基于網絡藥理學和分子對接技術探索龜甲治療骨關節(jié)炎的潛在機制

朱香梅，李 晴，石雨荷，朱 玨，童巧珍*，劉湘丹，王 智

(1.湖南中醫(yī)藥大學 藥學院，湖南 長沙 410208；2.湘產大宗道地藥材種質資源及規(guī)范化種植重點研究室，湖南 長沙 410208；3.湖南省普通高等學校中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208)

骨關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)一種退行性關節(jié)疾病，以關節(jié)軟骨退化、軟骨下骨硬化、炎癥和滑膜增生等為主要病理特點[1]。主要臨床癥狀包括慢性疼痛、關節(jié)不穩(wěn)定、僵硬和放射性關節(jié)間隙狹窄。衰老、關節(jié)創(chuàng)傷、肥胖和遺傳傾向是骨關節(jié)炎形成的重要原因[2]。全世界大約有3億人患有骨關節(jié)炎，其中60歲以上人群中，女性發(fā)病率占18%，男性占10%[3]。隨著人口老齡化，骨關節(jié)炎發(fā)病率呈快速上升趨勢，是老年人致殘的主要原因。目前，西醫(yī)基礎治療主要以緩解癥狀及矯正畸形為主，藥物治療以鎮(zhèn)痛藥和關節(jié)局部藥物注射為主，手術治療多以截骨術和關節(jié)置換術為主，但治療效果不佳[4]。中醫(yī)學認為OA屬“骨痹”范疇，肝腎虧虛、筋骨失養(yǎng)為本，風寒濕痰瘀為標，筋骨經脈不通不榮為其主要病機，病理性質多屬本虛標實[5]。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，中藥多成分、多靶點的特點在防治骨關節(jié)炎過程中占有重要地位。

龜甲為龜科動物烏龜Chinemysreevesii(Gray)的背甲及腹甲，性甘，味咸，具有滋陰潛陽、益腎強骨的功效[6]。龜甲化學成分包括膠原蛋白、氨基酸、脂肪酸、微量元素等，常炮制成龜甲膠來提高免疫功能、延緩衰老，是中高端滋補藥材市場的主要產品[7]。研究表明，龜甲可促進軟骨細胞Ⅱ型膠原的合成，促進軟骨細胞增殖，發(fā)揮該作用的物質以龜甲膠為主，進一步研究發(fā)現(xiàn)龜甲膠通過調控p38 MAPK、JNK、ERK1/2等基因表達水平，從而減緩骨關節(jié)炎的進展[8]。龜甲作為膠類藥食同源藥材之一，其治療骨關節(jié)炎的物質基礎和機理研究進展緩慢。本研究采用網絡藥理學方法預測龜甲活性成分治療骨關節(jié)炎的作用靶點與通路，并采用分子對接技術對其核心靶點及其相關活性成分進行對接，初步探討龜甲在關節(jié)炎治療中的作用機制，以期為龜甲治療骨關節(jié)炎的藥理研究和臨床應用提供依據(jù)。

1 數(shù)據(jù)庫

本研究涉及的數(shù)據(jù)庫如表1所示。

表1 本研究涉及的數(shù)據(jù)庫

2 方法

2.1 龜甲活性成分篩選

以“GUI BAN、GUI JIA、ZHI GUI BAN或GUI BAN JIAO”為檢索詞，利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫收集龜甲化學成分，并通過查閱相關文獻查找數(shù)據(jù)庫未收載的成分，合并去除重復部分，最終確定其活性成分。

2.2 龜甲作用靶點與骨關節(jié)炎靶點的篩選

利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫，收集龜甲化合物靶點，以Probability>0.01進行靶點篩選，最終獲得龜甲的作用靶點。在TTD數(shù)據(jù)庫、PharmGkb數(shù)據(jù)庫、OMIM 數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫中以“Osteoporosis”為檢索詞進行搜索，得到骨關節(jié)炎的靶點。

2.3 龜甲治療骨關節(jié)炎潛在作用靶點的篩選及網絡構建

將龜甲活性成分與骨關節(jié)炎的靶點輸入Venny 2.1在線平臺，繪制出韋恩圖，同時獲取兩者的交集靶點，這些交集的靶點即龜甲治療骨關節(jié)炎潛在的作用靶點。在Cytoscape 3.8.2軟件中導入成分與疾病靶點，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖。

2.4 潛在作用靶點生物過程及通路的富集分析

將在“2.3”項獲得的潛在作用靶點通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉換成Uniprot ID，導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因本體論(GO)生物過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路的富集分析。

