施氮量及基追比對烤煙碳代謝產(chǎn)物及關(guān)鍵酶的影響

陳發(fā)元，胡 錦，周俊成，彭三喜，張 恒，朱 迪，李金星，郭亞利

(1.貴州煙草公司黔西南州公司，貴州 興義 562400；2.貴州大學(xué) 煙草學(xué)院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴陽 550025)

【研究意義】氮素是烤煙生長過程中需求量最大的礦質(zhì)營養(yǎng)元素[1]，對烤煙生長、內(nèi)部生理過程、煙葉成熟及品質(zhì)形成有較大影響[2]。碳代謝是煙株最基礎(chǔ)的代謝過程之一，與決定煙葉品質(zhì)有關(guān)的化學(xué)成分的組成、含量和比例有密切關(guān)系[3]。氮肥施用技術(shù)對煙葉質(zhì)量形成至關(guān)重要，適宜的氮肥用量和基追比不但能合理地調(diào)控?zé)熤甑臓I養(yǎng)狀況，提高煙葉產(chǎn)量，而且能改善煙葉質(zhì)量，提高煙葉的利用價值[4-5]。因此，研究不同施氮量及基追比條件下烤煙碳代謝產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活性，對合理施用氮肥、提高煙葉品質(zhì)和產(chǎn)質(zhì)量具有重要的實際指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M展】高琴等[6]研究表明，在煙葉生長發(fā)育過程中，隨著施氮量的增加，煙葉中總糖和還原糖含量呈持續(xù)降低趨勢。施氮量對碳代謝關(guān)鍵酶淀粉酶和蔗糖磷酸合成酶活力的影響均達顯著水平[7]。陳良存[8]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化酶活性隨追氮量的增加有所提高。葛國鋒等[9]研究認為，對于同一烤煙品種，施氮會增加蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶的活性。【本研究切入點】目前，研究者大多關(guān)注氮肥供應(yīng)水平對烤煙碳代謝關(guān)鍵酶活性影響的研究，而對施氮量及基追比的合理分配對煙葉碳代謝產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活性在煙葉成熟過程中的變化規(guī)律研究較少，而且還缺乏施氮量及基追比中碳代謝產(chǎn)物與酶活性的相關(guān)關(guān)系研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過田間試驗，研究不同施氮量及基追比對烤煙碳代謝產(chǎn)物及關(guān)鍵酶活性的影響，以期為合理施用氮肥、提高煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為當(dāng)?shù)刂髟云贩N云煙87。供試肥料為煙草專用復(fù)合肥，購自貴州科泰金福肥業(yè)有限公司，總養(yǎng)分≥48%，其養(yǎng)分配比為m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=12%∶12%∶24%。

1.2 試驗地點

試驗于2020年在黔西南州安龍縣錢相鄉(xiāng)陳莊村板賴組進行，經(jīng)度105°48′15″，緯度25°18′09″，平均海拔高度1208 m，冬暖夏涼，雨量充沛，年平均溫度15～18 ℃，年降水量1000～1300 mm，年平均日照數(shù)1500 h左右，年無霜期270～280 d。煙田距離公路300 m以上，地勢平坦，排灌方便。土壤理化性質(zhì)：pH 6.28，有機質(zhì)32.28 g/kg，全氮2.17 g/kg，堿解氮0.043 g/kg，有效磷0.12 g/kg，速效鉀0.08 g/kg。

1.3 試驗方法

試驗采用施純氮量(A因素)和基肥和追肥施用比例(B因素)的兩因素隨機區(qū)組設(shè)計。在當(dāng)?shù)匾圃悦芏?1100株/667 m2)下，施純氮量(A因素)設(shè)3個水平：A1(6.25 kg/667 m2，比當(dāng)?shù)厥┑繙p少2 kg/667 m2)，A2(8.25 kg/667 m2，當(dāng)?shù)厥┑?，A3(10.25 kg/667 m2，當(dāng)?shù)厥┑炕A(chǔ)上增加2 kg/667 m2)?；屎妥贩适┯帽壤?B因素)設(shè)3個水平：B1(5∶5)；B2(6∶4);B3(7∶3)。

2020年2月按常規(guī)漂浮育苗法育苗，4月24日移栽。4月12日條施基肥，5月31日窩施追肥，每處理3次重復(fù)，共9個處理27個小區(qū)(表1)，小區(qū)隨機排列。小區(qū)行距1.1 m，株距0.58 m，每小區(qū)4行，每行15株。試驗地四周設(shè)置保護行，烤煙生產(chǎn)措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)烤煙栽培技術(shù)進行操作。

