長江口咸淡水混合水域腐蝕性細(xì)菌的篩選及其對文物的腐蝕作用

葉天韻，黃 靜，蔣雪中，趙 犖，翟 楊

(1． 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200241； 2． 華東師范大學(xué)城市與區(qū)域科學(xué)學(xué)院，上海 200241； 3． 上海市文物保護研究中心，上海 200031)

0 引 言

隨著海洋資源的進一步開發(fā)，人們開始關(guān)注海泥的腐蝕性以及材料在海泥環(huán)境中的使用性能[1]。海泥實際是飽和了海水的土壤，它是一種比較復(fù)雜的腐蝕環(huán)境。已有研究表明，海泥中存在如硫酸鹽還原菌這樣的菌，會對鋼材造成嚴(yán)重的腐蝕[2]。除了深海咸水泥的腐蝕研究，淡水中也發(fā)現(xiàn)當(dāng)金屬表面存在微生物或堆積含有硫酸鹽還原菌的泥沙時，由于硫氧化菌能氧化元素硫、硫代硫酸鹽等產(chǎn)生代謝產(chǎn)物硫酸，在金屬局部區(qū)域分泌出無機酸或者有機酸，從而加速了鋼鐵的腐蝕破壞[3-5]。目前，關(guān)于咸淡水混合水域的腐蝕性細(xì)菌研究鮮有報道。

微生物腐蝕(Microbiologically Influenced Corrosion，簡稱MIC)是指金屬或非金屬表面因微生物的生命活動而受到的腐蝕破壞[6]，MIC是生物電化學(xué)過程，比非生物腐蝕過程更為特殊和復(fù)雜[7]。海洋中的微生物接觸到材料表面，分泌出胞外多糖與表面黏附的有機物、無機物發(fā)生反應(yīng)，從而形成胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)，細(xì)菌與EPS一起附著于材料表面，形成生物膜，這層膜由各種細(xì)菌和微藻類以及它們的代謝產(chǎn)物組成，是發(fā)生微生物腐蝕的先決條件[8]。生物膜為微生物提供了一個微生態(tài)環(huán)境，生物膜內(nèi)的固著細(xì)胞代謝活動旺盛，細(xì)胞數(shù)量比浮游細(xì)胞高出5～6個數(shù)量級[9]。在微生物的作用下，生物膜與材料界面的pH值、溶解氧、離子濃度與有機物含量等會發(fā)生明顯改變，進而對材料的界面狀態(tài)和腐蝕過程產(chǎn)生影響[10]。

長期以來，多數(shù)微生物腐蝕研究都集中于硫酸鹽還原菌，目前有關(guān)硫酸鹽還原菌致腐蝕作用的機理有：陰極去極化機理、濃差電池機理、局部電池機理、代謝產(chǎn)物機理、沉積物下的酸腐蝕機理、陽極區(qū)固定機理等[11-14]。但自然界中微生物種類繁多，近十幾年的研究則表明細(xì)菌如鐵細(xì)菌、錳細(xì)菌、產(chǎn)酸菌、產(chǎn)烷菌、假單胞菌等，甚至真菌類也能導(dǎo)致微生物腐蝕[15]。

文物作為一種載體，承載著人類古代文明的發(fā)展痕跡，具有很高的歷史、藝術(shù)、科技、經(jīng)濟價值。隨著文物保護事業(yè)的發(fā)展，文物保護需求的增加，包括生物學(xué)技術(shù)在內(nèi)的很多自然科學(xué)領(lǐng)域的方法和技術(shù)逐漸被引用到文物保護中。從20世紀(jì)中葉開始，西方學(xué)者就運用生物學(xué)理論來評估各類文物的保存狀況，并以評估結(jié)果為依據(jù)來完善文物保護措施[16-18]。目前也有報道顯示，已經(jīng)根據(jù)文物保護所用有機合成材料的耐微生物性，針對性地探索研究文物保護的各種分析技術(shù)[19]。

