銀杏葉提取物對小鼠氣管平滑肌舒張作用研究

高 云，廖 燦，于孟飛*，黃 露

(1.中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院 藥劑科，湖北 武漢 430077)

目前，醫(yī)學(xué)界主要以β2受體激動劑與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用來緩解哮喘癥狀[1-2]，但應(yīng)用中草藥等補充和替代藥物治療哮喘依然廣泛。銀杏葉提取物(EGB)中含有銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、多糖、蒽醌等化合物，其主要成分為24%的黃酮苷和6%的內(nèi)酯。研究證實，銀杏葉提取物具有抗氧化、擴張血管、降血壓、輔助降血脂等功效，并可降低氣道重塑重要調(diào)節(jié)因子MMP-9的表達[3-5]。因此，銀杏葉提取物具備成為一種新型支氣管擴張劑的潛力。本研究旨在探究銀杏葉提取物對于預(yù)收縮的氣管平滑肌的舒張作用，研究引起其舒張的作用機制，以期為銀杏葉藥物開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性小鼠，平均年齡6～8周，體質(zhì)量(22.1±2.2)g，購自湖北省疾病預(yù)防控制中心(合格證號：42000600036099)。雄鼠飼養(yǎng)于室溫約25 ℃、濕度約50%和12 h光暗循環(huán)中的適宜條件。該實驗已獲得中南民族大學(xué)實驗動物倫理道德委員會批準(許可證號：2019YMF06)。實驗動物從業(yè)人員上崗證號：TY2018716。雄性小鼠每次實驗重復(fù)6次，以正常小鼠初始張力為對照。

1.2 試劑

銀杏葉提取物粉末(西安天一生物技術(shù)公司提供)；吡唑3(批號：083113)、硝苯地平(批號：MKCB9232)、乙酰膽堿(批號：BCBV3168)均購自美國Sigma公司。

1.3 儀器

JH-2型張力換能器(購自中國北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所)；生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420S)，HV-4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)和超級恒溫水浴(HW-1000)(均購自成都泰盟科技有限公司)。

1.4 實驗藥物制備

精密稱取700 mg的銀杏葉提取物粉末，加入2 mL DMSO混勻，得到濃度為350 g·L-1的銀杏葉藥液，調(diào)節(jié)pH值至7.4。Nifedipine用DMSO溶解，配成母液濃度為10 μmol/L；Pyr3用DMSO溶解，配成母液濃度為30 μmol/L；Ach用高鈣溶液溶解，配成母液濃度為100 μmol/L。

1.5 方法

1.5.1 實驗預(yù)處理 調(diào)節(jié)HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)至37 ℃，調(diào)節(jié)通氧量適量，向每個浴槽中加入6 mL的高鈣溶液，最后設(shè)置生物機能實驗系統(tǒng)(BL-420S)的參數(shù)。

1.5.2 氣管制備 剪取處死后昆明鼠長度約為5 mm左右的氣管環(huán)，將氣管環(huán)通過掛鉤掛在張力換能系統(tǒng)上，置于含有6 mL高鈣液并持續(xù)通氧的37 ℃恒溫水浴槽內(nèi)。調(diào)節(jié)張力為300 mg進行平衡，每15 min換液1次，共換4次高鈣液，平衡1 h后開始正式實驗。

1.5.3 銀杏葉提取物濃度梯度對Ach預(yù)收縮的舒張作用實驗 氣管環(huán)經(jīng)過高鈣液平衡4次后，加入6 μL 100 μmol/L的Ach，等待氣管環(huán)收縮達最大值且穩(wěn)定后，依次加入適當(dāng)體積的350 g·L-1的銀杏葉藥液，使其濃度梯度依次為10-2，10-1.5，10-1，10-0.5，100，100.5，100.75，101g·L-1，加入的銀杏葉藥液體積分別為0.17 μL、0.37 μL、1.16 μL、3.72 μL、11.8 μL、37.5 μL、43.3 μL、78.4 μL，每個濃度進行12 min的實驗，并觀察不同濃度所能引起的最大舒張值。每個濃度在6個氣管環(huán)上重復(fù)。

