結石形成的復雜性。 本研究中通過觀察歸納出的6種類型中， 其中連續(xù)多層沉積型、 非連續(xù)多層沉積型和復合型能明顯看到結石分層結構， 體現(xiàn)出結石清晰的生長軌跡。 而從兩相密實型、 結晶型和鑲嵌式多孔型顯微CT圖中推測不出腎結石的生長過程， 需要對其更深入的跟蹤研究。

3 結 論

通過收集腎結石患者的結石樣本32例， 利用SR-μCT(能量為26 keV， CCD單像素尺寸3.25 μm)對其精細結構進行了解析。 實驗結果表明， 顯微CT能清晰獲得結石內(nèi)部微觀結構； 腎結石內(nèi)部結構差異明顯， 可歸納為6種類型： Ⅰ兩相密實型； Ⅱ結晶型； Ⅲ連續(xù)多層沉積型; Ⅳ非連續(xù)多層沉積型； Ⅴ鑲嵌式多孔型； Ⅵ復合型。 本研究結果對進一步深入揭示腎結石生長機制及對腎結石更為科學有效防治提供了一新的研究方法和科學視角。