國內(nèi)在文物保護微生物學(xué)方面，尤其是古代壁畫和木質(zhì)棺槨的微生物病害方面的研究也已取得階段性進展[20-23]。發(fā)掘出水的海底文物面臨著從低氧(或厭氧)環(huán)境轉(zhuǎn)為有氧環(huán)境的變化，這一變化過程必然導(dǎo)致文物中細(xì)菌類群的變化以及細(xì)菌對文物分解或降解活動的加劇[24]。目前為止，針對文物細(xì)菌性病害的研究或調(diào)查主要集中在石質(zhì)、壁畫或巖畫等無機質(zhì)文物[25-28]，而對各類出水飽水木質(zhì)文物的細(xì)菌性病害雖已引起重視[25，28-29]，但具體研究并不多見[30-31]。大量研究表明，木材細(xì)胞壁中主要含纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，飽水狀態(tài)時細(xì)菌以木材中的上述成分為碳源而生存[32-34]。此外，微生物代謝產(chǎn)物中含有的某些酶也能夠分解木質(zhì)文物中的有機質(zhì)[35]，因此飽水木質(zhì)文物易受到微生物侵蝕。隨著我國沿海越來越多木質(zhì)沉船被發(fā)現(xiàn)[24，36]，由此面臨的水下木質(zhì)文物的生物損傷狀況評估、后期的文物清理和保護等涉及細(xì)菌學(xué)問題也會越來越多。除了木質(zhì)文物，還有很多被歷史遺忘的陶器和瓷器也會經(jīng)歷被打撈的過程[37-38]。

在海洋環(huán)境下的瓷質(zhì)文物，受到海洋中的可溶性鹽、海洋微生物以及其他雜質(zhì)的侵蝕，通過瓷器的縫隙以及孔洞發(fā)生腐蝕，而且會存在“正反饋”效應(yīng)，即當(dāng)陶瓷的釉面出現(xiàn)麻點式破損，坑點處容易寄生微生物，微生物排泄和尸體腐爛又形成了弱酸環(huán)境，進一步產(chǎn)生腐蝕。

因為出水文物在不同環(huán)境下的腐蝕情況不一，本研究主要內(nèi)容為在沾有海泥的環(huán)境下，文物被微生物腐蝕的情況，著眼于海泥的微生物與文物腐蝕之間的聯(lián)系，以應(yīng)用于后期文物保護等相關(guān)方面。

1 材料和方法

1．1 樣品來源

實驗所用海泥取自中國長江口北港攔門沙水域，在長江口二號沉船附近，采樣點經(jīng)緯度為31°21′20″N，122°04′E，屬于咸淡水混合水域[39]。

木頭、陶器、瓷器等文物來源于長江口二號沉船水下勘探時所采集的碎片，對應(yīng)長江口水下文物最主要的典型材質(zhì)。

1．2 培養(yǎng)基配方

近年來，用于海水細(xì)菌篩選的培養(yǎng)基主要包括2216E培養(yǎng)基[40]、檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基[41]、Postage培養(yǎng)基[13]等(成分及用途見表1)，檸檬酸鐵銨培養(yǎng)基和Postage培養(yǎng)基分別用于鐵細(xì)菌和硫酸鹽還原菌的定向培養(yǎng)，篩掉了其他可能的優(yōu)勢菌株。本研究在此基礎(chǔ)上改進配方，選用富集培養(yǎng)基TSB培養(yǎng)基和BM2培養(yǎng)基，與2216E培養(yǎng)基類似，本研究所用的培養(yǎng)基對海水中的細(xì)菌也沒有定向選擇壓力，而且無機鹽含量更豐富，以期用于海洋優(yōu)勢菌，包括好氧菌和厭氧菌的富集培養(yǎng)。

表1 海水細(xì)菌篩選培養(yǎng)基Table 1 Seawater bacteria screening media

此外，本實驗還用到LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，Yeast 5 g/L，Tryptone 10 g/L，滅菌陳海水溶解。

1．3 菌株的篩選與分離純化

稱取2 g海泥于20 mL TSB培養(yǎng)基或BM2培養(yǎng)基中，30 ℃搖床200 r/min富集培養(yǎng)24 h；從培養(yǎng)液中吸取100 μL，用滅菌陳海水按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8稀釋，涂布LB固體平板，30 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落劃線觀察并進行16S rDNA PCR。

1．4 生長曲線的繪制

根據(jù)16S rDNA的結(jié)果，按照1%接種量接種于30 mL LB液體培養(yǎng)基，220 r/min的搖床30 ℃培養(yǎng)，每隔2 h取樣，用分光光度儀讀取OD600，繪制生長曲線。