表1 不同施氮量及基追肥比兩因素試驗設(shè)計表Table 1 Two-factor experimental design for different nitrogen application amount and base topdressing ratio

1.4 測定項目與方法

1.4.1 化學(xué)成分 在煙株移栽后的團棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期、打頂期、腳葉成熟期對各處理進行取樣，每個處理選擇有代表性的煙株3株，進行整株采葉，然后分小區(qū)進行煙株標記，去掉主脈和葉基葉尖，105 ℃烘箱殺青15 min后，調(diào)整溫度到65 ℃直到樣品烘干。采用近紅外光譜法測定總糖和還原糖等碳代謝產(chǎn)物，測定儀器為Antaris II型傅立葉變換近紅外漫反射光譜儀(美國賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn))。

1.4.2 關(guān)鍵酶活性 在煙株移栽后的團棵期、旺長期、現(xiàn)蕾期、打頂期、腳葉成熟期進行取樣，每個處理選擇長勢一致的煙株，采集煙株中部葉片(相對位置為煙株中部)，在相同葉位每株僅取1次，選取9個單株為1次樣品采集，每3株混合為1個樣本，3次生物學(xué)重復(fù)，迅速置于液氮中，于-80 ℃冰箱凍存。由深圳子科生物科技公司提供的試劑盒測定碳代謝關(guān)鍵酶即蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖轉(zhuǎn)化酶(INV)、α-淀粉酶(α-amylase)、可溶性淀粉酶(SSS)、ADPG焦磷酸化酶(AGP)、果糖-1,6-二磷酸酯酶(FBPase)活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進行統(tǒng)計處理和制圖，利用SPSS 26進行方差分析，鄧肯法進行處理間差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮量及基追比處理烤煙葉片的碳代謝產(chǎn)物

由表2可知，除T6處理外，各處理煙葉中總糖和還原糖總量隨煙株的成熟呈先降后升再降的趨勢，整體則呈下降的趨勢。團棵期總糖和還原糖總量以CK1最高，為29.51%，比最低的T6(16.31%)高80.93%；旺長期、現(xiàn)蕾期和打頂期，煙葉中總糖和還原糖總量均以T3最高，分別為23.27%、26.31%和18.06%；最低則是CK1(9.10%)、T6(14.02%)和T5(13.45%)；腳葉成熟期總糖和還原糖總量以T6最高，CK2最低。與團棵期的低氮、常規(guī)氮和高氮處理相比，腳葉成熟期的低氮、常規(guī)氮和高氮處理煙葉總糖含量分別降低11.26、18.3和1.64百分點，還原糖含量分別降低11.52、18.31和4.66百分點。

表2 不同施氮量及基追比烤煙葉片的總糖和還原糖含量Table 2 Contents of total sugar and reducing sugar in flue-cured tobacco leaves with different nitrogen application amount and base topdressing ratio(%)

2.2 不同施氮量及基追比處理烤煙的關(guān)鍵酶活性

2.2.1 SS活性 SS活性大多存在于細胞質(zhì)中，其主要功能是分解蔗糖，為纖維素的合成提供底物[10]。由表3可知，各處理煙葉SS活性從團棵期至腳葉成熟期整體呈上升趨勢。在團棵期至旺長期，各處理煙葉 SS活性差異不顯著，現(xiàn)蕾期、打頂期和腳葉成熟期各處理間則存在一定的差異性?，F(xiàn)蕾期SS活性以T1的最高，除與T2間差異不顯著外，均顯著高于其余處理；其次是T2和T6，顯著高于剩余處理；T5、T3和T4的酶活性水平均較低，和其他處理之間酶活力差異顯著。打頂期至腳葉成熟期SS活性均以T2最高，其次是T1和T6，T4最低，與其他處理之間的差異顯著。

表3 不同施氮量及基追比烤煙葉片的煙葉的SS活性 Table 3 Effects of nitrogen application and base topdressing ratio on SS activity of flue-cured tobacco (U/g)

