超聲波處理快速石蠟制片在供腎零點活檢病理診斷中的應(yīng)用與比較

魏 雪，章如松，李 穎，馮翠云，張明超，夏秋媛，饒 秋，馬恒輝

活體供腎移植是終末期腎臟病(end-stage renal disease, ESRD)患者理想的治療手段。雖然活體供者在術(shù)前已按照相應(yīng)標準進行充分的臨床評估[1]，但在實際工作中仍然發(fā)現(xiàn)部分供者的腎存在不同程度的病理改變[2-3]，并且其病變程度與術(shù)后移植腎的腎功能恢復存在差異。供腎零點活檢(time-zero renal biopsy, TO-RBx)為供腎的取舍、分配及術(shù)后移植腎腎功能預后的判斷等，提供重要的組織病理學依據(jù)，是術(shù)前評估供腎質(zhì)量的重要手段[3]。為盡可能減少移植器官缺血時間、保證移植效果，快速病理診斷的意義重大。快速冷凍切片雖然制片時間短，但組織結(jié)構(gòu)及細胞形態(tài)清晰程度一般，易出現(xiàn)人為假象，無法為切片質(zhì)量良好提供穩(wěn)定性。本科室在實際工作中反復摸索和實踐，利用HT-3超聲波快速組織處理儀對常規(guī)手工快速石蠟制片方法加以改進，效果良好，現(xiàn)將這兩種技術(shù)方法的應(yīng)用與比較介紹如下。

1 材料與方法

1.1 組織標本隨機選取2019年1月～2020年12月東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院國家腎臟疾病臨床醫(yī)學研究中心存檔的30例TO-RBx標本，供者入選標準為自愿捐獻者，未見明顯捐獻禁忌證。其中男性13例，女性17例，平均年齡(45.87±6.93)歲。本實驗獲我院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1腎穿刺 TO-RBx標本經(jīng)術(shù)前供腎獲取，常規(guī)灌洗，修整完畢后進行，用16 G活組織檢查針在供腎下極負壓穿刺，獲取長0.5～1.0 cm，直徑1 mm的腎組織1～2條，置于生理鹽水紗布，立即送檢。穿刺組織定位皮質(zhì)，以皮質(zhì)、髓質(zhì)交界區(qū)為分界線，將皮質(zhì)區(qū)2/3長度定義為取材切割點，2/3皮質(zhì)區(qū)作為實驗組用于制備超聲波處理快速石蠟切片；近髓質(zhì)1/3皮質(zhì)區(qū)與髓質(zhì)區(qū)共同作為對照組，用于制備手工快速石蠟切片。本組設(shè)定實驗組與對照組的依據(jù)：TO-RBx的主要觀察對象是腎小球及腎小管間質(zhì)病變。

1.2.2超聲波處理快速石蠟制片 (1)將腎組織浸泡于HT-3病理分析前處理專用試劑，開啟超聲波快速組織處理儀，加熱至55 ℃，處理2次，各15 min。(2)將組織(置于塑料包埋盒內(nèi))轉(zhuǎn)入加熱至62 ℃石蠟缸內(nèi)，開啟超聲波處理，浸蠟15 min。(3)石蠟包埋制成蠟塊，切取2 μm厚切片脫蠟水洗，分別行HE、PAS、PASM和Masson染色，封固，具體實驗方法參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范·病理學分冊》進行[4]。

1.2.3手工快速石蠟制片 (1)將腎組織浸泡于10%中性福爾馬林中固定10 min。(2)梯度乙醇脫水：75%乙醇20 min，90%乙醇20 min，95%乙醇10 min，100%乙醇20 min。(3)用擦鏡紙將組織包好后，放入氯仿Ⅰ 10 min、氯仿Ⅱ 10 min。(4)石蠟Ⅰ 30 min，石蠟Ⅱ 30 min。(5)石蠟包埋制成蠟塊，切取2 μm厚切片脫蠟水洗，分別行HE、PAS、PASM和Masson染色[5]，封固。

1.3 結(jié)果判斷切片均由兩名副主任以上醫(yī)師采用雙盲法閱片，依次在顯微鏡下觀察腎小球、腎小管、間質(zhì)及血管等成分的變化并進行評估。標本以顯微鏡下見腎小球數(shù)>7個，至少存在2條動脈，為活檢合格標本[5]。

2 結(jié)果

2.1 HE染色實驗組與對照組切片組織結(jié)構(gòu)均完整、細胞形態(tài)良好、層次分明，切片厚度均勻、平坦無折、無脫片。細胞核與細胞質(zhì)染色對比清晰，色彩鮮艷、透亮、組織變性程度較輕(圖1)。

2.2 特殊染色實驗組與對照組切片均能夠準確顯示腎小球系膜、基膜等各種形態(tài)改變，多種組織成分對比鮮明。PAS染色示細胞核呈藍色，細胞質(zhì)、基膜及系膜基質(zhì)呈玫紅色(圖2)。PASM染色示細胞核呈藍色，基膜及系膜基質(zhì)呈黑色，免疫復合物呈紅色(圖3)。Masson染色示細胞核呈黑色，基膜及膠原纖維呈藍綠色，纖維蛋白、免疫復合物(類纖維素)呈桔紅色(圖4)。

2.3 超聲波處理快速石蠟制片實驗組診斷結(jié)果：腎小球輕微病變10例(33.3%)，腎小球節(jié)段性硬化8例(26.7%)，腎小管急性損傷30例(100%)，腎小管萎縮(明確等級，輕～重)3例(10%)，血管玻璃樣變及硬化1例(3.3%)，間質(zhì)纖維化(明確等級，輕～重)1例(3.3%)，間質(zhì)炎癥(明確等級，輕～重)1例(3.3%)。

