當(dāng)歸雞血藤化裁方發(fā)揮類雌激素作用保護(hù)去卵巢大鼠骨量流失

余旭東 劉淑剛 高曉璐 陳虎,3*

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050090 2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011 3.河北省中醫(yī)藥科學(xué)院，河北 石家莊 050030

骨質(zhì)疏松癥是一種漸進(jìn)性的全身代謝性骨疾病，臨床以骨量低下，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為主要特征[1]。該病好發(fā)于絕經(jīng)后婦女，其主要發(fā)病機制為內(nèi)源性雌激素水平急劇下降，松質(zhì)骨進(jìn)行性退變，繼而導(dǎo)致骨量嚴(yán)重丟失與骨脆性的增加[2]。遺憾的是，雖然傳統(tǒng)的雌激素替代療法(estrogen replacement therapy，ERT)確實可以降低骨質(zhì)疏松的風(fēng)險，但是也極大地增加了心血管、乳腺、子宮等靶器官的負(fù)擔(dān)[3-4]。目前臨床上采用鈣鹽或雙膦酸鹽、雌激素受體調(diào)節(jié)劑、甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PHT)等方法治療骨質(zhì)疏松癥，雖然取得了一定的療效，但仍存在改善癥狀不完全或者停藥后骨丟失反彈等不良事件[5-7]。在此背景下，一部分患者傾向選擇植物來源的膳食補充劑。其中，中草藥具有明顯優(yōu)勢，中醫(yī)臨床中發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸雞血藤化裁方對骨質(zhì)疏松效果明顯，為進(jìn)一步探索其作用機制，筆者設(shè)計了本實驗。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

方劑組成與制備：當(dāng)歸20 g，雞血藤20 g，威靈仙10 g，荊芥10 g，羌活10 g，川芎10 g，秦艽10 g。采用中藥顆粒規(guī)格，一日一劑，療程12周，中藥顆粒均由江陰天江藥業(yè)有限公司提供。

實驗試劑：堿性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRAcP-5b)、Ⅰ型膠原C端肽(CTX-1)、17β-雌二醇(17β-E2)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，骨保護(hù)素(OPG)購自美國Affinity Biosciences，核因子κB 受體活化因子(RANK)抗體購自武漢博士德工程有限公司，核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，蘇木素染色液，戊巴比妥鈉，液氮，10%中性福爾馬林溶液，PBS洗液，凝膠配置液，PVDF膜均由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院動物實驗中心提供。

實驗儀器：雙能X射線骨密度儀，倒置熒光數(shù)碼顯微鏡，生物蛋白質(zhì)垂直電泳儀，高速低溫離心機，全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，各量程單通道移液器。

實驗動物：30只SPF級SD大鼠，3月齡，雌性(未交配)，體重(250±10)g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(冀)2018-004。本實驗通過河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院倫理委員會審核，批號：IACUC-4th Hos Hebmu-2020015。

1.2 藥物劑量

按成年婦女體重60 kg每日用藥量90 g計算，每日用藥濃度為1.5 g/kg，換算成大鼠等效量劑量1.5 g/kg×6.3=9.45 g/kg。

1.3 實驗方法

30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周后，隨機分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、去卵巢模型組(OVX組)、去卵巢加藥物治療組(OVX+T組)，每組10只。對空白組大鼠行假手術(shù)(只打開腹腔，取部分脂肪組織，不切除卵巢)，對其他2組大鼠均進(jìn)行雙側(cè)卵巢去勢手術(shù)。依據(jù)前期去勢大鼠造模成功經(jīng)驗于術(shù)后2個月后開始進(jìn)行正式實驗，其中Sham組與OVX組不干預(yù)，OVX+T組進(jìn)行中藥灌胃干預(yù)，12周后檢測骨密度。次日麻醉大鼠行腹主動脈采血后，離心取上層血清置于-80 ℃?zhèn)溆?。取股骨漂洗后剔除殘余組織，進(jìn)行形態(tài)學(xué)與蛋白分析。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1骨密度檢測：雙能X線骨密度儀測定大鼠第1～5段腰椎及右股骨的骨密度。

1.4.2血清指標(biāo)測定：按試劑盒說明書操作，測定血清中17β-E2、CTX-1的含量和ALP、TRAcP-5b的活性。

1.4.3骨組織形態(tài)學(xué)檢測：將股骨置于福爾馬林溶液中固定48 h后脫鈣處理，放入梯度乙醇脫水、浸蠟、石蠟包埋，之后沿正中矢狀面連續(xù)切片，厚度約為4 μm，用于蘇木精-伊紅染色，最后統(tǒng)計大鼠骨小梁面積并進(jìn)行組織學(xué)形態(tài)學(xué)觀察。