2.2.2 INV活性 INV對碳水化合物的形成有著關(guān)鍵調(diào)控作用，其活性可作為反映煙草碳代謝強弱的重要指標[11]。由表4可知，在團棵期至旺長期，煙葉中INV活性處于較低水平，且各處理間的酶活性差異不顯著；隨著葉片的生長，INV活性迅速升高，在現(xiàn)蕾期達最大值，之后逐漸下降。現(xiàn)蕾期INV活性以T2最高，除T4外，與其他處理間酶活力差異達顯著水平，與酶活力最低的CK1相比，INV活力增加50.79%；打頂期至腳葉成熟期INV活性仍以T2最高，其次是T1，兩處理間無顯著差異，與其他處理間差異均達顯著水平。

表4 不同施氮量及基追比烤煙INV的活性Table 4 Effects of nitrogen application and base topdressing ratio on INV activity of flue-cured tobacco (U/g)

2.2.3 α-amylase活性 α-amylase是參與淀粉分解代謝的關(guān)鍵酶之一，其主要分解淀粉中的α-1,4-糖苷鍵，得到葡萄糖、麥芽糖等糖類物質(zhì)[12]。由表5看出，團棵期至旺長期煙葉中α-amylase活性各處理間差異不顯著，以CK3、CK2和CK1的活性較高；現(xiàn)蕾期至腳葉成熟期以CK3的酶活性最高，現(xiàn)蕾期CK3與CK2的酶活力差異不顯著；在打頂期至腳葉成熟期CK3與CK2、CK1、T2和T5的酶活性差異不顯著，與其他處理的酶活力差異均達顯著水平。

表5 不同施氮量及基追比煙葉的α-amylase活性Table 5 Effects of nitrogen application and base topdressing ratio on α-amylase activity of flue-cured tobacco (U/g)

2.2.4 SPS活性 SPS是蔗糖合成的關(guān)鍵酶，其活性的高低等同于葉片光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為蔗糖能力的強弱[13]。由表6可知，煙葉中SPS活性整體隨著移栽時間的增加呈先增加后減少再增加的趨勢。團棵期，CK2的SPS酶活性最高，其次是CK1和CK3，T2的最低，與其他處理間的差異均不顯著。煙葉中SPS活性在烤煙旺長期達最大值，酶活性排順序為CK1>CK2>CK3>T5>T1>T4>T6>T3>T2?，F(xiàn)蕾期SPS活性降低，以T1的最高，為25.00 U/g，與其他處理間差異均顯著。打頂期至腳葉成熟期酶活力以T2最高，T3、T4、CK3的較低，與其他處理間的差異均顯著。

表6 不同施氮量及基追比煙葉的SPS活性Table 6 Effects of nitrogen application and base topdressing ratio on SPS activity of flue-cured tobacco (U/g)

2.2.5 SSS活性 SSS與支鏈淀粉形成有關(guān)，因此其參與淀粉合成且能影響淀粉結(jié)構(gòu)[14]。由表7可知，隨著烤煙生育進程的增加，煙葉的SSS活性整體呈“V”型的變化趨勢。在團棵期至旺長期期間內(nèi)，各處理間的酶活性差異不顯著?，F(xiàn)蕾期至腳葉成熟期以T4的SSS活性較高，T6最低，與其他處理間差異顯著，T4與T6相比，現(xiàn)蕾期增加56.54%、打頂期增加58.17%、腳葉成熟期增加56.75%。

表7 不同施氮量及基追比煙葉的SSS活性Table 7 Effects of nitrogen application and base topdressing ratio on SSS activity of flue-cured tobacco (U/g)

2.2.6 AGP活性 AGP參與淀粉合成代謝，可以調(diào)節(jié)淀粉合成的快慢[15]。由表8可知，煙葉中AGP活性在移栽后的各時期整體呈先增加再減少趨勢。團棵期不同處理間有較明顯的梯度，第1梯度為T1、T2和T3的AGP酶活性最高；第2梯度為CK1、CK2和CK3，AGP酶活性居中；第3梯度為T4、T5和T6，AGP酶活性最低；每個梯度的3個處理間酶活性差異均不顯著，各梯度間酶活力差異顯著。旺長期仍然是3個梯度，但其間的差距逐漸縮小，其酶活力大小順序為T3>T2>T1>CK3>CK2>CK1>T5>T4>T6?，F(xiàn)蕾期至腳葉成熟期以T2的最高，其次是T3，與其他處理間酶活性差異顯著。

