不同保鮮方式冷吃兔中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的對(duì)比分析

張鈺麟，陳泓帆，趙志平*，康馨樾，王衛(wèi)，白婷，張佳敏，聶鑫，羅淮良

(1.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106；2.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610083；3.自貢市泰福農(nóng)副產(chǎn)品加工廠，四川 自貢 643000)

兔肉在我國(guó)有著悠久的歷史，古人在幾千年前就發(fā)現(xiàn)兔肉具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并予以兔肉“辛平無(wú)毒，補(bǔ)中益氣”、“涼血，解熱毒，利大腸”的評(píng)價(jià)[1]。兔肉具有“四高四低”的優(yōu)點(diǎn)，四高即高蛋白質(zhì)、高消化率、高不飽和脂肪酸以及高必需氨基酸；四低即低熱量、低油脂、低膽固醇與低脲酸[2]。此外，兔肉含有豐富的維生素、氨基酸及多種礦物質(zhì)，并且具有保健和美容的功效，是國(guó)際上公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)健康肉類。

冷吃兔是自貢市國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。兔肉經(jīng)水煮、高溫油炸、炒制脫水后，保質(zhì)期顯著延長(zhǎng)，且可以在常溫下食用，故被稱為“冷吃兔”。冷吃兔具有色澤紅潤(rùn)、麻辣鮮香的特點(diǎn)，廣受消費(fèi)者喜愛(ài)。冷吃兔由于在加工過(guò)程中有大量油脂參與，屬于油浸型食品，易被微生物污染，造成腐敗。添加防腐劑是防止工業(yè)化生產(chǎn)食品腐敗變質(zhì)的常用措施，彭先杰等對(duì)引起冷吃兔腐敗變質(zhì)的微生物進(jìn)行了分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)沃氏葡萄球菌和枯草芽孢桿菌是導(dǎo)致冷吃兔腐敗變質(zhì)的特定腐敗菌[3]。李瓊等研究了軟包裝材料對(duì)自貢冷吃兔酸敗的影響，發(fā)現(xiàn)溫度是導(dǎo)致冷吃兔酸敗的主要因素，并得出冷吃兔的最佳保藏溫度為4 ℃，最佳包裝材料為22絲PA/PET/RCPP復(fù)合膜[4]。舒梨等用副干酪乳桿菌發(fā)酵后的兔肉炒制的冷吃兔在口感、質(zhì)地、風(fēng)味、安全性和穩(wěn)定性上都有較大提高[5]。

品種、性別、部位是影響兔肉腥味物質(zhì)的重要因素。白小彥對(duì)比了不同品種的兔肉的腥味程度，發(fā)現(xiàn)不同品種的兔肉的腥味物質(zhì)含量不同[6]。陳康等對(duì)不同性別兔肉的腥味物質(zhì)進(jìn)行SPME-GC-MS分析顯示，雌兔的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類明顯高于雄兔，但雄兔的腥味物質(zhì)含量明顯高于雌兔[7]。王珺等采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用相結(jié)合的方法，定性分析了不同部位兔肉的風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)兔肉的主體風(fēng)味物質(zhì)為醛類、醇類、酮類和烴類化合物，且不同部位的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量存在明顯差異[8]。謝躍杰等研究發(fā)現(xiàn)兔肉風(fēng)味物質(zhì)主要包括烯類、醇類、醛類、酯類、雜環(huán)類5類物質(zhì)，且乙酸為兔肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要成分之一[9]。姜穎等研究認(rèn)為鹵代烷烴可能是構(gòu)成兔肉腥味的重要成分，并且推斷脂肪氧化酶(LOX)與兔肉腥味的形成密切相關(guān)[10-11]。白小彥等研究發(fā)現(xiàn)兔肉腥味的濃淡與兔肉中脂肪氧化酶(LOX)的含量呈正相關(guān)。

