種子引發(fā)對(duì)甜高粱角質(zhì)層蠟質(zhì)及其抗性的影響

姚露花，綦才，楊建峰，郭彥軍

（1. 西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院，重慶 400716；2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，山東 青島 266109；3. 西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，重慶 400716）

全球氣候變化引發(fā)的自然災(zāi)害，如干旱、水澇、高溫、冷害等，嚴(yán)重影響著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，全球受影響農(nóng)田面積高達(dá)25%~38%［1］。高溫干旱易導(dǎo)致禾谷類作物如玉米（Zea mays）、小麥（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）等減產(chǎn)達(dá)28%~49%［2］。因此，如何提高大田作物的抗逆性已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)亟待解決的問(wèn)題。目前，抗逆品種選育被認(rèn)為是解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵［3-4］。然而，品種選育周期長(zhǎng)，加上品種更新?lián)Q代較為頻繁，依然無(wú)法從根本上解決非生物脅迫引發(fā)的生產(chǎn)損失。在生產(chǎn)中，主要通過(guò)施肥、灌溉、栽培措施等提高作物對(duì)自然災(zāi)害的抵抗能力［5-7］。其中，種子引發(fā)是一種低成本、可高效提高種子發(fā)芽活力及幼苗抗性的方法，可改善植物在非生物脅迫下的生長(zhǎng)發(fā)育［8］，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用較為廣泛。

聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）引發(fā)對(duì)作物種子發(fā)芽、育苗和產(chǎn)量均有積極影響［9］。PEG 引發(fā)因其分子量大不易浸入種子，不會(huì)對(duì)種子胚胎產(chǎn)生破壞性影響［9］。PEG 引發(fā)的高粱（Sorghum bicolor）幼苗表現(xiàn)出較少的脂質(zhì)過(guò)氧化，改善了細(xì)胞膜穩(wěn)定性［10］。激素引發(fā)如水楊酸（salicylic acid，SA）可促進(jìn)干旱條件下水稻種子的離子吸收，從而增加發(fā)芽及幼苗生長(zhǎng)，同時(shí)減少植物的蒸騰水分流失［11］。鹽脅迫下，脫落酸（abscisic acid，ABA）引發(fā)通過(guò)調(diào)節(jié)離子傳輸，減少蒸騰水分損失來(lái)促進(jìn)大麥（Hordeum vulgare）葉片的生長(zhǎng)［12］。吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）引發(fā)可調(diào)節(jié)小麥中的離子穩(wěn)態(tài)和誘導(dǎo)葉片中的SA 生物合成來(lái)響應(yīng)鹽脅迫［13］?？傊?，滲透引發(fā)與激素引發(fā)通過(guò)不同的作用機(jī)制影響種子吸脹過(guò)程，因此篩選合適的引發(fā)劑，對(duì)精準(zhǔn)提高作物抗逆性具有重要意義。

角質(zhì)層蠟質(zhì)是由初級(jí)醇、醛類、脂肪酸和烷烴等化合物組成的有機(jī)混合物，覆蓋于植物表面形成抗逆屏障，可有效限制植物非氣孔水分散失［14］。研究發(fā)現(xiàn)，植物表皮蠟質(zhì)的含量和化學(xué)組分會(huì)因植物種類、發(fā)育階段和器官部位變化而變化。比如，番茄（Lycopersicon esculentum）葉蠟的主要成分是烷烴和三萜類化合物［15］，小麥葉蠟主要成分是伯醇和烷烴［16］，高粱葉蠟的主要成分是烷烴和醛類化合物［17］。而蠟質(zhì)的功能受其組分含量及種類的影響［18-19］。如C29烷與C31烷含量的增加更有利于防止植物過(guò)度失水［18］。植被富含C27~C33烷烴其保水能力較富含酮醛類物質(zhì)更強(qiáng)［20］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）突變體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C29烷烴大量缺失，植株失水率顯著增加且對(duì)干旱更加敏感［21-22］。葉綠素浸提試驗(yàn)顯示蠟質(zhì)組分中烷類物質(zhì)含量的下降導(dǎo)致植物角質(zhì)層滲透率上升約4 倍，其失水率明顯加快。角質(zhì)層蠟含量的變化會(huì)改變角質(zhì)層的滲透性，調(diào)節(jié)角質(zhì)層蒸騰，提高作物耐旱性［23］。種子引發(fā)可影響植物體內(nèi)代謝活動(dòng)以響應(yīng)環(huán)境脅迫［24］，而蠟質(zhì)是植物脂質(zhì)代謝的重要產(chǎn)物，可有效防止外界環(huán)境脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的傷害［14］。因此，本研究認(rèn)為引發(fā)可能通過(guò)改變角質(zhì)層蠟質(zhì)合成代謝以響應(yīng)環(huán)境脅迫。