2.5 蛋白互作(PPI)網絡構建與分析

在String數(shù)據(jù)庫“Multiple Proteins”中導入潛在的作用靶點，限定Organism為“Homo sapiens”，設置最低相互作用評分為中等置信度0.4，獲得蛋白互作圖，下載TSV格式文件保存。在Cytoscape 3.8.2軟件中導入TSV文件進行可視化，使用CytoNCA插件篩選龜甲治療骨關節(jié)炎的核心靶點。

2.6 分子對接評估結合潛力

利用iGEMDOCKV2.1軟件對龜甲治療骨關節(jié)炎的核心靶點及相對應的活性成分進行對接。首先，在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫選定“Homo sapiens”“PDB ID”“Ligand”“Value”進行搜索，以Resolution<2.5、結構復合體中有小分子配體信息、結晶pH值接近人正常生理范圍等進行篩選，下載核心靶點PDB格式。從PubChem中下載活性成分的2D結構，通過OpenBabel軟件轉化成mol2格式保存。將核心靶點PDB及性成分配體mol2格式分別導入iGEMDOCK軟件中的Prepare Binding Site和Prepare Compounds，選擇標準對接模式：Population size=200，Generation=70，Number of solution=2,進行分子對接[9]。結果以能量高低判斷配體與受體的結合程度，化合物分子與受體結合的構象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生作用的可能性越大[10]。

3 結果

3.1 龜甲活性成分

從BATMAN-TCM和TCMID數(shù)據(jù)庫中分別檢索到龜甲成分數(shù)量為10個和40個，查閱龜甲活性成分研究文獻，補充18個，去除未找到靶點和重復的成分后共27個。見表2。

表2 龜甲活性成分信息

3.2 龜甲治療骨關節(jié)炎潛在的治療靶點

在SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中檢索27個活性成分作用靶點，去除重復后共獲得314個靶點。經TTD、PharmGkb、OMIM 和Drugbank數(shù)據(jù)庫檢索骨關節(jié)炎靶點，分別檢索到18、9、9和155個疾病相關靶點，篩選去重后共獲得180個靶點。通過Venny2.1在線平臺對314個龜甲活性成分靶點和180個骨關節(jié)炎相關靶點進行交集映射，得到41個共同靶點(圖1)，即龜甲抗骨關節(jié)炎的潛在作用靶點。在Cytoscape 3.8.2中導入篩選后的藥物靶點和疾病靶點，構建“藥物-成分-疾病-靶點”網絡圖(圖2)，該網絡有482個節(jié)點，1 270條邊，結果顯示，龜甲抗骨關節(jié)炎潛在的作用靶點包括：脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)、過氧化物酶體增殖物激活受體δ(PPARD)、基質金屬蛋白酶2(MMP2)、組胺H2受體(HRH2)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲氨酸蛋白酶抑制劑A6(SERPINA6)、醛酮還原酶家族1成員C1(AKR1C1)、胞質磷脂酶A2(PLA2G4A)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARA)、多不飽和脂肪酸5-脂氧合酶(ALOX5)、醛酮還原酶家族1成員B10(AKR1B10)、甘氨酸受體亞基α-1(GLRA1)、視黃酸受體α(RXRA)、細胞色素P450(CYP2C19)、葡萄糖醛酸轉移酶2B7(UGT2B7)、磷脂酶A2(PLA2G1B)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、多藥耐藥相關蛋白1(ABCC1)、磷脂酶A2磷脂酶A2膜相關(PLA2G2A)、皮質類固醇11β脫氫酶同工酶1(HSD11B1)、γ-氨基丁酸受體亞單位α-2(GABRA2)、前列腺素G/H合酶1(PTGS1)、膽堿酯酶(BCHE)、溶質載體家族22成員6(SLC22A6)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、脂肪酸結合蛋白(FABP2)、雄激素受體(AR)、醛酮還原酶家族1成員B1(AKR1B1)、碳酸酐酶2(CA2)、乙酰膽堿酯酶(ACHE)、過氧化物酶體激活受體-γ增殖體(PPARG)、醛酮還原酶家族1成員C2(AKR1C2)、γ-氨基丁酸受體亞基α-1(GABRA1)、前列腺素D2受體2(PTGDR2)、前列腺素E2受體EP1亞型(PTGER1)、ATP依賴性易位酶(ABCB1)、瞬時受體電位陽離子通道亞家族V成員1(TRPV1)、膽汁酸受體(NR1H4)、糖皮質激素受體(NR3C1)。