目前，沒(méi)有關(guān)于防腐劑和高溫殺菌對(duì)冷吃兔常溫貯藏過(guò)程中風(fēng)味影響的報(bào)道。本研究以新鮮兔肉為原料，加工成冷吃兔，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HS-SPME-GC-MS)測(cè)定冷吃兔中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并結(jié)合相對(duì)氣味活度值(ROAV)法對(duì)冷吃兔中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，為工業(yè)化生產(chǎn)冷吃兔的常溫貯藏保鮮提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮兔肉：購(gòu)自成都十陵鎮(zhèn)204菜市場(chǎng)。

1.2 儀器

BCD-452WDPF冷藏冰箱 青島海爾集團(tuán)；5977A-7890B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(含PAL3自動(dòng)進(jìn)樣器) 美國(guó)安捷倫公司；賽多利斯萬(wàn)分之一天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 冷吃兔加工方法

將新鮮兔肉洗凈，切分為適宜大小的小塊，加鹽、蔥、姜、白酒腌制20 min去腥，起鍋熱油，七成油溫下入腌制好的兔肉丁，炒干兔肉水分，加入蔥、姜、蒜、辣椒、花椒、鹽、海椒面、生抽、老抽、白糖、酵母提取物增香調(diào)味，即為冷吃兔成品。防腐劑用量：脫氫乙酸鈉(0.05 g/kg)、乳酸鏈球菌素(0.05 g/kg)、雙乙酸鈉(0.15 g/kg)、山梨酸鉀(0.75 g/kg)。不同保鮮方式貯藏冷吃兔(A組：不加防腐劑不殺菌，B組：不加防腐劑殺菌，C組：加防腐劑不殺菌，D組：加防腐劑殺菌)。

1.4 GC-MS檢測(cè)

稱取3 g粉碎后的冷吃兔于15 mL的頂空瓶中密封，設(shè)置CTC自動(dòng)進(jìn)樣器對(duì)樣品的前處理?xiàng)l件：加熱箱溫度50 ℃，加熱時(shí)間45 min，樣品抽取時(shí)間20 min，解吸時(shí)間5 min。

色譜條件：HP-5MS UI色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；壓力為32.0 kPa；流速為1.0 mL/min；載氣為He，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度設(shè)置為250 ℃；升溫程序：起始溫度為40 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至70 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min升至120 ℃，保持3 min，再以5 ℃/min升至160 ℃，保持1 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源(EI)；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃，四級(jí)桿溫度為150 ℃；檢測(cè)器電壓為350 V；質(zhì)量掃描范圍(m/z) 為50～550。

定性：對(duì)化合物進(jìn)行分析，將測(cè)定的數(shù)據(jù)在儀器中的NIST 14.L譜庫(kù)中進(jìn)行檢索匹配，選擇匹配度高于80%的物質(zhì)。

定量：對(duì)總離子流色譜圖采用峰面積歸一化定量分析，得出各組分的相對(duì)含量。

1.5 特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的評(píng)價(jià)

為了評(píng)價(jià)各種揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)樣品風(fēng)味的影響程度，采用相對(duì)氣味活度值(ROAV)法[12]，設(shè)定樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大的物質(zhì) ROAVs=100，樣品中其他風(fēng)味物質(zhì)的ROAV值可通過(guò)下式計(jì)算：

式中：ROAVa為揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)氣味活度值；C%a為各揮發(fā)性成分的相對(duì)含量；C%stan為對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大的物質(zhì)的相對(duì)含量；Tstan為對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)程度最大的物質(zhì)的感官閾值；Ta為各揮發(fā)性成分的感官閾值。

對(duì)于所有的風(fēng)味物質(zhì)，0≤ROAV≤100。0.1≤ROAV≤1的風(fēng)味物質(zhì)對(duì)樣品風(fēng)味起修飾作用；ROAV≥1的風(fēng)味物質(zhì)為冷吃兔中的主體風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)冷吃兔中風(fēng)味的貢獻(xiàn)顯著。ROAV值越大，說(shuō)明此物質(zhì)對(duì)樣品冷吃兔中風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度越大。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，以各種風(fēng)味物質(zhì)作為變量，采用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷吃兔GC-MS分析