為了驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究選擇甜高粱（S. bicolor‘Dochna’）為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)設(shè)置滲透引發(fā)（H2O，PEG）和激素引發(fā)處理［SA，ABA，赤霉素（gibberellin，GA）］，研究引發(fā)是否通過(guò)改變角質(zhì)層蠟質(zhì)沉積，從而影響表皮滲透性、利于高粱生長(zhǎng)。甜高粱是普通高粱的變種，一年生C4草本植物，具有光合效率高、可發(fā)酵糖量高、抗逆性強(qiáng)等特征［25-26］。因其生物產(chǎn)量高，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，已經(jīng)作為一種優(yōu)質(zhì)的飼用作物被廣泛推廣種植。然而，甜高粱抗逆性受其品種及推廣種植環(huán)境的影響存在很大差異［3，27］。目前，針對(duì)改變高粱角質(zhì)層蠟質(zhì)沉積來(lái)降低水分散失的研究?jī)H限于高粱苗期［28］，對(duì)于大田條件下不同生長(zhǎng)期的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究主要探討：1）引發(fā)對(duì)高粱不同生長(zhǎng)期蠟質(zhì)含量及組分含量的影響；2）引發(fā)對(duì)高粱不同生育期葉片含水量及葉片水分損失率的影響；3）引發(fā)對(duì)高粱不同生長(zhǎng)期葉綠素含量及葉綠素浸提率的影響；4）引發(fā)對(duì)角質(zhì)層蠟質(zhì)的影響是否存在跨年度效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)地位于重慶北碚西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)（29°48′N(xiāo)，106°24′E），屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候。該地區(qū)的平均溫度為17.8 ℃，過(guò)去30 年平均降水量為1100 mm。高粱生長(zhǎng)試驗(yàn)期（2020 和2021 年）的氣溫與降水情況如圖1所示。試驗(yàn)地土壤為紫色壤土，是中國(guó)南方最重要的農(nóng)業(yè)土壤類型之一。土壤pH 值（土壤∶水=1∶5）為7.8，養(yǎng)分含量如全氮、全磷、全鉀和總有機(jī)碳的含量分別為0.51 g·kg-1、0.38 g·kg-1、43.67 g·kg-1、21.13 g·kg-1；堿解氮、速效磷和速效鉀的含量分別為41.94 mg·kg-1、6.81 mg·kg-1和56.67 mg·kg-1。土壤理化性質(zhì)的測(cè)定參考鮑士旦［29］的方法。

圖1 高粱種植期間重慶氣溫與降水情況Fig.1 Temperature and precipitation in Chongqing during planting stage of sorghum