1．5 文物腐蝕實驗

根據(jù)生長曲線，在菌液生長的對數(shù)生長期浸泡文物材料，220 r/min搖床下30 ℃培養(yǎng)7 d后在掃描電鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果和討論

2．1 菌株的分離純化

將TSB培養(yǎng)的菌液劃線分離得到12株形態(tài)各異的單菌落(圖1)，編號為S1～S12，將BM2培養(yǎng)的菌液劃線分離得到6株形態(tài)各異的單菌落(圖2)，編號為S13～S18。

圖1 TSB培養(yǎng)基劃線分離結(jié)果Fig.1 Results of the TSB media dash separation

圖2 BM2培養(yǎng)基劃線分離結(jié)果Fig.2 Results of the BM2 media dash separation

將以上菌株進行16S rDNA PCR(圖3)，將成功擴增出1 500 bp條帶的菌株(編號為S2，S3，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11，S12，S13～S18)進行測序，并在NCBI上進行比對，與GenBank中序列的相似性均達(dá)到了100%，因此可以確定到種，查找相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)S8、S9(S13)、S10、S12均已報道出有腐蝕作用[42-52](表2)。

圖3 16S rDNA PCR結(jié)果Fig.3 Results of 16S rDNA

表2 16S rDNA測序結(jié)果分析Table 2 Analysis of 16S rDNA sequencing results

2．2 菌株的生長曲線

根據(jù)文獻報道，選擇有腐蝕性能的4株菌：S8、S9、S10、S12以及兩株沒有腐蝕性能的菌：S2和S15接種于LB液體培養(yǎng)基，進行純培養(yǎng)并繪制生長曲線(圖4)，發(fā)現(xiàn)大部分菌在4～16 h處于生長旺盛的對數(shù)生長期(S8、S10、S2、S15)，其余菌在2～14 h達(dá)到對數(shù)生長期(S9、S12)，這為接下來的腐蝕實驗奠定了基礎(chǔ)。

圖4 6株菌的生長曲線Fig.4 Growth curve of 6 strains

2．3 掃描電鏡結(jié)果

因為出水文物在不同環(huán)境下的腐蝕情況不一，本次工作主要研究的是文物打撈出來后，在沾有海泥的自然空氣環(huán)境下被微生物腐蝕的情況。根據(jù)生長曲線，在菌液生長的對數(shù)生長期浸泡文物材料樣品(圖5)，于220 r/min搖床30 ℃培養(yǎng)7 d后電鏡觀察結(jié)果。

圖5 文物材料Fig.5 Cultural relic materials

根據(jù)文獻報道，海洋中的微生物接觸到材料表面，分泌胞外聚合物(EPS)，與細(xì)菌一起附著于材料表面，形成生物膜。這層膜主要由細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物組成，是發(fā)生微生物腐蝕的先決條件[8]。硫酸鹽還原菌作用于碳鋼后能形成生物膜[51]。本次實驗也觀察到了在不同的文物材料表面也有類似的現(xiàn)象。

將文物材料浸泡于細(xì)菌菌液中7 d后，僅觀察到大腸桿菌DH5α無生物膜形成，說明大腸桿菌對三種文物材料均無腐蝕作用。而文物在S9、S10、S12、S2、S15浸泡7 d后，在不同的文物材料表面形成了不同形態(tài)的生物膜，木頭材料表面的生物膜疏松多孔(圖6a)，瓷器材料表面的生物膜呈圓形但不均一(圖6b)，陶器材料表面的生物膜致密呈簇狀分布(圖6c)。圖6中白色方框表示在5 000倍電鏡下觀察的生物膜，白色箭頭表示在相同位置18 000倍下觀察的生物膜。

圖6 文物材料在菌液中浸泡7 d后的電鏡照片F(xiàn)ig.6 Electron microgcopic images of cultural relic materials soaked in bacteria solutions for 7 d

3 討 論

海洋資源中存在豐富的細(xì)菌種群，不同位置的海泥有不同的優(yōu)勢菌種或特定菌種[54]。由于長期以來硫酸鹽還原菌被認(rèn)為是腐蝕的主要菌，但自然界中微生物種類繁多，近十幾年的研究則表明細(xì)菌如鐵細(xì)菌、錳細(xì)菌、產(chǎn)酸菌、產(chǎn)烷菌、假單胞菌等，甚至真菌類也能導(dǎo)致微生物腐蝕。本研究選用非定向的富集培養(yǎng)基，模擬海水環(huán)境(滅菌陳海水配制培養(yǎng)基)，以期用于海洋優(yōu)勢菌的富集培養(yǎng)。

