基于UHPLC-QE-MS的CCI模型大鼠的血清代謝組學研究

白鳳媛, 趙冬梅, 蔡仁軍, 宋素菲, 劉 濤*, 徐秋玲*

1. 海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院, 海南 海口 571199

2. 海南醫(yī)學院中醫(yī)學院， 海南 ?？?571199

引 言

慢性疼痛是最常見的慢性疾病之一， 不僅給患者帶來軀體和精神上的痛苦、 降低生活質量, 同時增加醫(yī)療支出,加重家庭和社會的經濟負擔。 慢性疼痛的致殘率高， 醫(yī)療費用支出巨大[1-2]。 目前臨床治療疼痛的藥物包括抗抑郁藥、 NMDA 拮抗劑、 阿片類鎮(zhèn)痛藥等， 然而這些藥物大部分具有較多的不良反應， 限制了其廣泛應用。

慢性疼痛的代謝組學研究尚處于起步階段。 代謝組學研究在其他醫(yī)學領域取得了成功。 這些成就激勵研究人員擴大代謝組學研究， 可以提高對慢性疼痛基本機制的理解， 并提供診斷、 預測和監(jiān)測慢性疼痛狀況的工具。

1 實驗部分

1.1 實驗動物及分組

12只無特定病原體(SPF)級雄性大鼠購自長沙市天勤生物技術有限公司， 許可證號： SCXK(湘)2019-0013。 體重180～200 g。 隨機均分為正常組、 慢性壓迫損傷(chronic constriction injury, CCI)組， 每組6只。 CCI組進行左側坐骨神經結扎手術造成慢性壓迫損傷(CCI)模型， 正常組除不結扎坐骨神經， 其余步驟實驗組。 術后14天， 腹主動脈采血， 進行代謝組學檢測。

1.2 方法

參考Bennett等推薦的方法制備 CCI模型[3]。 將大鼠用1%的戊巴比妥鈉(4 mL·kg-1)麻醉后， 在左側坐骨神經分叉前的主干部位距神經起始處上方2 mm用4-0羊腸線結扎坐骨神經4道， 每道間隔約1 mm， 結扎的松緊度以打結時可見肌肉輕微抽動為準。

2 結果與討論

2.1 大鼠血清差異代謝物的層次聚類分析熱力圖

對差異代謝物的定量值計算歐式距離矩陣(Euclidean distance matrix)， 以完全連鎖方法對差異代謝物進行聚類， 并以熱力圖展示。 結果見圖1和圖2。

圖中橫坐標代表不同實驗分組， Bm為CCI組， K為正常組， 縱坐標代表該組對比的差異代謝物， 不同位置的色塊代表對應位置代謝物的相對表達量， 紅色表示該物質含量高表達， 藍色表示該物質含量低表達。

圖1 POS(正離子模式)

圖1表明, 正離子模式下， 喹啉、 肉毒堿、 3-甲基胞嘧啶、 L-α-氨基丁酸、 脯氨酸羥脯氨酸、 硫胺素、 羥基苯乙酰甘氨酸、 膽固醇、 乙苯等代謝物的表達升高； 4-胍丁酸甲基吡嗪、 3-甲基組氨酸、 D-丙氨酸、 丙酰肉堿、 肌苷、 胸苷、 L-天冬氨酸、 N-乙酰組氨酸等代謝物的表達降低。

圖2表明， 負離子模式下， 2-甲基戊二酸(R)-3-羥基丁酸、 吲哚乙酸、 焦谷氨酸、 十一烷酸、 二十碳五烯酸等代謝物的表達升高； ?；撬帷?神經酸、 3-甲基組氨酸、 馬兜鈴酸、 馬尿酸、 吲哚丙烯酸、 蘇糖酸等代謝物的表達降低。

圖2 NEG(負離子模式)