試驗(yàn)材料選擇甜高粱品種為品05206，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所提供。挑選飽滿健康的種子約600粒，用3% H2O2消毒5 min 后，用蒸餾水沖洗以去除消毒劑，然后進(jìn)行種子引發(fā)處理。種子引發(fā)處理包括水（H2O）引發(fā)、聚乙二醇（PEG）引發(fā)、水楊酸（SA）引發(fā)、脫落酸（ABA）引發(fā)和赤霉素（GA）引發(fā)。其中，水引發(fā)為去離子水引發(fā)；PEG 引發(fā)液的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為15%、SA 引發(fā)液濃度為150 mg·L-1，ABA 引發(fā)液濃度為20 mg·L-1、GA 引發(fā)液濃度為5 mg·L-1。每次選擇約200 粒大小一致的種子浸泡于100 mL 的各引發(fā)溶液中，20 ℃，黑暗條件下處理24 h［30］，之后在室溫下干燥至種子原始水分重量。同時(shí)用未引發(fā)種子作為對(duì)照（CK）。所有種子均儲(chǔ)存于4 ℃冰箱進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將未引發(fā)與引發(fā)種子于2020 年5 月在室溫條件下催芽12 h，播種于土壤，覆土3 cm。小區(qū)面積2 m×4 m，3次重復(fù)。株距30 cm，行距40 cm。試驗(yàn)地播前進(jìn)行常規(guī)處理，深翻（深度約25~30 cm）并施加600 kg·hm-2復(fù)合肥（N-P2O5-K2O 比例為15-15-15）。播種方式為人工播種，每穴播3~4 粒，3 葉期按設(shè)計(jì)株距定苗。高粱苗期進(jìn)行正常澆水管理，拔節(jié)期進(jìn)行中耕除雜防止高粱后期倒伏及雜草對(duì)高粱生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。于2020 年8 月收種后，種子存儲(chǔ)于4 ℃低溫冰箱，然后于2021 年5 月直接播種。播種方式與田間管理方式同2020 年。不同生育期（苗期、拔節(jié)期、抽穗期、成熟期）所有指標(biāo)均在同一時(shí)間取同一位置的葉片測(cè)定。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1蠟質(zhì)提取 采集高粱同一部位展開(kāi)葉片，室溫條件下加入含1 μg·μL-1內(nèi)標(biāo)（十六烷）的氯仿約3 mL，振蕩提取30 s，重復(fù)3 次。總提取液于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，加入吡啶與BSTFA［N，O-Bis（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺］衍生劑各20 μL，70 ℃反應(yīng)45 min，之后用氮吹儀再次吹干。將提取物用0.5 mL 氯仿溶解進(jìn)行氣相色譜和質(zhì)譜分析［31］。葉片提蠟前，利用WinFOLIA 專業(yè)葉片圖像分析系統(tǒng)（regent instrument inc，加拿大）和數(shù)字化掃描儀（EPSON V750，日本）測(cè)定葉片面積［32］。

1.3.2氣相色譜、質(zhì)譜分析（GC-MS） 蠟質(zhì)含量分析采用福立9790Ⅱ系列氣相色譜儀（中國(guó)）。氣相色譜儀程序：GC 毛細(xì)管柱長(zhǎng)30 m，直徑0.32 mm，液膜厚度0.25 μm；氮?dú)庾鳛檩d氣；進(jìn)樣量為2 μL。柱膜和FID 檢測(cè)器的溫度分別為300 和320 ℃。分流比為3∶1。程序升溫方式：初始溫度為80 ℃，以每分鐘15 ℃的速度升溫至260 ℃，并保持10 min，之后以每分鐘2 ℃升溫至290 ℃，保持1 min，再以每分鐘5 ℃的速度升溫至320 ℃，并保持10 min。用內(nèi)標(biāo)計(jì)算植物單位面積的蠟質(zhì)含量，單位為μg·cm-2。利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（GCMS-QP2010 Ultra，日本）鑒定蠟質(zhì)組分，程序升溫方式同色譜分析。

1.3.3葉片相對(duì)含水量與角質(zhì)層水分損失率測(cè)定 高粱葉片相對(duì)含水量（relative water content，RWC）根據(jù)Weatherley［33］的方法測(cè)定。即采集高粱不同生長(zhǎng)期同一部位完全展開(kāi)的葉片，并立即稱量鮮重（fresh weight，F(xiàn)W）。之后將葉片在蒸餾水中浸泡3 h，測(cè)定葉片飽和重量（saturated weight，SW），在70 ℃烘箱中干燥24 h 后，并稱干重（dry weight，DW）。相對(duì)含水量（RWC）計(jì)算公式為：RWC=(FW-DW)/(SW-DW)×100%。

角質(zhì)層水分損失率根據(jù)Burkhardt 等［34］的方法測(cè)定。將植株放于黑暗條件下適應(yīng)12 h 以確保氣孔關(guān)閉。采集葉片樣品浸入蒸餾水中1 h 并稱重。之后將葉片放入暗室進(jìn)行連續(xù)脫水，每隔15 min 測(cè)定其重量，持續(xù)150 min，以記錄水分損失。最后，將葉片樣品在70 ℃下干燥24 h 并稱重。失水率計(jì)算公式如下：

