菊粉在快速檢測飼料大腸菌群試紙片中的應(yīng)用

孫丙坤，張 萌，王殷霞，李 寧，喬 藝，解瑞寧，王文軍，姜 建*

（1.濟寧醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，山東濟寧 272013；2.濟寧醫(yī)學(xué)院 護理學(xué)院，山東濟寧 272013）

細菌在自然界分布廣泛，很多細菌對人們的生產(chǎn)生活至關(guān)重要。隨著社會的發(fā)展，飼料安全衛(wèi)生越來越受到廣大人民群眾的重視，而單位體積內(nèi)的大腸菌群數(shù)量又是判別飼料是否安全衛(wèi)生的一個重要指標(biāo)（Tominaga，2019；郭佳琦，2018）。

菊粉一直被認為是難降解的碳水化合物之一，其最早是在植物中提取出來的，是植物儲備性碳水化合物。在天然植物中，菊芋中的菊粉含量最高，菊粉也因此得名（馬草，2021）。由于菊粉在水中的溶解度較高，可以加入到不同細菌培養(yǎng)基中且不影響培養(yǎng)基的組分，不會產(chǎn)生沉淀等問題（黃興成等，2020）；與此同時，把菊粉添加到培養(yǎng)基中會選擇性的促進相關(guān)菌群增值（徐靜靜，2021）。因此，利用菊粉可以選擇性的對菌群進行增殖這一特點（曾文靜，2021），把菊粉加入到大腸菌群檢測試劑中，以期提高大腸菌群快速檢測試紙片的靈敏度。大腸菌群快速檢測紙片可以快速、簡便的鑒定和分析飼料中大腸菌群的數(shù)量（Alles等，2018）。飼料中大腸菌群一旦超標(biāo)，會丟失飼料的營養(yǎng)成分，從而失去價值。畜禽食用微生物超標(biāo)嚴重的飼料容易患痢疾等腸道疾病，可能引起嘔吐、腹瀉等癥狀，危害畜禽健康（Grigori等，2018）。

本文評價菊粉在大腸菌群試紙片中的相關(guān)作用，以期提高大腸菌群試紙片的靈敏度和準(zhǔn)確性，為大腸菌群試紙片在飼料安全快速檢測領(lǐng)域中的運用奠定一定的基礎(chǔ)（唐漪靈等，2000）。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑原料：大腸埃希氏菌ATCC25922、大腸埃希氏菌BNCC-336902：為實驗室保留菌種，濟寧醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院飼料安全技術(shù)教研室提供；5cm×5cm濾紙片若干：杭州市富陽北木漿紙有限公司、撫順市民政濾紙廠、美國伯樂Bio-Rad公司；3號自封袋（7×10×12）：浙江亞峰包裝有限公司；400目304不銹鋼濾網(wǎng)（30 um孔距）：江蘇蕾蔻金屬制品公司。

試劑：牛肉膏（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；胰蛋白胨（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；氯 化 三 苯 四 氮 唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；菊粉（食品級，上海如吉生物科技發(fā)展有限公司）；飼料（河南聯(lián)合英偉飼料有限公司）；高壓滅菌水。

1.2 儀器與設(shè)備LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；JA3003N電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；PYL-70恒溫培養(yǎng)箱（天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備公司）；凈SW-CJ-2FD化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；HNY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器（天津市歐諾儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 大腸菌群懸液的制備 利用實驗室保留菌種大腸埃希氏菌ATCC25922、大腸埃希氏菌BNCC-336902單菌落分別接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)24 h后為大腸菌群懸液。將大腸菌群懸液進行過梯度稀釋后，將兩株大腸埃希氏菌按照1：1比例混合，最終稀釋為100 CFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)菌懸液，此濃度菌液為大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)懸液。

1.3.2 濾紙片的篩選 快速檢測紙片法是將選擇性培養(yǎng)基和目標(biāo)菌株的顯色底物混合后依附于濾紙片上，制成檢測紙片，菌體通過吸收濾紙片的培養(yǎng)基從而生長繁殖，濾紙片的種類決定培養(yǎng)基吸附量，最終決定紙片的顯色程度。

1.3.3 試紙片制備條件的確定

1.3.3.1 試紙片制備時間的確定 將培養(yǎng)基內(nèi)分別加入適量的溴甲酚紫母液和TTC母液，使溴甲酚紫溶液和TTC溶液的終濃度分別為80和90 mg/L?；旌暇鶆蚝?，浸泡滅菌過的濾紙片數(shù)分鐘，小風(fēng)烘干 2、4、6、8 h，裝至自封袋內(nèi)備用。

1.3.3.2 TCC濃度的確定 取上述1.3.3.1中的培養(yǎng)基分別加入適量的溴甲酚紫母液，使溴甲酚紫溶液終濃度為80 mg/L，TTC的最終濃度分別為 66、133、266、327 mg/L。

1.3.3.3 菊粉添加量的確定 將培養(yǎng)基分別加入適量的溴甲酚紫母液和TTC母液，使得溴甲酚紫溶液和TTC溶液的終濃度分別為80和133 mg/L。按照比例加入菊粉，使得菊粉終濃度為 0‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰進行添加。

