骨質疏松動物模型研究現(xiàn)狀與進展

江瑞雪 蔣欣泉 文晉

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔修復科，上海交通大學口腔醫(yī)學院，國家口腔醫(yī)學中心，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，上海市口腔醫(yī)學重點實驗室，上?？谇会t(yī)學先進技術與材料工程技術研究中心，上海 200011

骨質疏松(osteoporosis，OP)是好發(fā)于中老年人的一種常見的全身性骨骼代謝性疾病，以低骨量和骨組織微結構破壞為特征，易導致骨質脆性增加和骨折傾向。OP主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，其中原發(fā)性OP約占80%，主要包括絕經(jīng)后和老年性OP[1]，繼發(fā)性則是繼發(fā)于各種全身性或內(nèi)分泌代謝性疾病的OP。近年來，我國骨質疏松癥的患病率有所上升，超過1/3的50歲及以上人群受到影響[2]。2018 年，基于11個省(市)44個縣(區(qū))2萬余人的大規(guī)模、多中心流行病學調查顯示，OP已經(jīng)成為我國50歲以上人群的重要健康問題，中老年女性骨質疏松問題尤為嚴重[3]。在歐盟，OP患者預計將從2010年的2 800萬上升到2025年的3 400萬[4]。隨著人類預期壽命延長和人口結構改變(人口老齡化)，OP將成為全球范圍內(nèi)更加嚴重的公共健康問題[4-6]。

關于OP的研究(發(fā)病機制、藥物篩選、防治手段等)都離不開動物模型的構建和應用[7]。理想的OP模型至少需要符合以下幾點[8]：一是簡便，即建模方法簡單，周期短，建模過程具有較強的可控性和可操作性；二是經(jīng)濟，即建模費用適中，可大批量應用；三是相似性好，能較好地模擬 OP發(fā)生和發(fā)展的過程。經(jīng)過長期實踐探索，OP研究中模式動物種類繁多，造模方法可概括為誘導建模和基因工程建模兩類[9]。最常用的模式動物有小鼠和大鼠，而斑馬魚因其特殊結構與生理特征，與嚙齒動物的造模周期長、不便長期動態(tài)監(jiān)測實驗等特性互補，近年來也成為了OP研究領域的一種常用模式動物[10]。

本綜述主要對目前OP動物模型常用動物、建模方法進行梳理與比較，以及基因工程動物在OP研究中的應用進行整理分析，以期為OP研究領域動物模型的構建和實驗設計提供更全面的參考。

1 誘導法建立OP模型

誘導建模最常用的手段是去勢法，即通過手術切除動物的卵巢/睪丸來模擬女性絕經(jīng)后OP或老年男性由于性激素分泌大幅減少而誘發(fā)的老年性OP。其中，去卵巢大鼠是美國食品和藥品管理局和WHO推薦的研究絕經(jīng)后OP模型。卵巢切除14 d后脛骨近端干骺端有明顯的骨丟失，30、60 d后股骨頸、腰椎體部分別出現(xiàn)顯著的骨丟失[11]，3月齡大鼠去卵巢后約50 d骨重塑達到穩(wěn)定狀態(tài)，即建立可靠的OP模型[12]。

糖皮質激素誘導的OP是最常見的繼發(fā)性OP類型[13]，服用糖皮質激素導致骨形成受損，骨折風險在幾個月內(nèi)以劑量依賴性方式增加。同理，維甲酸可影響骨代謝，激活破骨細胞促進骨吸收，使骨重建處于骨吸收大于骨形成的負平衡狀態(tài)[14]。目前糖皮質激素和維甲酸誘導OP的研究中，根據(jù)劑量和給藥方式的不同，一般2～6周可成功建模。此外，骨失用亦是導致骨質流失和繼發(fā)性OP的原因之一，故可用懸吊、固定等方式模擬人類運動功能受限或障礙引起的廢用性骨質疏松。