1.3.4葉綠素含量與葉綠素浸提率測(cè)定 葉綠素含量使用SPAD 儀（SPAD 502 Plus，日本）測(cè)定，選擇不同高粱植株同一葉片同一位置重復(fù)測(cè)定4 次。葉綠素浸提參考陳紅妙等［35］方法測(cè)定。取高粱同一部位展開(kāi)葉片，剪碎，片段長(zhǎng)約3 cm，浸泡在30 mL 80%的乙醇中，黑暗條件下輕輕搖晃，分別于20、60、120、180 和240 min 取3 mL浸提液用于測(cè)定其在λ664和λ647波長(zhǎng)下的吸收值（A664和A647），測(cè)定后浸提液均倒回至相應(yīng)的樣品瓶中，每種處理均做3 個(gè)重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均以指標(biāo)平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。單因素方差分析用于比較處理間的蠟質(zhì)含量、相對(duì)含水量、葉片失水率以及葉綠素浸提率指標(biāo)（SPSS 17.0）。根據(jù)最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)顯著性（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子引發(fā)對(duì)高粱葉角質(zhì)層蠟質(zhì)總量的影響

高粱從苗期到成熟期，引發(fā)處理植株葉片蠟質(zhì)含量均呈增加趨勢(shì)（圖2）。2020 年，苗期H2O、PEG、SA、ABA與GA 引發(fā)處理的蠟質(zhì)總量較對(duì)照分別增加了24.7%，57.6%，50.8%、80.3%和36.7%（圖2A）。除水引發(fā)外，其他處理均達(dá)到顯著水平。拔節(jié)期，PEG 引發(fā)處理的蠟質(zhì)總量較對(duì)照增加了12.0%，而SA 與ABA 引發(fā)處理的蠟質(zhì)總量較對(duì)照分別顯著下降了32.2%和25.8%（圖2B）。抽穗期，ABA 引發(fā)處理的蠟質(zhì)總量較對(duì)照顯著增加了38.6%（圖2C）。成熟期，PEG、SA 與ABA 引發(fā)處理的蠟質(zhì)總量較對(duì)照分別顯著增加了33.5%，26.3%和37.0%（圖2D）。2021 年，苗期PEG、SA、ABA 引發(fā)的蠟質(zhì)總量仍顯著高于對(duì)照，與2020 年的各引發(fā)處理蠟質(zhì)總量變化情況一致（圖2E）；拔節(jié)期H2O、PEG、SA 引發(fā)的蠟質(zhì)總量顯著高于對(duì)照（圖2F）；抽穗期與成熟期各引發(fā)處理蠟質(zhì)總量無(wú)顯著變化（圖2G，H）。因此，不同年份間，僅PEG 與ABA 引發(fā)對(duì)角質(zhì)層蠟質(zhì)含量的影響效果一致，影響效果最長(zhǎng)且存在跨代效應(yīng)。

圖2 種子引發(fā)對(duì)高粱葉片角質(zhì)層蠟質(zhì)總量的影響Fig.2 Effects of different seed priming on total contents of leaf wax

2.2 種子引發(fā)對(duì)高粱葉角質(zhì)層蠟質(zhì)組分的影響

2.2.1烷烴 除ABA 引發(fā)成熟期烷烴含量低于抽穗期外，其他引發(fā)處理烷烴含量均隨著生育期的推進(jìn)一直增加（圖3）。種子引發(fā)對(duì)高粱葉片烷烴含量有顯著影響，但其效果在引發(fā)處理間存在差異（圖3）。具體為ABA引發(fā)可顯著增加苗期、抽穗期的烷烴總量，PEG 引發(fā)則顯著增加拔節(jié)期烷烴總量，SA 引發(fā)僅增加2020 年成熟期烷烴總量。此外，與對(duì)照相比，引發(fā)顯著影響C27~C35烷的相對(duì)豐度。苗期，除H2O 引發(fā)外，各引發(fā)處理均可增加C29與C33烷烴的相對(duì)豐度（圖4A）。抽穗期，ABA 引發(fā)顯著增加C27烷相對(duì)豐度（圖4C）；成熟期，PEG 引發(fā)顯著增加了C35烷相對(duì)豐度，ABA 引發(fā)顯著增加了C27烷相對(duì)豐度（圖4D）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PEG 引發(fā)較激素引發(fā)顯著增加了C31、C33與C35烷相對(duì)豐度（圖4D）。2021 年，PEG 引發(fā)顯著增加拔節(jié)期烷烴總量及C27烷相對(duì)豐度（圖3F 和圖4F），ABA 引發(fā)顯著增加抽穗期烷烴總量（圖3G）。因此，僅PEG 與ABA 引發(fā)對(duì)烷烴含量及碳鏈組分的影響存在跨代效應(yīng)（圖3 和圖4）。

圖3 種子引發(fā)對(duì)高粱烷烴含量的影響Fig.3 Effects of different seed priming on total contents of alkanes