通過(guò)GC-MS結(jié)合固相微萃取，對(duì)A、B、C、D 4種不同保鮮方式樣品冷吃兔貯藏的3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(0，14，28 d)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4種冷吃兔中風(fēng)味物質(zhì)種類及含量

續(xù) 表

糖類與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)以及不飽和脂肪酸的氧化降解是風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的主要途徑[13]。4種不同保鮮方式冷吃兔中在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)共檢測(cè)出63種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類22種、醛類9種、酯類9種、烷烴類7種、酮類6種、酸類5種、其他5種。

醇類物質(zhì)主要來(lái)源于不飽和脂肪酸的生物降解[14]，由于其閾值較大，醇類物質(zhì)相比于醛類物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的影響程度更小。但是有一些不飽和醇類的閾值也很低，對(duì)樣品的風(fēng)味影響較大[15]。芳樟醇具有花香、木香，多來(lái)源于香料[16]。在冷吃兔常溫儲(chǔ)藏的過(guò)程中，A樣品兔肉在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)醇類物質(zhì)相對(duì)含量分別為21.42%、29.06%、27.65%；B樣品兔肉在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)相對(duì)含量分別為22.36%、27.36%、22.22%；C樣品兔肉在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)相對(duì)含量分別為24.4%、24.57%、26.70%；D樣品兔肉在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)相對(duì)含量分別為25.34%、28.16%、28.26%，4個(gè)樣品兔肉中醇類物質(zhì)的差異不顯著(p>0.05)。

醛類物質(zhì)主要來(lái)源于不飽和脂肪酸的氧化，因其感覺(jué)閾值低，所以對(duì)樣品風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度很大。通過(guò)對(duì)比4種冷吃兔的醛類物質(zhì)總相對(duì)含量，只有B與D相對(duì)含量差異較大(p=0.035<0.05)，其余組別兩兩對(duì)比相對(duì)含量差異均不大(p>0.05)。醛類物質(zhì)中，主要是正己醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛。正己醛是一種較常見(jiàn)的揮發(fā)油，廣泛存在于黨參中[17]，通常賦予樣品清香以及果香；苯乙醛被認(rèn)為是通過(guò)Strecker降解苯丙氨酸而形成的，廣泛存在水果、巧克力和蜂蜜中[18]。陳康等研究發(fā)現(xiàn)，母兔的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是己醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛，這與本研究結(jié)果一致。

酯類物質(zhì)是具有芳香型氣味的揮發(fā)性化合物[19]，其主要是醇類物質(zhì)與游離脂肪酸通過(guò)酯化反應(yīng)生成的，酯類物質(zhì)一般閾值較高，對(duì)冷吃兔的風(fēng)味一般影響不大。酯類物質(zhì)大多能夠賦予肉類果香，除了部分內(nèi)酯外，對(duì)樣品風(fēng)味貢獻(xiàn)較小。

酮類物質(zhì)主要來(lái)源于脂肪的氧化、微生物的氧化以及氨基酸的降解[20]，其呈味時(shí)間久，并且具有特殊的清香與花香[21]。酮類物質(zhì)相對(duì)于互為同分異構(gòu)體的醛類，閾值更高，對(duì)冷吃兔的風(fēng)味起修飾作用[22]。通過(guò)對(duì)比4種冷吃兔樣品酮類物質(zhì)總相對(duì)含量，所有組別兩兩對(duì)比相對(duì)含量均無(wú)顯著差異(p>0.05)。

酸類物質(zhì)主要來(lái)源于脂肪酸甘油酯和磷脂酶解或加熱氧化產(chǎn)生[23]。脫氫乙酸、山梨酸是冷吃兔中主要的酸類物質(zhì)。有研究表明，γ輻射可以引起脫氫乙酸降解，輻解產(chǎn)物主要是庚烷-2，4，6-三酮[24]。

烷烴類物質(zhì)主要來(lái)源于烷氧自由基的均裂，其中D-檸檬烯具有柑橘味道和檸檬香氣[25]。因烷烴類物質(zhì)閾值較高，對(duì)冷吃兔風(fēng)味貢獻(xiàn)也有一定的作用。