圖1 實驗組(A)、對照組(B)的組織結(jié)構(gòu)均清晰、細胞形態(tài)完整、色彩明艷、背景干凈，HE染色 圖2 實驗組(A)、對照組(B)基膜、腎小管基膜及系膜基質(zhì)均呈粉紅色，PAS染色 圖3 實驗組(A)、對照組(B)基膜、腎小管基膜均呈黑色，PASM染色 圖4 實驗組(A)、對照組(B)基膜均呈綠色，Masson染色

2.4 手工快速石蠟制片對照組診斷結(jié)果：腎小球輕微病變6例(20%)，腎小球節(jié)段性硬化5例(16.7%)，腎小管急性損傷28例(93.3%)，腎小管萎縮(明確等級、輕～重)3例(10%)，血管玻璃樣變及硬化1例(3.3%)，間質(zhì)纖維化(明確等級，輕～重)1例(3.3%)，間質(zhì)炎癥(明確等級、輕～重)1例(3.3%)。

2.5 實驗組與對照組對比分析實驗組與對照組診斷結(jié)果為腎小球輕微病變的符合率為86.7%(26/30)，腎小球節(jié)段性硬化的符合率為90%(27/30)，腎小管急性損傷的符合率為93.3%(28/30)；腎小管萎縮、血管玻璃樣變及硬化、間質(zhì)纖維化及間質(zhì)炎的符合率均高達100%(30/30)。兩種制片方法腎穿刺組織中差異主要表現(xiàn)為腎小球病變的判讀，實驗組腎小球血管襻開放及系膜僵硬更多見。兩種制片方法見腎小管上皮細胞隨缺血時間的延長，其損傷程度也相應(yīng)加重，兩者差異無顯著性。

3 討論

為盡可能減少移植器官冷缺血時間，以防加重腎缺血再灌注的損傷，故對供腎TO-RBx的制片速度及質(zhì)量要求非常嚴格。直接冷凍制片法制片時間較短，但制片質(zhì)量不能提供良好的穩(wěn)定性，故有可能影響病理診斷結(jié)果的判讀。手工快速石蠟制片法病理診斷結(jié)果相對準確，但制片時間較長(約3 h)。超聲波處理快速石蠟制片法，鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)清晰，細胞形態(tài)完整，無明顯的收縮現(xiàn)象；具有較高的制片時效性和穩(wěn)定性，耗時僅約50 min。

本實驗發(fā)現(xiàn)超聲波處理快速石蠟制片診斷與手工快速石蠟制片診斷結(jié)果基本相符。超聲波處理快速石蠟制片組織處理試劑的快速替代過程時間較短，易導致試劑替換不徹底，與手工快速石蠟制片相比，其更易表現(xiàn)為腎小球血管襻開放及系膜僵硬。無論采用何種制片方法，腎小管的形態(tài)學改變都是客觀存在的，因為供腎缺血導致腎小管急性損傷難以避免，會對診斷結(jié)果的準確性造成干擾，但多數(shù)情況下這些差異不明顯，且這些干擾因素也不是供腎移植取舍的決定因素[6]。

本科室已將超聲波處理快速石蠟制片技術(shù)應(yīng)用于胃腸鏡及穿刺類活檢組織標本，其制片質(zhì)量與常規(guī)石蠟切片質(zhì)量差異較小，符合病理診斷的要求。其制作的切片應(yīng)用于免疫組化檢測組織內(nèi)多種抗原，特異性高；其應(yīng)用于分子生物學檢測，能較好地反應(yīng)核酸和蛋白。初步明確超聲波處理快速石蠟制片方法，可以制備高質(zhì)量的胃腸鏡及穿刺活檢組織蠟塊，免疫組化及基因檢測與常規(guī)石蠟切片處理方法結(jié)果一致。目前，超聲波處理快速石蠟制片技術(shù)已常規(guī)應(yīng)用于胃腸道及穿刺類活檢組織，而應(yīng)用于制備其它不同類型活檢組織及手術(shù)切除標本還在不斷探索和創(chuàng)新中，具體的組織處理程序及時間還需進一步實驗證實。

目前，國內(nèi)鮮有報道超聲波處理快速石蠟制片技術(shù)應(yīng)用于供腎TO-RBx的可行性研究。本實驗發(fā)現(xiàn)超聲波處理快速石蠟制片與手工快速石蠟制片HE染色及特殊染色結(jié)果一致，可應(yīng)用于臨床腎臟病理診斷，與何昌桓等[7]報道一致。HT-3超聲波快速石蠟制片在現(xiàn)有的技術(shù)上進行改進，其使用的病理分析前處理專用試劑是集固定、脫水和透明三種作用于一體，是以乙醇為主并加入多種生物組織保護劑的環(huán)保型混合試劑，不含甲醛、二甲苯等物質(zhì)，對人體無毒、無害，整個組織處理的過程只需重復使用混合試劑2次。其主要原理是利用超聲波強大的穿透性及非電離性作用，增加細胞的滲透性和溶劑分子的穿透力，增加試劑與組織間液體的擴散、滲透和交換的頻率，從而縮短制片時間。處理的組織結(jié)構(gòu)清晰、核質(zhì)對比清楚、背景干凈；制片效果與手工快速石蠟制片接近，無明顯差異，且可以長期保存，未見明顯理化形態(tài)改變，達到優(yōu)質(zhì)HE切片的制片要求[4]。本科室后期將進一步分析比較超聲波處理快速石蠟制片所制備的腎組織蠟塊，其免疫組化以及基因檢測結(jié)果，與手工快速石蠟制片結(jié)果的符合率。