圖4 種子引發(fā)對(duì)高粱不同碳鏈烷烴相對(duì)豐度的影響Fig.4 Effects of different seed priming on the relative abundance of alkanes with different carbon chain of alkanes

2.2.2醇 2020 年從高粱苗期到成熟期，各引發(fā)處理醇含量呈增加趨勢(shì)，而2021 年成熟期醇含量則低于抽穗期含量（圖5）。同一生長(zhǎng)期，種子引發(fā)對(duì)高粱葉片醇含量及C28醇相對(duì)豐度有顯著影響（圖5）。2020 年，PEG、SA與ABA 引發(fā)均可顯著增加成熟期醇含量，而對(duì)其他生長(zhǎng)期醇含量的影響因引發(fā)處理不同而不同（圖5A~D）。此外從苗期到拔節(jié)期，除H2O 引發(fā)外，其他引發(fā)均可增加C28醇的相對(duì)豐度且拔節(jié)期達(dá)顯著水平（圖5I，J）。成熟期，PEG 引發(fā)顯著增加C32醇相對(duì)豐度，SA、ABA 與GA 較PEG 引發(fā)增加了C28醇相對(duì)豐度，其中SA 與GA 引發(fā)達(dá)顯著水平（圖5L）。2021 年，PEG 與ABA 引發(fā)仍顯著增加了苗期醇含量（圖5E），但對(duì)不同碳鏈醇相對(duì)豐度無(wú)顯著影響（圖5M~P）。

圖5 種子引發(fā)對(duì)高粱蠟質(zhì)醇組分含量及其碳鏈分布的影響Fig.5 Effects of different seed priming on total contents of alcohols and carbon chain distribution

2.2.3醛 高粱從苗期到成熟期，葉片醛含量呈增加趨勢(shì)，PEG 引發(fā)與激素引發(fā)均顯著影響C28醛與C30醛的相對(duì)豐度（圖6）。同一生長(zhǎng)期，種子引發(fā)對(duì)高粱葉片醛含量同樣存在顯著影響（圖6）。2020 年苗期，除水引發(fā)外，其余引發(fā)處理均顯著增加了醛含量（圖6A）。與對(duì)照相比，PEG 引發(fā)顯著增加了C30醛相對(duì)豐度（圖6I）。拔節(jié)期，激素引發(fā)顯著降低醛含量卻顯著增加了C28與C30醛相對(duì)豐度（圖6J）。抽穗期，引發(fā)對(duì)不同醛含量及其鏈長(zhǎng)分布無(wú)顯著影響，除ABA 引發(fā)醛優(yōu)勢(shì)鏈長(zhǎng)從C28轉(zhuǎn)變?yōu)镃30（圖6K）。成熟期，與對(duì)照相比，PEG 與ABA 引發(fā)顯著增加了醛總量（圖6D），PEG 引發(fā)還顯著增加了C28醛相對(duì)豐度（圖6L）。2021 年，引發(fā)對(duì)高粱葉片醛含量及醛鏈長(zhǎng)分布無(wú)顯著影響。因此，引發(fā)對(duì)醛含量影響不存在跨代效應(yīng)。

圖6 種子引發(fā)對(duì)高粱蠟質(zhì)醛組分及其碳鏈分布的影響Fig.6 Effects of different seed priming on total contents of aldehydes and carbon chain distribution

2.2.4三萜類組分 高粱葉片三萜類組分主要包括香樹(shù)脂醇與羊毛甾醇（圖7）。2020 年，苗期僅ABA 引發(fā)顯著降低香樹(shù)脂醇含量（圖7A）；拔節(jié)期，僅PEG 引發(fā)顯著增加香樹(shù)脂醇含量（圖7B）；抽穗期，ABA 引發(fā)顯著增加香樹(shù)脂醇含量（圖7C）；成熟期，激素引發(fā)顯著降低香樹(shù)脂醇含量（圖7D）。2021 年，引發(fā)處理對(duì)香樹(shù)脂醇含量無(wú)顯著影響。2020 年，H2O 引發(fā)顯著增加了拔節(jié)期與抽穗期的羊毛甾醇含量（圖7J，K），SA 與ABA 引發(fā)顯著增加了成熟期羊毛甾醇含量（圖7L）。2021 年，引發(fā)處理對(duì)羊毛甾醇含量無(wú)顯著影響。綜上所述，與烷、醇、醛含量一致，從苗期到成熟期三萜類組分含量呈增加趨勢(shì)。