2.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的ROAV分析

樣品的風(fēng)味主要是由含量以及感覺(jué)閾值共同決定的，通常含量高并且閾值小的物質(zhì)對(duì)樣品風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度大。參考《化合物嗅覺(jué)閾值匯編》并且結(jié)合相對(duì)含量對(duì)各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行ROAV值計(jì)算，結(jié)果以及編號(hào)見(jiàn)表2。

表2 冷吃兔的ROAV值Table 2 The ROAVs of spicy rabbit meat

3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的4種冷吃兔中共有23種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，可通過(guò)查詢閾值計(jì)算出對(duì)應(yīng)的ROAV值，0.1≤ROAV<1的物質(zhì)對(duì)樣品風(fēng)味有修飾作用；ROAV≥1的物質(zhì)是樣品的主體風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)樣品風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度較大。

0 d冷吃兔中，桉葉油醇、芳樟醇、正己醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、乙酸芳樟酯、乙酸香葉酯、月桂烯、D-檸檬烯、蒎烯為主體風(fēng)味物質(zhì)；順-氧化芳樟醇、左旋香芹酮、茴香腦對(duì)0 d冷吃兔風(fēng)味有一定的修飾作用。

14 d冷吃兔中，桉葉油醇、芳樟醇、正己醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、乙酸芳樟酯、月桂烯、D-檸檬烯、蒎烯為主體風(fēng)味物質(zhì)。紫蘇醛、左旋香芹酮、茴香腦對(duì)14 d冷吃兔風(fēng)味有一定的修飾作用。其中乙酸香葉酯在樣品A、C(不殺菌組)中呈現(xiàn)修飾作用，在B、D(殺菌組)中對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度較大，它有清甜的水果香及甜潤(rùn)的玫瑰、薰衣草樣香氣[26]。反式-2,4-癸二烯醛的ROAV值在樣品A、B、C中為100，它呈現(xiàn)出甜橙氣息，并且具有脂肪的氣息。芳樟醇在樣品D中ROAV=100，在其他樣品中ROAV值也偏大，它對(duì)此階段的冷吃兔風(fēng)味有很大的影響。

28 d冷吃兔中，桉葉油醇、芳樟醇、正己醛、苯乙醛、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛、乙酸芳樟酯、乙酸香葉酯、月桂烯、D-檸檬烯、蒎烯為主體風(fēng)味物質(zhì)；苯乙醇、左旋香芹酮、茴香腦對(duì)此時(shí)間段冷吃兔風(fēng)味起修飾作用。其中，芳樟醇、反式-2,4-癸二烯醛是兩種對(duì)風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，它們分別呈現(xiàn)出鈴蘭香以及脂香、青香[27]。

綜上，通過(guò)ROAV值得出冷吃兔中主體風(fēng)味物質(zhì)主要由中級(jí)醛、不飽和醇、乙酸酯、中級(jí)烯烴類組成。

2.3 主體風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

對(duì)ROAV≥1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)采用主成分分析，提取特征值不小于1的主成分，3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的冷吃兔中主成分貢獻(xiàn)率見(jiàn)表3。3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的冷吃兔樣品前兩個(gè)累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為82.70%、88.99%、76.10%。前兩個(gè)主成分包含了絕大部分關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。

表3 主成分特征值及累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 3 Principal component eigenvalues and cumulative contribution rates

續(xù) 表

提取4種冷吃兔中經(jīng)主成分分析后所得到的載荷矩陣，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 載荷矩陣Table 4 Loading matrix

根據(jù)各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的特征向量，參照王志恒等的方法[28]，構(gòu)建0，14，28 d冷吃兔中的主成分函數(shù)表達(dá)式。

0 d冷吃兔函數(shù)表達(dá)式：

F1=0.2711X1+0.2740X2-0.0134X3+0.1273X4-0.1957X5+0.0103X6+0.1937X7-0.2680X8-0.2332X9+0.2811X10+0.2680X11+0.2680X12+0.2603X13+0.2848X14+0.2845X15+0.2543X16+0.1273X17+0.0877X18+0.2236X19+0.2045X20-0.0014X21。