1.4.4蛋白表達(dá)檢測：取大鼠右側(cè)股骨稱重，液氮中磨碎，加入RIPA緩沖液裂解提取蛋白。測定蛋白濃度后，使用SDS-PAGE電泳分離蛋白。將電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移PVDF膜上，并使用以下一抗：OPG(1∶1 500)，RANKL(1∶1 000)，RANK(1∶1 000)，ERK(1∶1 000)與合適的二抗進(jìn)行處理，最后將PVDF膜平放至覆有保鮮膜的暗盒中進(jìn)行曝光處理，掃描膠片并用Tanon Gis軟件測定條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，若符合要求，運用單因素方差分析，組間差異兩兩比較采用LSD法，若不符合，則用非參數(shù)秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。圖形繪制由 Graphpad Prism 8.0 軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 當(dāng)歸雞血藤化裁方對OVX大鼠血清雌激素水平的影響

使用ELISA雙抗夾心法對經(jīng)12周治療后的3組大鼠進(jìn)行血清雌激素水平測定。如圖1示，與Sham組相比，OVX組大鼠體內(nèi)雌激素水平顯著降低(P<0.05)，與OVX組相比，OVX+T組大鼠雌激素水平升高(P<0.05)。

圖1 治療12周后大鼠血清雌激素水平結(jié)果Fig.1 Results of serum estrogen levels in rats after 12 weeks of treatment注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05。

2.2 當(dāng)歸雞血藤化裁方對OVX大鼠骨密度的影響

采用雙能X線檢測大鼠的右側(cè)股骨與腰椎的骨密度。如圖2所示，經(jīng)12周藥物干預(yù)后，與Sham相比，OVX大鼠的右側(cè)股骨和腰椎的總骨密度均顯著降低(P<0.05)。與OVX組相比，OVX+T的治療顯著增加了右側(cè)股骨和腰椎總骨密度(P<0.05)，但低于Sham組的水平。

圖2 治療12周后大鼠股骨(A)及腰椎(B)X線掃描結(jié)果Fig.2 X-ray scan results the femur (A) and lumbar (B) in rats after 12 weeks of treatment注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，##P<0.01。

2.3 當(dāng)歸雞血藤化裁方對OVX大鼠骨組織形態(tài)的影響

三組大鼠股骨HE切片見圖3，與Sham組相比，OVX組大鼠骨小梁數(shù)量明顯降低，部分區(qū)域出現(xiàn)骨小梁斷裂等骨質(zhì)疏松的現(xiàn)象；經(jīng)12周藥物干預(yù)后，與OVX組相比，OVX+T組骨小梁連接的致密程度、骨小梁數(shù)量明顯升高。

圖3 治療12周后大鼠股骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE，×40)Fig.3 Morphological structure of the femur in rats after 12 weeks of treatment (HE, ×40)注：A：假手術(shù)組 B：模型組 C：治療組

2.4 當(dāng)歸雞血藤化裁方對OVX大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響

采用可見光比色法和ELISA雙抗夾心法分別測定血清中ALP、CTX-1、TRAcP-5b的含量或活性。如圖4所示，OVX組大鼠的血清CTX-1含量及TRAcP-5b、ALP活性均高于Sham組(P<0.05)，但低于OVX+T組水平(P<0.05)。

圖4 治療12周后大鼠血清ALP、CTX-1、TRAcP-5b活性結(jié)果Fig.4 Results of serum ALP, CTX-1, TRAcP-5b activity in rats after 12 weeks of treatment注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.5 當(dāng)歸雞血藤化裁方對OVX大鼠骨組織中RANKL/RANK/OPG與ERK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

用蛋白質(zhì)印跡法測定大鼠股骨中RANKL、RANK、OPG、ERK的表達(dá)水平。如圖5所示，與Sham組相比，OVX組大鼠OPG、ERK表達(dá)水平顯著降低，而RANKL、RANK、RANKL/OPG的比率顯著升高(P<0.05)。經(jīng)過藥物12周干預(yù)后，OPG、ERK表達(dá)水平顯著升高，而RANKL、RANK、RANKL/OPG的比率均顯著降低(P<0.05)。

圖5 治療12周大鼠Western blot蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.5 Western blotting results of protein expression in rats after 12 weeks of treatment注：A：假手術(shù)組，B：模型組，C：治療組。與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3 討論

當(dāng)歸雞血藤湯出自《中醫(yī)傷科學(xué)》，臨床主要用于骨傷患者氣血虛弱，白細(xì)胞或血小板減少癥等。已有研究表明當(dāng)歸雞血藤湯對肩周炎和跟痛癥有較好地改善作用[8-9]，但缺乏對骨質(zhì)疏松療效的案例報道。針對骨質(zhì)疏松患者多虛多瘀的病理特點[10]，本研究結(jié)合當(dāng)歸雞血藤湯配伍思路及現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究成果，選用當(dāng)歸、雞血藤、威靈仙、荊芥、羌活、川芎、秦艽7種中藥，組成具有養(yǎng)血活血，祛風(fēng)除濕止痹功效的當(dāng)歸雞血藤化裁方，旨在舒筋活絡(luò)，強健筋骨，改善骨質(zhì)疏松的癥狀。