本研究所采樣的海泥中，分離純化得到18株菌，芽孢桿菌所占的比例較大，為22．2%，經(jīng)16S rDNA鑒定出4種已被報道有腐蝕性的細(xì)菌：哈夫尼希瓦氏菌(Shewanellahafniensis)、越南芽孢桿菌(Bacilluswiedmannii)、金橙微小桿菌(Exiguobacteriumaquaticum)和微小桿菌(Exiguobacteriumindicum)。但這些微生物是否腐蝕木頭、陶器、瓷器這些文物材料是未知的，所以本研究做了相關(guān)實驗證明是否對于文物材料也有腐蝕作用。在本次文物材料浸泡實驗中，均產(chǎn)生腐蝕后的代謝產(chǎn)物——生物膜，而生物膜的形成是微生物腐蝕發(fā)生的關(guān)鍵步驟和先決條件。這三株菌本身被報道是腐蝕性菌，再與文物材料作用又能產(chǎn)生生物膜，初步可認(rèn)為發(fā)生了腐蝕作用。此外，還有2株未被報道是腐蝕性細(xì)菌的萘醌對希瓦氏菌和嗜水氣單胞菌也在文物材料表面產(chǎn)生了生物膜，提示了這兩株菌可能參與了腐蝕過程，它們的具體機制還值得進一步探究。

材料在海水中，腐蝕過程包括4個階段[42]：形成條件層、微生物附著形成生物膜、軟體宏觀污損和硬體宏觀污損。微生物誘導(dǎo)腐蝕的本質(zhì)是生物膜的存在及其與材料基體間的相互作用[7]，所以主流觀點都認(rèn)可生物膜是微生物腐蝕的先決條件。具體腐蝕機制須根據(jù)生物膜下的微生物代謝產(chǎn)物與材料的實際化學(xué)反應(yīng)來闡釋，后續(xù)將進一步研究。

腐蝕作用是多種介質(zhì)一起參與形成的復(fù)雜反應(yīng)，除了單個細(xì)菌的影響外，多種細(xì)菌相互作用也能加速腐蝕過程[7]。本研究只關(guān)注了單個細(xì)菌對文物材料的腐蝕作用，對于多種細(xì)菌間的相互作用還有待進一步的探究。

已有文獻報道[37-38]，從海水打撈出來的陶瓷文物和耐蝕材料不銹鋼均可見微生物腐蝕。這提示從海底打撈的文物材料長期處在海水環(huán)境下都會發(fā)生腐蝕過程。本研究只將文物材料置于菌液中培養(yǎng)7 d，針對不同文物材料腐蝕所需的時間以及腐蝕所需的菌濃度還有研究的空間。

4 結(jié) 論

探究了長江口咸淡水混合水域的海泥中的優(yōu)勢菌株為芽孢桿菌，并細(xì)分出4株腐蝕性細(xì)菌和2株未被報道為腐蝕性細(xì)菌但具有腐蝕潛力的細(xì)菌，區(qū)別于以往微生物腐蝕研究都集中于硫酸鹽還原菌這一類菌。本研究發(fā)現(xiàn)了更多的腐蝕性細(xì)菌，揭示了海岸帶咸淡水混合水域微生物的豐富性。

其中，將4株腐蝕性細(xì)菌作用于對瓷質(zhì)、陶質(zhì)和木質(zhì)文物材料，觀察到材料表面生成與微生物腐蝕密切相關(guān)的生物膜，從而實驗證明哈夫尼希瓦氏菌、越南芽孢桿菌、金橙微小桿菌和微小桿菌對于瓷質(zhì)、陶質(zhì)和木質(zhì)材料的腐蝕作用。

另外2株未被報道為腐蝕性細(xì)菌但具有腐蝕潛力的細(xì)菌：萘醌對希瓦氏菌和嗜水氣單胞菌，它們也能在文物材料表面生成生物膜，初步證明這兩株菌也具有腐蝕效果。

文物作為人類智慧的優(yōu)秀結(jié)晶和遺存，文物保護不僅是對歷史的承諾，也是對后人的啟迪。利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)研究文物腐蝕，可以給文物保護提供新的思路。