1.3.4 大腸菌群試紙片的性能評價

1.3.4.1 試紙片重復(fù)度評價 將陽性大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌懸液分別添加到3個大腸菌群試紙片中，使待測樣品終濃度保持在10～200 CFU/mL之間，每個稀釋度3張試紙片，試紙片過夜培養(yǎng)后，根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18869-2019飼料中大腸菌群的測定（劉德陽等，2013），查附錄D中的大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表進行記錄。

1.3.4.2 試紙片準(zhǔn)確度評價 將陽性大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌懸液稀釋到102CFU/mL后，分別隨機添加到全價飼料、豬濃縮飼料、產(chǎn)蛋雞濃縮飼料等5種飼料中，將待測樣本進行 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度稀釋，挑選3個合適的稀釋度，利用國標(biāo)法、本實驗室研發(fā)大腸菌群試紙片法和市售大腸菌群試紙片進行菌落計數(shù)，最后進行統(tǒng)計分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 本試驗使用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，靈敏度檢測結(jié)果采用t檢驗，以P＜0.05表示差異顯著（李恒等，2020）。

2 結(jié)果與分析

2.1 試紙片制備條件由表1可知，選用的濾紙材料為慢速厚濾紙。試紙片干燥2 h時，由于干燥時間短，試紙片陽性菌落出現(xiàn)嚴重蔓延，無法識別。隨著干燥時間的延長，試紙片性能非常穩(wěn)定，試紙片最佳的干燥時間為6 h。TTC濃度在66～327mg/L范圍內(nèi)，在同一稀釋倍數(shù)下，菌落總數(shù)最多（表2）。因此，細菌總數(shù)檢測紙片法的最佳濃度約為133 mg/L。

表1 同濾紙大腸菌群菌落數(shù)量（CFU）

表2 TTC最佳濃度的確定 mg/L

2.2 不同菊粉濃度對大腸菌群試紙片的影響由圖1可知，菊粉添加量分別為0‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰的質(zhì)量體積比。菊粉可以在試紙片表面形成一層凝膠，可讓試紙片更好的發(fā)揮作用。由圖2可知，添加菊粉的大腸菌群試紙片靈敏度明顯高于沒有添加菊粉的大腸菌群試紙片，試紙片加入菊粉后，菊粉本身具有一定的凝膠作用，紙片由于吸附培養(yǎng)基較多，營養(yǎng)充足，可以使更多的大腸菌群形成紅色斑點，當(dāng)添加菊粉后，紅點較多且較大。隨著菊粉添加量逐漸增加，菊粉本身對大腸菌群有一定的抑制作用，試紙片中的菌落數(shù)又有所降低。

圖2 不同菊粉濃度對試紙片的影響

2.3 大腸菌群試紙片的重復(fù)度和準(zhǔn)確度評價對大腸菌群試紙片進行10次重復(fù)試驗，加入菊粉的大腸菌群試紙片重復(fù)度很好，最終樣品中的大腸菌群MPN值很穩(wěn)定。根據(jù)大腸菌群試紙片的準(zhǔn)確度評價，表3中自研的大腸菌群試紙片與市場中的3M大腸菌群試紙片進行比較，加入菊粉的大腸菌群試紙片在陽性樣本檢出率明顯高于3M PetrifilmTM品牌。對比國標(biāo)發(fā)酵管法，在檢測全價飼料、豬濃縮飼料中的準(zhǔn)確度達100%。與國標(biāo)發(fā)酵管法相比，55個陽性樣本中檢測一致的是52個，符合率為94.5%。

表3 大腸菌群試紙片準(zhǔn)確度評價結(jié)果

3 討論

本次研發(fā)的大腸菌群試紙片是以濾紙吸收培養(yǎng)基、凝膠、指示劑為載體，通過培養(yǎng)細菌顯色來檢測樣品中的微生物。在生產(chǎn)工藝方面探索了濾紙種類對大腸菌群試紙片的影響，發(fā)現(xiàn)慢性厚濾紙片是培養(yǎng)基最好的吸附載體。在培養(yǎng)基組分方面，試紙片中添加菊粉后，試紙片的靈敏度有較大幅度的提升，由于菊粉本身具有一定的凝膠作用，會使紅點不易暈開，又由于菊粉的加入使得紙片吸附更多的培養(yǎng)基，導(dǎo)致紙片上營養(yǎng)充足，可以讓更多的大腸菌群形成紅色斑點。在實際檢測過程中，經(jīng)過多次優(yōu)化，確定1 mL為最佳加樣量。按照試紙片正常的生產(chǎn)程序，本次添加了菊粉的紙片存放9個月仍不失效，故紙片保質(zhì)期在6個月。

4 結(jié)論

大腸菌群試紙片分別在生產(chǎn)工藝和培養(yǎng)基組分這兩個方面進行改進，發(fā)現(xiàn)菊粉添加到大腸菌群試紙片中可以明顯提高飼料大腸菌群試紙片的靈敏度和準(zhǔn)確性，與市面大腸菌群試紙片相比，加入菊粉后試紙片陽性飼料樣本檢出率明顯提高，符合率達94.5%。