圖7 種子引發(fā)對(duì)高粱蠟質(zhì)三萜類組分的影響Fig.7 Effects of different seed priming on total contents of triterpenoids

2.3 種子引發(fā)對(duì)葉片水分與葉綠素的影響

種子引發(fā)可增加高粱不同生長(zhǎng)期的葉片含水量（圖8A）。不同生長(zhǎng)期各引發(fā)處理失水率從高到低分別為：苗期，H2O>CK>PEG、SA、ABA、GA（圖8B）；拔節(jié)期，H2O>GA>CK>SA>PEG>ABA（圖8C）；抽穗期，SA>GA>CK、H2O、ABA>PEG（圖8D）；成熟期，GA>CK>H2O>SA、ABA>PEG（圖8E）?？傊吡好缙凇喂?jié)期與成熟期除H2O 與GA 引發(fā)外，PEG、SA 與ABA 引發(fā)處理的失水率一直低于對(duì)照。

圖8 引發(fā)處理對(duì)葉片相對(duì)含水量及失水率的影響Fig.8 Effects on relative water content and water loss rate of seed priming

種子引發(fā)可顯著影響高粱不同生長(zhǎng)期葉片的葉綠素含量（圖9A）。苗期到拔節(jié)期，PEG 與SA 可顯著增加葉綠素含量，ABA 僅顯著增加苗期葉綠素含量，而抽穗期與成熟期則顯著降低葉綠素含量（圖9A）。對(duì)葉綠素浸提率的分析發(fā)現(xiàn)，不同生長(zhǎng)階段各引發(fā)處理浸提率從高到低分別為，苗期，CK>H2O>SA、GA>PEG、ABA（圖9B）；拔節(jié)期，CK>H2O>SA、GA、PEG、ABA（圖9C）；抽穗期，CK、PEG>GA、SA>H2O>ABA（圖9D）；成熟期，CK>H2O、GA>PEG>SA、ABA（圖9E）。總之，各引發(fā)處理均可降低葉綠素浸提率，特別是ABA 引發(fā)，說(shuō)明引發(fā)處理可增加葉片細(xì)胞膜穩(wěn)定性。

圖9 引發(fā)處理對(duì)高粱葉片葉綠素含量及葉綠素浸提率的影響Fig.9 Effects on chlorophyll content and extraction rate of seed priming

3 討論

3.1 種子引發(fā)改變高粱葉片蠟質(zhì)及其組分含量

角質(zhì)層蠟質(zhì)是植物脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，覆蓋于植物表面抵御外界脅迫［14］。本研究中，種子引發(fā)顯著增加不同生長(zhǎng)期高粱葉片蠟質(zhì)總量，表明引發(fā)可在高粱角質(zhì)層響應(yīng)其生長(zhǎng)期環(huán)境變化時(shí)發(fā)揮作用［17］。據(jù)報(bào)道，種子引發(fā)也可產(chǎn)生長(zhǎng)期或跨代記憶以響應(yīng)生長(zhǎng)期間遭遇的環(huán)境脅迫，如鹽脅迫等［36-37］。因此，引發(fā)同樣可增加角質(zhì)層蠟質(zhì)含量以響應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間干旱［36，38］。值得注意的是，種子引發(fā)對(duì)蠟質(zhì)總量及組分含量存在年際效應(yīng)，證明引發(fā)效應(yīng)也可產(chǎn)生跨代“記憶”。但具體存在跨代效應(yīng)的分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