在本實驗中，雙側(cè)卵巢切除術(shù)引起的雌激素缺乏顯著降低了骨密度、破壞了骨微組織結(jié)構(gòu)(圖2、3)。經(jīng)過此方12周的治療，模型大鼠血清雌二醇水平上升，骨密度、骨量及骨微組織均得到明顯改善，提示此方在保護(hù)模型大鼠骨丟失方面發(fā)揮了與雌激素類似的治療作用(圖1)?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證明，當(dāng)歸提取物(1%藁本內(nèi)酯)對去卵巢大鼠和完整大鼠均具有類雌激素作用[11]；雞血藤主要的活性成分黃酮類化合物與雌激素結(jié)構(gòu)類似[12]；秦艽-威靈仙主要活性成分與ESR1靶點的關(guān)系十分密切，而ESR1是雌激素受體主要類型之一，提示秦艽-威靈仙有調(diào)節(jié)雌激素的作用[13]；川芎成分的中心靶點NCOA1介導(dǎo)了雌激素信號通路[14]。這些藥物可能是此方發(fā)揮類雌激素作用保護(hù)骨量的物質(zhì)基礎(chǔ)。

OPG是一種破骨細(xì)胞生成抑制因子，通過與RANKL競爭性的結(jié)合抑制骨吸收。RANKL/OPG的比率是評價破骨細(xì)胞分化與吸收程度的重要指標(biāo)[15]。機制研究證明，低水平的雌激素抑制OPG的合成[16-18]，促進(jìn)RANKL與破骨細(xì)胞上的受體RANK結(jié)合，激活信號通路并誘導(dǎo)RANKL高表達(dá)[19]，繼而增強破骨細(xì)胞上抗酒石酸酸性磷酸酶活性并大量降解依附在骨細(xì)胞上的I型前膠原肽[20-21]，導(dǎo)致血清中TRAcP-5b 及CTX-1的活性水平升高。本實驗也證實雌激素的缺乏上調(diào)了RANKL/OPG比率及血清TRAcP-5b 、CTX-1的水平，提示雌激素通過RANKL/OPG調(diào)控破骨細(xì)胞形成與功能。相比之下，當(dāng)歸雞血藤化裁方能增加OPG的合成并抑制RANKL-RANK的表達(dá)(圖5)，改善TRAcP-5b 、CTX-1等骨吸收指標(biāo)(圖4)。

本實驗發(fā)現(xiàn)該方上調(diào)OPG表達(dá)的同時可以降低ALP的活性，提示該方劑對成骨的有益作用。MAPK是二級信使家族，可響應(yīng)各種刺激將信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核內(nèi)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖、凋亡等多種生理功能。其中，ERK/MAPK信號通路在驅(qū)動MSCs像成骨細(xì)胞譜的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要的作用。據(jù)報道，ERK信號通路可以激活成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(RUNX2)和 Osterix (OSX)[22-23]。ERK通路的失活會導(dǎo)致骨量嚴(yán)重地丟失和顱骨的發(fā)育不全[24]。一項最新的研究也發(fā)現(xiàn)有規(guī)律的ERK活性波可以控制成骨細(xì)胞的再生[25]。雌激素可以通過膜內(nèi)的雌激素受體(ER)快速起作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路迅速激活，進(jìn)而以配體非依賴性方式激活生長因子受體，延長成骨細(xì)胞存活時間并促進(jìn)其分化[26-27]。此外，植物性雌激素與成骨細(xì)胞膜上的ER相結(jié)合后也可以達(dá)到類似的效果[28-29]。與之前的報道一致，當(dāng)歸雞血藤化裁方可以正向調(diào)控模型大鼠股骨中ERK蛋白的表達(dá)水平，提示此方可以通過激活ERK/MAPK通路，增強成骨細(xì)胞的活性，降低骨量流失的風(fēng)險。

4 結(jié)論

當(dāng)歸雞血藤化裁方發(fā)揮類雌激素的作用抑制骨的高轉(zhuǎn)化率，通過OPG/RANKL/RANK信號通路來促進(jìn)骨形成并抑制骨吸收，進(jìn)而來防治由雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥。該方對成骨的積極作用還可能與激活ERK通路有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)擴展并補充了許多現(xiàn)有信息，有助于中藥的發(fā)掘并在臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供一種全新的思路。