圖1 龜甲-骨關節(jié)炎交集靶點韋恩圖

3.3 GO生物過程與KEGG通路富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫對龜甲治療骨關節(jié)炎的41個潛在靶點進行GO基因功能注釋分析，以P<0.05為篩選條件，最后共富集到123個具有統(tǒng)計學差異的生物注釋過程，其中生物過程72個、細胞組成17個、分子功能34個，根據(jù)P值由小到大的順序，以氣泡圖形式呈現(xiàn)排名前15位的功能注釋過程，見圖3(A)。結果顯示，在排名前15的功能注釋過程中，主要的生物過程為：RNA聚合酶II啟動子的轉錄起始、氧化還原過程、脂質代謝過程、細胞內受體信號通路、花生四烯酸代謝過程、類固醇代謝過程等，主要細胞組成：細胞器膜、內質網膜、氯離子通道復合體、細胞外間隙等，主要分子功能包括類固醇激素受體、醛酮還原酶(NADP)活性、藥物結合、酶結合等。生物過程中的氧化還原過程、細胞組成中的細胞器膜、分子功能中的鋅離子結合富集的蛋白最多，結果見圖3(B)。

圖3 龜甲治療OA的GO富集分析

通過對41個潛在的作用靶點進行KEGG分析，共富集到33條通路，其中顯著富集(P<0.05)的25條。按照P值升序的方式，以條形圖的形式展示前20條通路，如圖4所示。結果顯示，41個潛在作用靶點涉及花生四烯酸代謝、5-羥色胺能突觸、PPAR、神經活性配體-受體相互作用、類固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化及癌癥途徑信號通路。

圖4 KEGG富集分析

3.4 潛在作用靶點的PPI網絡構建與分析

將41個潛在作用靶點輸入String網站，獲得39個相互作用的靶點，導出相互作用數(shù)據(jù)后利用Cytoscape 3.8.2軟件構建蛋白互作網絡圖，同時用CytoNCA插件對靶基因進行計算每個靶點的Degree值。如圖5所示，39個節(jié)點共產生122條邊，其中圓形越大代表Degree值越大，線條越粗相互作用越強。該網絡Degree平均值為6.26，其中超過Degree均值的靶點16個，如圖6所示分別為：PTGS2、TNF、MAPK3、PPARG、ALOX5、PTGS1、NR3C1、CYP2C19、PLA2G1B、PLA2G-4A、RXRA、ABCB1、PLA2G2A、PPARA、AR、NOS2。其中PTGS2、TNF、MAPK3的Degree值超過均值兩倍分別為21、18、16，可能是龜甲治療骨關節(jié)炎過程中起效的核心靶點。

圖5 龜甲治療OA潛在作用靶點PPI網絡

圖6 PPI網絡核心基因

3.5 i GEMDOCK分子對接結果

篩選PPI網絡分析中Degree值大于中位數(shù)的核心靶點為：PTGS2(PDB ID：5IKR)、TNF(PDB ID：2QD9)、MAPK3(PDB ID：2ZOQ)、PPARG(PDB ID：1ZGY)、NR3C1(PDB ID：4MDD)、RXRA(PDB ID：3OAP)，將其與相對應的活性成分進行對接，同時選用目前臨床應用較多的治療OA藥物雙氯芬酸鈉(PubChem ID：5018304)、西樂葆(PubChem ID：2662)作對照，研究發(fā)現(xiàn)配體與受體結合的構象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，結果見表3。與靶點PTGS2、TNF和NR3C1結合最好的是十四酸甾醇酯，與靶點MAPK3和PPARG較好結合的是(E)-11-二十碳烯酸，與靶點RXRA較好結合的是十五烷酸，且可以看出龜甲活性成分與靶點結合活性普遍高于陽性對照藥。運用i GEMDOCK軟件進行分析，并將龜甲與關鍵靶點對接結果可視化，結果見圖7。綜上可知，龜甲中的化學成分與核心靶蛋白均有較好的結合活性。