研究表明，植物會(huì)改變蠟質(zhì)組分以響應(yīng)外界環(huán)境［39-40］。本研究中，種子引發(fā)可改變烷烴、醇及醛成分的總量及各組分不同碳鏈組分的相對(duì)豐度。這說(shuō)明種子引發(fā)影響了蠟質(zhì)基因的表達(dá)，從而影響蠟質(zhì)沉積。如CER1是合成烷烴的關(guān)鍵基因［41］，脂肪酰輔酶A 還原酶（fatty acyl CoA reductase，F(xiàn)AR）是脂肪醇還原所需的重要酶［42］，種子引發(fā)后幼苗蠟質(zhì)組分及相對(duì)豐度變化可能與這些基因的表達(dá)存在差異有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，PEG、SA、ABA 對(duì)蠟質(zhì)組分影響程度不一致，說(shuō)明不同引發(fā)處理作用于不同蠟質(zhì)合成過(guò)程，參與的調(diào)控途徑各不相同。如顯著提高烷烴或醛含量，表明引發(fā)主要作用于脫羰基途徑，醇含量的增加表明引發(fā)主要影響?；€原途徑［43］。本研究中，PEG 引發(fā)顯著增加C27烷烴與C28醛相對(duì)豐度，顯著降低C29烷與C28醇相對(duì)豐度，說(shuō)明PEG 引發(fā)將更多長(zhǎng)鏈脂肪酸前體從?；€原途徑轉(zhuǎn)化為脫羰基途徑，相對(duì)促進(jìn)了烷烴的生物合成［44］。另外，PEG 引發(fā)與激素引發(fā)作用機(jī)理也不同，PEG 引發(fā)主要影響細(xì)胞膜滲透水平，激素引發(fā)則對(duì)細(xì)胞的離子運(yùn)輸發(fā)揮作用，這同樣可導(dǎo)致PEG 引發(fā)與ABA 引發(fā)對(duì)蠟質(zhì)組分影響的不一致?？傊l(fā)可能通過(guò)影響參與不同蠟質(zhì)合成途徑的基因表達(dá)進(jìn)而改變高粱蠟質(zhì)及其組分含量。

3.2 種子引發(fā)改變蠟質(zhì)含量及組分，提高角質(zhì)層抗性

角質(zhì)層蠟質(zhì)組分的改變與其功能變化相關(guān)。蠟質(zhì)及其組分含量增加的同時(shí)高粱葉片失水率下降，葉片含水量增加，說(shuō)明蠟質(zhì)可有效防止水分散失。研究表明，蠟質(zhì)組分隨環(huán)境變化而變化［39，45］，其中烷烴是蠟質(zhì)組分中保水最有效的部分［46］。這表明水分散失不僅受蠟質(zhì)含量影響，也與其組分顯著相關(guān)。本研究中，種子引發(fā)特別是PEG、SA 與ABA 引發(fā)顯著增加了低極性組分如烷烴、醛的含量。同時(shí)，C27~C33烷與C28醛相對(duì)豐度的增加表明引發(fā)主要促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的伸長(zhǎng)，以減少葉片水分損失。此外，角質(zhì)層蠟質(zhì)組分烷烴及醛含量的下降可顯著增加葉片葉綠素浸提率，使植物抗旱性降低［47］。本研究中，PEG、SA 與ABA 引發(fā)同樣增加了烷烴及醛含量，從而降低了高粱葉綠素浸提率。這表明引發(fā)顯著降低高粱葉片質(zhì)膜透性，使角質(zhì)層抗性增加及細(xì)胞膜受環(huán)境脅迫傷害程度降低［48］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，引發(fā)處理后葉片相對(duì)含水量也顯著增加。而葉片水分含量與植物光合作用密切相關(guān)［46-47］，說(shuō)明引發(fā)有利于高粱生物量的積累。與光合作用密切相關(guān)的葉綠素也受引發(fā)影響。引發(fā)處理可增加苗期與拔節(jié)期葉綠素含量，卻降低抽穗期與成熟期的葉綠素含量。綜上所述，PEG、SA 與ABA 引發(fā)可通過(guò)影響蠟質(zhì)合成從而提高角質(zhì)層的抗性。

激素引發(fā)顯著增加高粱葉片蠟質(zhì)積累，這與施加外源激素對(duì)植物蠟質(zhì)的影響作用一致［49］。PEG 引發(fā)與激素引發(fā)對(duì)蠟質(zhì)總量與高粱抗性具有同樣的效果，可增加約50%的蠟質(zhì)總量。這可能是由于PEG 引發(fā)對(duì)高粱產(chǎn)生滲透脅迫，打破植物體內(nèi)激素平衡，進(jìn)而誘導(dǎo)蠟質(zhì)基因表達(dá)［45］。但其具體影響機(jī)制異同仍需進(jìn)一步研究。

總之，種子引發(fā)可增加高粱不同生育期角質(zhì)層蠟質(zhì)及其優(yōu)勢(shì)組分含量，增加葉片含水量，降低角質(zhì)層失水率及葉綠素浸提率，從而增加各生長(zhǎng)期抗性。更重要的是，種子引發(fā)具有跨代“記憶”，但其機(jī)制需進(jìn)一步研究。