F2=0.0214X1-0.0540X2+0.4334X3-0.3794X4-0.0571X5+0.4129X6+0.2136X7-0.0856X8+0.1726X9+0.0361X10+0.0856X11+0.0856X12-0.1003X13-0.0129X14+0.0049X15-0.1949X16-0.3794X17-0.0642X18+0.1806X19+0.2894X20+0.2846X21。

14 d冷吃兔函數(shù)表達(dá)式：

F1=0.0999X1+0.2384X2+0.2510X3+0.2309X4+0.2332X5-0.2332X6+0.2219X7-0.1979X8-0.2177X9-0.2533X10+0.2015X11+0.2015X12+0.2401X13+0.2000X14+0.2394X15+0.2559X16+0.2530X17-0.1685X18+0.1355X19+0.2219X20+0.2162X21。

F2=-0.0205X1-0.1958X2+0.0903X3-0.2220X4-0.2231X5-0.1848X6+0.1559X7+0.2750X8+0.2021X9-0.0955X10+0.2766X11+0.2766X12-0.1758X13+0.3259X14+0.1884X15+0.0635X16-0.0509X17-0.2577X18-0.4178X19+0.2278X20-0.2115X21。

28 d冷吃兔函數(shù)表達(dá)式：

F1=0.3155X1+0.3068X2+0.2176X3+0.2734X4-0.0208X5-0.0217X6+0.1342X7-0.1540X8-0.1245X9+0.0230X10+0.0208X11-0.2114X12+0.3129X13+0.2983X14+0.2153X15+0.2857X16+0.3055X17+0.0669X18+0.3000X19+0.2701X20-0.0694X21+0.0006X22。

F2=-0.0112X1-0.0822X2-0.0785X3+0.1871X4+0.3667X5+0.3686X6+0.2979X7+0.3165X8+0.0796X9+0.0837X10-0.3667X11+0.1480X12+0.0260X13+0.1034X14-0.2432X15+0.0167X16-0.0889X17+0.2626X18+0.0391X19+0.1990X20-0.2626X21-0.2551X22。

函數(shù)表達(dá)式中Fi(i=1,2)為主成分，X1～X22分別為各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的值。以每一個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率與提取的主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率比值作為系數(shù)得到綜合評(píng)價(jià)模型：

0 d冷吃兔綜合評(píng)價(jià)模型：F=0.710X1+0.290X2，

14 d冷吃兔綜合評(píng)價(jià)模型：F=0.806X1+0.194X2，

28 d冷吃兔綜合評(píng)價(jià)模型：F=0.568X1+0.432X2。

根據(jù)模型計(jì)算得到4種冷吃兔在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的主成分綜合得分表，見(jiàn)表5。

表5 冷吃兔中綜合因子得分及排序Table 5 Comprehensive factor score and sequence of spicy rabbit meat

綜合4種不同處理方式冷吃兔在3個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的得分，計(jì)算4種冷吃兔得分的相關(guān)性系數(shù)。A和B的相關(guān)系數(shù)為0.953，A和C的相關(guān)系數(shù)為0.790，A和D的相關(guān)系數(shù)為0.889。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)4種不同保鮮方式的冷吃兔中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定。4種冷吃兔中一共鑒定到63種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，兩兩對(duì)比，總相對(duì)含量基本無(wú)顯著性差異(p>0.05)。結(jié)合相對(duì)氣味活度值(ROAV)，篩選出ROAV≥1的23種關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)，其中，芳樟醇、D-檸檬烯、反式-2-癸烯醛、反式-2,4-癸二烯醛是對(duì)冷吃兔風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的風(fēng)味物質(zhì)。通過(guò)計(jì)算每種冷吃兔在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的主成分綜合得分，推測(cè)添加防腐劑以及高溫殺菌對(duì)冷吃兔中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量以及種類影響不大。