表8 不同施氮量及基追比煙葉的AGP活性Table 8 Effects of nitrogen application and base topdressing ratio on AGP activity of flue-cured tobacco (U/g)

2.2.7 FBPase活性 FBPase是植物卡爾文循環(huán)中有調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶，可催化1,6-二磷酸果糖和水生成6-磷酸果糖和無機磷，在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起重要作用[16]。由表9可知，隨移栽后煙株的持續(xù)生長，煙葉中FBPase活性整體呈先上升后下降趨勢。團棵期至旺長期各處理間酶活性差異不顯著，以T1、T2和T3的酶活性較高?，F(xiàn)蕾期酶活性以CK1最高，其次是T6和T5，T2的酶活力最低，各處理間酶活性存在一定的差異顯著性，CK1與T2相比增加95.24%。打頂期至腳葉成熟期酶活性以CK1的最高，其次是T5和T6，T2最低，與其他處理間酶活性差異均顯著。

表9 不同施氮量及基追比煙葉的FBPase活性Table 9 Effects of nitrogen application and base topdressing ratio on FBPase activity of flue-cured tobacco (U/g)

2.3 施氮量及基追比煙葉碳代謝產(chǎn)物與關(guān)鍵酶活性的相關(guān)性

由表10可知，團棵期間，煙葉中的還原糖含量與INV、SSS和FBPase活性呈負相關(guān)，總糖含量與SSS活性呈顯著負相關(guān)，與INV、FBPase活性呈負相關(guān)。旺長期煙葉中還原糖和總糖含量均與AGP、α-amylase、SPS和FBPase活性呈負相關(guān)?，F(xiàn)蕾期煙葉中還原糖和總糖含量均與SS、AGP、α-amylase和SPS活性呈負相關(guān)。打頂期煙葉中還原糖含量與α-amylase、SSS和FBPase活性呈負相關(guān)，總糖含量與α-amylase活性呈負相關(guān)。腳葉成熟期煙葉還原糖和總糖含量均與AGP、α-amylase和SSS活性呈負相關(guān)關(guān)系。煙葉中α-amylase活性在團棵期與還原糖和總糖含量呈正相關(guān)，其余時期則均呈負相關(guān)。

表10 不同施氮量及基追比煙葉碳代謝產(chǎn)物與關(guān)鍵酶活性的相關(guān)性Table 10 Correlations between carbon metabolites and key enzyme activities in tobacco leaves with different nitrogen application amount and base topdressing ratio

3 討 論

碳代謝強度與決定煙葉品質(zhì)、香氣質(zhì)等有關(guān)的化學(xué)成分的組成、含量、比例有密切關(guān)系[17]。煙葉中總糖和還原糖的含量是衡量煙葉內(nèi)在品質(zhì)的重要指標[18]。本研究中隨煙葉的成熟，總糖和還原糖含量整體在團棵期最高，隨后下降，現(xiàn)蕾期開始緩慢上升，打頂期至腳葉成熟期又緩慢下降，這與楊煥文等[19]研究的移栽后煙葉中總糖和還原糖含量隨煙株的不斷成熟呈先增加后減少的趨勢并不一致，原因可能是本試驗中煙株在團棵期時的基肥滿足其生長所需營養(yǎng)，碳的分解代謝較旺盛，合成代謝也相對活躍，后期總糖和還原糖含量下降則是煙葉以合成淀粉為主，煙株趨于成熟狀態(tài)。凡聰?shù)萚20-21]研究表明，總糖和還原糖含量隨氮用量的增加呈降低趨勢，這與本試驗結(jié)果一致。李洪臣等[22]在對氮肥施用量和施用方式對煙草中部葉碳氮代謝的影響研究認為，在同一施氮量條件下葉片總糖含量并不隨氮肥追施比例的增加而增加[22]；在本試驗中，施氮量相同的條件下，低氮和常規(guī)氮處理中隨著追氮比例的增大，煙葉中總糖和還原糖含量整體較低，高氮處理中則是追氮比例減少時，煙葉中總糖和還原糖含量整體較高。這可能是因為高氮處理增強了中后期煙草葉片碳水化合物的代謝，有利于葉片總糖和還原糖的積累。