注：圖片右下角字母代表蛋白配體(PTGS2：ID8、TNF：LGF、MAPK3：5ID、PPARG：BRL、NR3C1：29M)。

4 討論

龜甲作為藥用始載于漢代《神農本草經》，謂“龜甲，味咸平，主漏下赤白、破癥瘕核瘧、濕痹、四肢重弱……”[11]龜甲膠起源于龜甲，對腰膝酸軟、久咳不愈、骨蒸盜汗等有很好的輔助治療作用，在歷版《中華人民共和國藥典》中龜甲所制得的各類龜甲膠均有收載。龜甲作為傳統(tǒng)的補腎健骨中藥，在臨床上用于骨病的治療己有很長的歷史。因此，近年來龜甲治療OA的作用引起了廣泛關注，臨床研究表明，龜甲散劑、龜甲針對骨性關節(jié)炎等骨科疾病，效果顯著[12]?，F(xiàn)代藥理學研究也表明龜甲膠能夠修復受損軟骨從而延緩骨關節(jié)炎的病理進程[13]。

本研究利用網絡藥理學方法對龜甲治療OA的作用進行挖掘，結果顯示，龜甲包含27個活性成分，對應314個靶點，與OA相關的180個靶點交集映射后獲得41個潛在作用靶點。通過構建41個靶點蛋白PPI網絡，篩選到了龜甲治療OA的關鍵靶點包括PTGS2、TNF、MAPK3、PPARG等。MAPK3屬于絲裂原激活蛋白激酶家族成員，與抗炎、抗軟骨細胞凋亡有關。有研究發(fā)現(xiàn)壯骨健脾湯可以通過抑制MAPK信號通路來預防軟骨細胞凋亡，從而治療骨關節(jié)炎[14]。臨床研究表明TNF-α水平在OA患者的滑液、滑膜、軟骨下骨和軟骨中升高，證實了其在OA發(fā)病機制中的重要作用[15]。TNF在滑膜組織中誘導一氧化氮(NO)，同時阻斷其受體，抑制人軟骨中NO的生成。且TNF-α誘導產生其他細胞因子，抑制蛋白多糖和II型膠原的合成，因此TNF-α在OA軟骨基質降解和骨吸收中起著關鍵作用[16]。PTGS2編碼環(huán)氧合酶-2，具有高度多態(tài)性，在人類OA軟骨細胞中高表達[17]，對緩解軟骨細胞損傷起著重要作用。晚期糖基化終產物(AGEs)在關節(jié)軟骨中的累積被認為是骨關節(jié)炎發(fā)展的主要危險因素，AGEs通過與PPARG相互作用激活AKT/MTOR信號通路，誘導軟骨細胞自噬維持細胞活力[18]。除去沒有配體結構的靶點蛋白，共6個核心靶點進行分子驗證，結果發(fā)現(xiàn)核心靶點與對應成分對接的能量值大多比陽性對照組低，表明龜甲成分和核心靶點之間的結合活性較高，存在較好的治療潛力。其中十四酸甾醇酯能量值最低，(E)-11-二十碳烯酸、亞油酸及十五烷酸等能量較低，結合性較好，且整體比陽性藥結果好，可能是治療OA的潛在成分。

41個潛在作用靶點的GO功能富集結果顯示，與龜甲治療OA密切相關的生物過程包括RNA聚合酶II啟動子的轉錄起始、氧化還原過程、脂質代謝過程、細胞內受體信號通路、花生四烯酸代謝過程等。KEGG通路富集結果顯示，龜甲的作用途徑包括花生四烯酸代謝、5-羥色胺能突觸、PPAR、類固醇激素生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化及癌癥途徑信號通路等。研究表明，5-脂氧合酶(5-LOX)介導的花生四烯酸代謝升高可能有助于觀察到非甾體抗炎藥在OA中的副作用，證實了其在OA的發(fā)生發(fā)展及治療中具有潛在作用[19]。PPAR通過調節(jié)各種信號通路來調節(jié)關節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)，減少人體OA軟骨的炎癥反應[20]。糖皮質激素是由腎上腺皮質合成和釋放的類固醇激素，在骨關節(jié)炎中，合成糖皮質激素可以很好地減輕炎癥和疼痛，主要通過減少膠原Ⅱ的降解，保護分解代謝激活軟骨細胞[21]。綜上所述，龜甲治療OA的作用可能與調控炎癥、軟骨代謝、細胞凋亡等有關。

本研究采用網絡藥理學方法探究了龜甲與OA的復雜網絡關系，運用分子對接證明了龜甲治療OA的合理性，最終預測了龜甲治療OA的潛在作用靶點及其作用途徑，并篩選了核心靶點，以探討其可能的分子機制。但是該研究主要依據(jù)數(shù)據(jù)庫信息，考慮數(shù)據(jù)與方法試驗存在一定的局限性，龜甲具體作用機制的確認仍需通過進一步實驗來對預測結果進行驗證。