2.2 差異代謝物的富集分析

利用超高效液相色譜Q萃取質譜分析(ultra-high performance liquid chromatography q exactive mass spectrometry, UHPLC-QE-MS)并結合PCA(主成分分析)、 OPLS-DA(正交最小二乘法判別分析)和OPLS-DA置換檢驗等多元統(tǒng)計分析方法后， 對上述層次聚類分析熱力圖篩選出的差異代謝物, 利用MetabolicAnalyst5.0進行差異代謝物的富集分析。 富集分析氣泡圖見圖3， 富集分析表見表1。

圖3 富集分析氣泡圖

表1 富集分析表

代謝組學是指生物體或細胞在特定生理時期所有小分子量代謝產物的集合[4]。 通過檢測血液、 尿液等各種生物樣品中的分子來揭示整個代謝概況[5]。 代謝組學的目的是研究生物系統(tǒng)中代謝物的變化, 通過篩選實驗組和對照組之間的不同代謝物， 可以研究與不同代謝物相關的生物過程， 以揭示相關生命活動的機制[6]。 代謝組學技術為疾病的發(fā)生和治療機制研究提供了新思路[7]， 代謝組學技術的應用促進了疼痛研究的發(fā)展[8]。

目前慢性疼痛尚缺乏特異性的分子生物學指標， 而代謝組學在研究生物標志物方面具有廣闊的前景。 王國遼等[8]采用氣相色譜-質譜(GC-MS)研究代謝組學， 篩選出大鼠術后急性疼痛和慢性坐骨神經痛的35種差異代謝物。 段昆等[9]通過建立大鼠原發(fā)性痛經模型， 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術共篩選鑒定出12種與原發(fā)性痛經相關的差異性代謝物。 何瑤等[10]構建大鼠痛經模型， 采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜(UPLC-Q-TOF-MS) 技術篩選出?；切苋パ跄懰岷腿苎字岬韧唇洿笫笱獫{中的差異性代謝物。 龔思思等[11]運用基于UPLC-QToFMS的非靶向代謝組學方法研究骨關節(jié)炎血清代謝物， 結果表明， 血清代謝組學方法能夠有效區(qū)分病例組和對照組。 本研究以正常大鼠及慢性坐骨神經痛大鼠血清為樣本， 采用UHPLC-QE-MS代謝組學技術對其進行差異性代謝物篩選， 結果共篩選出9種差異性代謝物， 主要包括： 有機酸、 有機雜環(huán)化合物、 脂肪?；?、 碳水化合物、 核酸、 有機氮化合物、 碳氫化合物、 有機氧化合物、 苯類。 實驗結果顯示這些差異性代謝物在慢性疼痛的診斷、 機制研究及藥物靶點研究中具有重要應用價值。

有機酸、 有機化合物、 核酸等代謝物與慢性疼痛關系密切。 楊菁等[12]研究結果表明， 食用土當歸總有機酸具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用， 并且有機酸是食用土當歸抗炎鎮(zhèn)痛的主要有效成分。 有研究表明[13]當疼痛發(fā)生時大鼠腦組織中一氧化氮(NO)、 COX2等化合物表達量明顯增加。 研究發(fā)現， 有機化合物——甲烷具有鎮(zhèn)痛作用[14]。 核酸在慢性疼痛的發(fā)生、 發(fā)展中均具有重要作用[15]。 本研究結果顯示， 與正常組相比， 建立CCI模型后血清中的有機酸、 有機化合物、 核酸等代謝發(fā)生了變化， 說明有機酸、 有機化合物、 核酸等可能是引起慢性疼痛的重要靶點。

3 結 論

使用UHPLC-QE-MS代謝組學技術對坐骨神經慢性壓迫損傷模型大鼠的血清代謝物進行初步研究， 篩選出的有機酸、 有機雜環(huán)化合物、 脂肪?；?、 碳水化合物、 苯類等9類代謝物質可能與慢性疼痛關系密切。 但有機雜環(huán)化合物、 脂肪?；?、 碳水化合物、 苯類等包含的相關化學物質詳細種類較多， 尚不明確究竟何種物質在慢性疼痛的發(fā)生、 傳遞和調制的過程中起決定作用， 這些差異代謝物在慢性疼痛中的作用機制及其具體靶點還有待進一步深入研究。