對目前的誘導建模進行歸納，可以分為手術誘導(卵巢切除術、甲狀旁腺切除、松果體切除等)、藥物誘導(如維甲酸、糖皮質激素等)、飲食誘導(如低鈣、磷、維生素D飲食等)、失用性誘導(如懸尾、固定等)等，常用動物包括大鼠、小鼠、兔、羊、豬、狗、斑馬魚和非人類靈長類動物。表1總結了OP常用的誘導建模的動物種類及其優(yōu)缺點比較。比起控制單因素建模，部分研究者認為聯(lián)合去卵巢與糖皮質激素等手段建模可以達到更優(yōu)效果[15]。因此，研究人員必須綜合考慮研究目的和關鍵科學問題，以及每種模式動物的優(yōu)缺點建立最適合的OP動物模型。

表1 骨質疏松常用動物建模方法及優(yōu)缺點Table.1 Common animal modeling methods for osteoporosis and their advantages and disadvantages

2 基因工程法建立OP模型

基因工程建模是指通過基因編輯技術將外源性基因插入動物基因組或對動物自身基因進行突變、敲除、過表達等使動物具有骨質疏松特性，常用動物有小鼠和斑馬魚[50]。目前基因工程法建立OP模型仍處于探索階段，部分研究將基因工程技術與去勢法相結合，探究目的基因對于OP的影響，從而有助于臨床OP新療法的研究；另一部分研究旨在探究目的基因敲除或過表達后對于骨骼系統(tǒng)的影響，從而致力于OP發(fā)病機制的探索。

2.1 基因敲除動物模型

基因敲除動物模型根據(jù)目標基因缺失的靶細胞不同，又分為全身性基因敲除和條件性基因敲除兩種動物模型。

2.1.1全身性基因敲除動物模型：Priyatha等[51]的研究結果指出p21敲除(p21-/-)小鼠可以防止去勢法引起的骨丟失，在非臨界大小的頜骨缺損中與野生型對照組相比顯示出增強的骨再生。CD73是一種成骨細胞活化劑和骨骼生長的關鍵調節(jié)因子，老齡CD73敲除小鼠骨缺損在骨愈合過程中表現(xiàn)出延遲的骨再生和顯著減少的骨基質沉積，且細胞增殖和ALP活性紊亂，骨形成和骨吸收平衡失調，表明CD73的激活可能是改善老年人群骨再生的潛在機制[52]。Akr1A1敲除小鼠(Akr1A1eGFP/eGFP)也表現(xiàn)出骨發(fā)育異常和OP，并推測可能是由骨形成受損引起的OP。此外，通過給予抗壞血酸，Akr1A1敲除小鼠表現(xiàn)出可控制的OP，表明了其作為OP研究的新動物模型的可能[53]。

鐵紊亂也被證實與OP之間存在某種相關性，大量研究著眼于此開展。Zhou等[54]發(fā)現(xiàn)Irp2敲除小鼠顯示出骨密度降低、骨小梁質量和結構受損，骨鐵缺乏和肝鐵超載，與野生型小鼠相比表現(xiàn)出更為嚴重的OP。Lin 等[55]通過鐵轉運蛋白1基因

(fpn1)突變體Wehtp85c斑馬魚證明了缺鐵可能通過成骨細胞的分化和礦化影響骨形成。姜宇等[56]通過CRISPR/CAS9技術敲除鐵調素基因建立了體內(nèi)鐵蓄積的斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)成骨基因表達降低，骨發(fā)育遲緩，骨量減低。Zhang等[57]、蘇幸[58]、Yu等[59]分別通過CRISPR/Cas9基因敲除技術在斑馬魚中產(chǎn)生了ATP6V1H功能缺失突變體、wnt16-/-突變體、nr3c1-/-突變體，證明了相應目的基因的敲除影響斑馬魚骨骼發(fā)育，為基因工程法建立斑馬魚OP模型提供了新的思路。

2.1.2條件性基因敲除動物模型：MK生長因子(促血小板生成素)在調節(jié)骨骼穩(wěn)態(tài)和造血方面發(fā)揮著關鍵作用，Alvarez等[60]通過刪除Mpl基因編碼外顯子3構建了條件敲除小鼠(Mplf/f；PF4cre)，其中Mpl，主要的MK生長因子受體被特異性敲除，導致了股骨中段的BV/TV顯著增加，骨髓基質細胞亦大量增加。毛峰峰[61]利用Cre-loxP系統(tǒng)構建了成骨細胞特異性TGFBR2基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)該轉基因小鼠早期生長延遲及骨密度、骨體積、骨形成速率明顯降低，血清ALP水平明顯下降，最終發(fā)生低轉換率的OP。Wu等[62]發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)中m6A甲基轉移酶Mettl3的條件性敲除會誘導OP的病理學特征。同時他們還構建了條件性敲入Mettl3的模型小鼠，與去勢的模型鼠相比，Mettl3過表達可預防雌激素不足引起的OP。Lee等[63]首次報道在小鼠中，單核細胞/巨噬細胞特異性敲除破骨細胞前體中受體相互作用蛋白140(RIP140)會導致松質骨減少，破骨細胞活性增加，成骨細胞活性降低，骨形成減少。