1.5.4 銀杏葉提取物對預(yù)收縮后Nifedipine阻斷后的舒張作用實驗 氣管環(huán)經(jīng)過高鈣液平衡1 h后，向灌流槽中加入6 μL 100 μmol/L的Ach，待氣管環(huán)達到平臺期后，向恒溫通氧的水浴槽中加入6 μL 10 μmol/L的L型鈣離子通道抑制劑Nifedipine，待其舒張達到最大值且穩(wěn)定后，加入濃度350 g·L-1的銀杏葉藥液43.3 μL，觀察肌張力曲線變化。該實驗在6個氣管環(huán)上重復(fù)。

1.5.5 銀杏葉提取物對預(yù)收縮后Pyr3阻斷后的舒張作用實驗 氣管環(huán)經(jīng)高鈣液平衡1 h后，向灌流槽中加入6 μL 100 μmol/L的Ach，待氣管環(huán)達到平臺期后，向恒溫通氧的水浴槽中加入6 μL 30 μmol/L的非選擇性陽離子通道抑制劑Pyr3，待其舒張達到最大值且穩(wěn)定后，加入濃度350 g·L-1的銀杏葉藥液43.3 μL，觀察肌張力曲線變化，該實驗在6個氣管環(huán)上重復(fù)。

1.5.6 銀杏葉提取物對高K+誘導(dǎo)的預(yù)收縮舒張作用實驗 氣管環(huán)經(jīng)過平衡和預(yù)刺激操作后，向灌流槽中加入120 μL高鉀溶液，刺激氣管環(huán)并使小鼠氣管收縮達到最佳狀態(tài)，等待肌張力曲線進入平臺期，記錄肌張力曲線顯示數(shù)值。然后加入濃度350 g·L-1的銀杏葉藥液98 μL，觀察肌張力曲線變化情況。該實驗在6個氣管環(huán)上重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 銀杏葉提取物對Ach誘導(dǎo)的預(yù)收縮舒張作用

實驗結(jié)果顯示，銀杏葉提取物(EGB)能夠誘導(dǎo)Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)舒張，且這種舒張呈現(xiàn)濃度依賴性，當(dāng)銀杏葉提取物濃度達到5.62 mg/mL時，舒張作用達到最大。將引起氣管環(huán)最大收縮的最低濃度5.62 mg/mL作為本次實驗的最佳藥物濃度。圖1A為不同濃度銀杏葉提取物對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)舒張作用，圖1B為不同濃度銀杏葉提取物對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)舒張的劑量曲線。

圖1 銀杏葉提取物對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用

2.2 Nifedipine對銀杏葉提取物舒張氣管平滑肌的影響

實驗結(jié)果顯示，10 μmol/L的Nifedipine能夠部分阻斷Ach誘導(dǎo)的收縮，5.62 mg/mL的銀杏葉提取物又部分阻斷了Ach誘導(dǎo)的收縮。Nifedipine是一種L型鈣離子通道特異性阻斷劑，具有抑制鈣離子內(nèi)流的作用，能松弛血管平滑肌。Ach同時激活非選擇性陽離子通道和L型鈣離子通道，從而導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流和胞質(zhì)內(nèi)鈣離子增加進而觸發(fā)氣管平滑肌收縮。這些結(jié)果表明，銀杏葉提取物可能通過抑制L型鈣離子通道和非L型鈣離子通道來參與Ach誘導(dǎo)的氣管平滑肌的舒張，隨后驗證銀杏葉提取物是否可能通過抑制非選擇性的陽離子通道來參與Ach誘導(dǎo)的氣管平滑肌舒張。圖2表示銀杏葉提取物在Nifedipine存在的條件下對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用。