酶作為煙草體內(nèi)進行各種生物化學(xué)反應(yīng)的最重要物質(zhì)，催化煙草體內(nèi)各種生理生化代謝過程的進行[23]?？緹熢诓煌L階段的碳代謝關(guān)鍵酶具有不同的變化趨勢[24]，如在煙葉發(fā)育過程中INV活性達到最大值后明顯下降[25-26]；α-amylase活性在移栽后迅速升高至移栽后40 d左右達最大，之后呈較快速度下降，在移栽后60 d至成熟逐漸穩(wěn)定[27]；煙葉中SS活性呈先下降后升高的趨勢，SPS、AGP、SSS活性呈先上升再下降的趨勢[28-29]。本研究結(jié)果表明，隨著煙株大田生育期的推進，煙葉中INV、SS、α-amylase、AGP、FBPase活性呈單峰曲線，SPS活性呈雙峰波動的變化趨勢，SSS活性呈先下降后升高再下降的趨勢。李國輝等[30]研究表明，SPS活性與施氮量呈負相關(guān)；葛國鋒等[9,19]研究表明，SS、INV活性隨施氮量的增加呈逐漸增加的趨勢； 潘飛龍等[29]研究表明，α-amylase活性在打頂后呈不斷下降的趨勢，SSS在打頂后呈逐漸增加趨勢。本研究表明，隨施氮量的增加，煙葉中SS活性整體呈不斷下降的趨勢，INV、SSS、FBPase活性整體呈先下降后升高的趨勢，α-amylase、SPS、AGP活性整體呈先升高后下降的趨勢。

在相同施氮量的條件下，高氮處理中煙葉的SS活性隨著追氮比例的增大而下降，低氮和常規(guī)氮在打頂后基追比為6∶4更好。在團棵期至旺長期，高氮和低氮處理中煙葉的INV活性在基追比為7∶3時較高，常規(guī)氮則為5∶5；常規(guī)氮和高氮處理中煙葉的α-amylase活性在基追比為6∶4更高?，F(xiàn)蕾期至腳葉成熟期間，低氮和常規(guī)氮處理中煙葉的INV活性均是基追比為6∶4時更好，高氮處理則為5∶5；低氮和高氮處理中煙葉的α-amylase活性在基追比為6∶4效果更好，常規(guī)氮中則是7∶3；低氮和高氮處理中煙葉的SSS活性在基追比分別為7∶3、5∶5時效果更好；低氮和高氮處理中煙葉的AGP活性在基追比為7∶3時更高，常規(guī)氮中則是6∶4；低氮和常規(guī)氮處理中煙葉的FBPase活性均是基追比為5∶5時更好，高氮處理則為6∶4。常規(guī)氮和高氮處理中煙葉的SPS活性在旺長期至腳葉成熟期間基追比分別為5∶5、6∶4時較好。

由施氮量及基追比對烤煙煙葉中總糖和還原糖含量與碳代謝關(guān)鍵酶相關(guān)分析結(jié)果可知，在團棵期至腳葉成熟期間，煙葉中SS、INV、AGP、SSS、SPS、FBPase、α-amylase活性都與還原糖和總糖含量呈負相關(guān)，但相關(guān)性都未達到顯著水平，表明這些碳代謝關(guān)鍵酶對煙葉中還原糖和總糖含量影響不大。煙葉中的總糖含量在團棵期與SSS活性呈顯著負相關(guān)，說明總糖在團棵期的變化與碳代謝關(guān)鍵酶有一定的關(guān)聯(lián)性。

4 結(jié) 論

隨著煙葉的成熟，煙葉中總糖和還原糖含量呈先下降后上升又下降的趨勢，且隨著氮用量的增加呈降低趨勢。煙葉中INV、SS、α-amylase、AGP、FBPase活性隨著煙株大田生育期的推進呈單峰曲線，SPS活性呈雙峰波動的變化趨勢，SSS活性呈先下降后升高再下降的趨勢。隨施氮量的增加，煙葉中SS活性整體呈不斷下降的趨勢，INV、SSS、FBPase活性整體呈先下降后升高的趨勢，α-amylase、SPS、AGP活性整體呈先升高后下降的趨勢。在施氮量相同的條件下，低氮和常規(guī)氮處理中隨著追氮比例的增大，煙葉中總糖和還原糖含量整體較高，高氮處理則較低。綜上，黔西南州安龍縣在施氮量為6 kg/667 m2，基追比為6∶4時，各時期碳代謝產(chǎn)物含量及關(guān)鍵酶活性較為適宜，有利于煙碳代謝相關(guān)物質(zhì)積累。