2.2 基因過表達動物模型

Nancy Karam等[64]發(fā)現(xiàn)過度表達在骨骼和關節(jié)發(fā)育中十分重要的同源盒轉錄因子配對樣同源結構域1(PITX1)的轉基因mCol1α1-Pitx1小鼠會表現(xiàn)出嚴重的老年性OP表型，其骨量、骨密度和生物力學強度顯著降低，提示其作為老年性OP動物模型的可能。核因子κB受體活化因子配體(RANKL)在一系列退行性骨疾病的由破骨細胞誘導的骨吸收中起關鍵作用。在Vagelis Rinotas等[65]的研究中，他們產(chǎn)生了攜帶人類RANKL基因組區(qū)(huRANKL)的轉基因小鼠(TghuRANKL)，實現(xiàn)了不同程度的RANKL過表達，同時表達不同量級RANKL的轉基因小鼠表現(xiàn)出有差異的OP。Jochen Schulze等[66]發(fā)現(xiàn)在成骨細胞中特異性過度表達Krm2的Col1a1-Krm2轉基因小鼠會發(fā)展為嚴重的OP，小梁骨體積和小梁數(shù)量減少，生物力學穩(wěn)定性降低，骨脆性增加，骨形成受損，骨吸收增加。Kiyoshi Hiramatsu等[67]進行的一項旨在檢測γ-谷氨酰轉移酶(GGT)在體內(nèi)致病作用的研究發(fā)現(xiàn)過度表達GGT的轉基因小鼠通過加速破骨細胞的生成和骨吸收導致骨質減少，并導致OP的形成，亦為OP建模提供了新思路。

2.3 其他

Yin等[68]以重組腺病毒為載體，將AD-APN-EGFP注射到去勢大鼠股骨遠端前內(nèi)側表面構建的骨缺損處，隨后植入鈦種植體，證實了脂聯(lián)素(APN)的過表達會引起OCN、Runx2和ALP等成骨標志物表達的明顯升高，且去勢大鼠的骨整合和植入體穩(wěn)定性顯著增加。Liu等[69]、Huang等[70]、Li等[71]分別用Ad-hWnt10b、GPNMB(糖蛋白非黑色素瘤克隆B)和骨膜蛋白(Postn)轉染的方法，證明了在去勢條件下以上策略能夠在一定程度上促進骨再生，從而可能作為治療OP的潛在手段，為OP骨再生提供了一種新的治療思路。

邊麗璇[72]通過糖皮質激素和模擬微重力效應處理斑馬魚早期胚胎建立OP模型，以Sal B和AF作為激活劑上調 Nrf2 基因的表達，發(fā)現(xiàn)Nrf2過表達可緩解骨代謝失衡。Lu等[73]的一項研究使用了shRNA介導的Pax2重組慢病毒(shPax2)轉染小鼠致密骨來源的MSC，建立了一個異位骨形成模型。結果提示Pax2在骨相關疾病的病理生理學中具有一定的作用，抑制Pax2的功能可能會損害新骨形成。

綜上所述，OP動物模型的建立包括誘導建模和基因工程建模。誘導建模常用去勢法和糖皮質激素誘導。而基因工程建模目前多為全身性基因敲除動物模型和基因過表達動物模型，條件性基因敲除動物模型以及基因敲入動物模型研究較少。而基因過表達動物模型多與去勢法相結合，在OP已建立的情況下通過基因過表達手段等進行相應研究。隨著基因編輯技術的日益完善、基因工程動物模型的培育成熟，OP發(fā)病機制及其相關信號通路研究將有望為臨床治療和疾病預防提供更多新策略。