注:與Ach組比較，*P<0.05；與ACH+Nifedipine組相比較，

2.3 Pyr3對銀杏葉提取物舒張氣管平滑肌的影響

實驗結(jié)果顯示，30 μmol/L的Pyr3能夠部分地阻斷Ach誘導(dǎo)的收縮，5.62 mg/mL的銀杏葉提取物又部分地阻斷了Ach誘導(dǎo)的收縮。Pyr3是陽離子通道TRPC3和Orai1的非選擇性抑制劑，能夠部分抑制Ach誘導(dǎo)的收縮。這些結(jié)果表明，非選擇性陽離子通道可能參與了銀杏葉提取物誘導(dǎo)的氣管環(huán)舒張。圖3表示銀杏葉提取物在Pyr3存在的條件下對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用。

注：與Ach組比較，*P<0.05；與ACH+Pyr3組相比較，#P<0.05。

2.4 銀杏葉提取物對高K+誘導(dǎo)的預(yù)收縮的舒張作用

實驗結(jié)果顯示，濃度為5.62 mg/mL的銀杏葉提取物能完全舒張高鉀誘導(dǎo)的收縮。高鉀離子溶液通過去極化激活L型鈣離子通道，進而引起氣管平滑肌收縮。這些結(jié)果表明，銀杏葉提取物可通過抑制高鉀溶液激活的L型鈣離子通道舒張氣管平滑肌。圖4為銀杏葉提取物對高鉀預(yù)收縮的舒張作用。

注：與K+組比較，*P<0.05。

3 討論

銀杏葉提取物是一種前景較好的可用于治療氣道炎癥的生物資源[6-8]。據(jù)研究報道，銀杏葉提取物中含有豐富的黃酮，而黃酮是一類具有極佳抗炎效果的物質(zhì)。此外，在銀杏葉提取物中存在一類特有的萜類物質(zhì)銀杏內(nèi)酯，被公認是一種天然的PAF拮抗劑，而PAF在氣道炎癥中至關(guān)重要，可導(dǎo)致肺氣道炎癥加重[9-12]。銀杏葉提取物對氣管平滑肌是否具有舒張作用，其相應(yīng)的作用機理如何，值得進行深入研究。

為了解銀杏葉提取物舒張氣管平滑肌的機制，本實驗研究了L型鈣離子通道阻斷劑對于銀杏葉提取物舒張氣管的影響。實驗結(jié)果表明，L型鈣離子通道阻斷劑Nifedipine可部分舒張已收縮的氣管，而銀杏葉提取物可持續(xù)引起氣管舒張，但舒張作用較對照情況下(圖2)顯著變小。這表明銀杏葉提取物可通過阻斷L型鈣離子通道來實現(xiàn)對氣管平滑肌的舒張作用。本實驗還研究非選擇性的陽離子阻斷劑對于銀杏葉提取物舒張氣管的影響。實驗結(jié)果表明，非選擇性的陽離子阻斷劑Pyr3可部分舒張已收縮的氣管，而銀杏葉提取物可持續(xù)有效舒張氣管平滑肌，但舒張作用較對照情況下(圖3)顯著變小。這表明銀杏葉提取物可通過阻斷鈣敏感通路實現(xiàn)對氣管平滑肌的舒張作用。為深入研究銀杏葉舒張氣管平滑肌的機制，本實驗探討了銀杏葉提取物對于高K+收縮的氣管平滑肌的舒張作用。由圖4可見，銀杏葉可強烈舒張高K+引起的氣管平滑肌收縮。這可能是因為銀杏葉可通過阻斷L型鈣離子通道，從而發(fā)揮舒張氣管平滑肌的作用。

銀杏葉對于氣管平滑肌具有強烈的舒張作用，其舒張作用主要通過L型鈣離子通道和鈣敏感通道發(fā)揮作用。因此，將銀杏葉開發(fā)為治療慢性支氣管炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的藥物具備潛在可能性。