正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選黑曲霉發(fā)酵柴胡黃芩藥對(duì)的發(fā)酵工藝

田 健，孟凡娟，白健琳，郭遠(yuǎn)達(dá)，曲雁斌，金宇昕

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2.吉林省婦幼保健院，吉林 長(zhǎng)春 130061)

柴胡、黃芩是歷代醫(yī)家廣為應(yīng)用的臨床“藥對(duì)”之一，是最具代表臨床效驗(yàn)方。柴胡是吉林省道地藥材，黃芩主產(chǎn)區(qū)為長(zhǎng)白山。黃芩是多年生草本植物，具有清熱抗菌、消炎[1]、抗氧化[2]等功效[3-4]。柴胡為常用的解表藥，具有和解表里的功效，通常用于治療感冒發(fā)熱、肝郁氣滯等癥狀。大量研究表明，柴胡中的有效成分可以保護(hù)肝臟[5]，具有抗氧化、抗炎[6]、抗菌以及抗腫瘤[7]等作用[8-9]。作為經(jīng)典古方，柴黃藥對(duì)有顯著的疾病防治作用，是最具代表意義的基本配伍組成，并且在藥理實(shí)驗(yàn)中表明，對(duì)于緩解肝損傷、抗病毒、抗肝纖維化、解熱、抗病毒、治療肝癌、抗癲癇和利膽等方面具有較好的療效[10]。

黑曲霉是一種能產(chǎn)生水解酶、淀粉酶、鞣酸酶、果膠酶等的真菌，它能破壞植物細(xì)胞壁，釋放營養(yǎng)物質(zhì)。該菌種生長(zhǎng)旺盛，發(fā)酵周期短，可以降低發(fā)酵周期，提高發(fā)酵速率。將黑曲霉與柴胡、黃芩進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，由于黑曲霉可以產(chǎn)生果膠酶等酶破壞植物細(xì)胞壁，所以既保持黑曲霉產(chǎn)酶特性，又提高了柴胡黃芩活性成分的提取率，減少藥材浪費(fèi)，降低生產(chǎn)成本。

在發(fā)酵工藝方面，本實(shí)驗(yàn)采用的是固體發(fā)酵。固體發(fā)酵具有發(fā)酵培養(yǎng)基原料來源廣泛、操作簡(jiǎn)單、環(huán)境污染小等優(yōu)質(zhì)特點(diǎn)[11]。應(yīng)用現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù)與中藥資源有機(jī)結(jié)合，利用藥用真菌生物轉(zhuǎn)化中藥中的活性成分，使得菌株的轉(zhuǎn)化過程具有“雙向性”，為疾病的預(yù)防和治療以及藥品研發(fā)做出巨大貢獻(xiàn)[12]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試藥與儀器

柴胡藥材(批號(hào)：20201001)、黃芩藥材(批號(hào)：20190601)，均購自吉林國安藥業(yè)有限公司，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)肖井雷副教授鑒定符合《中國藥典》2020年版一部項(xiàng)下規(guī)定。黑曲霉(編號(hào)：0A1004)、蘆丁對(duì)照品(批號(hào): 100080-201811，中國食品藥品檢定研究院)、純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；乙醇(北京化工廠)；其他試劑均為分析純。

AB135-S型分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；KQ-250型超聲波處理器(昆山市超聲儀器有限公司)；SW-CJ-LFD型超凈工作臺(tái)(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；DPS-9162B-2型恒溫培養(yǎng)箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；SPX-2250BF-2型搖床培養(yǎng)箱(上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，T6型紫外分光光度(普析通用有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品的制備

精確稱取105℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇溶解后定容至刻度，配制成0.2 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備

將柴胡黃芩藥對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粉碎過60目篩，稱取10 g發(fā)酵產(chǎn)物粉末至于50 mL的具塞錐形瓶中，加入60%乙醇40 mL后密封，置于超聲提取器中提取1 h。將提取液以12 000 r/min高速離心10 min，取上清液，即供試品溶液，保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法進(jìn)行顯色反應(yīng)。分別精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2 mL于5mL容量瓶中，分別加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，放置6 min，再加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液1 mL，靜置6 min，并用60%乙醇水溶液定容至刻度，搖勻。通過紫外-可見分光光度法于510 nm處測(cè)定吸光度值，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為Y=10.595X-0.004，R2=0.999 6，表明在 0～0.8 mg/mL 之間呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 精密度試驗(yàn)

用移液管精密吸取對(duì)照品溶液，依NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色后，通過紫外-可見分光光度法連續(xù)測(cè)6次吸光度值，計(jì)算得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.20%，表明該方法精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一批柴胡黃芩發(fā)酵產(chǎn)物粉末，分成6份，在室溫下分別放置0、2、4、8、12、24 h，按照“1.2.2”配制供試品溶液的方法，依法顯色，對(duì)柴胡黃芩藥對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物溶液進(jìn)行含量測(cè)定，通過紫外-可見分光光度法測(cè)吸光度值，計(jì)算得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.89%，結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下此方法穩(wěn)定性良好，并且在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批柴胡黃芩藥對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粉末，分成6份，將按照前文1.2.2供試品溶液制備的方法，依法顯色后，對(duì)柴胡黃芩發(fā)酵產(chǎn)物溶液的含量進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)過紫外-可見分光光度法測(cè)吸光度值，計(jì)算得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.40%，從結(jié)果可看出，含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取已知含量的柴胡黃芩發(fā)酵產(chǎn)物6份，精密加入與樣品中含量相等的蘆丁對(duì)照品，按照“1.2.2”將其制備成供試品溶液，依法顯色后，經(jīng)過紫外-可見分光光度法測(cè)吸光度值，計(jì)算得出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.88%，平均回收率為100.50%，從結(jié)果中可看出，該方法回收率良好。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選發(fā)酵工藝

以發(fā)酵后柴胡黃芩藥對(duì)中有效成分提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)選提取工藝條件。預(yù)實(shí)驗(yàn)影響柴胡-黃芩固體發(fā)酵主要因素為：初始含水量A；發(fā)酵溫度B；液料比C，每個(gè)因素選擇三個(gè)水平，采用 L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

根據(jù)因素水平表，通過L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)法，按照柴胡黃芩固體發(fā)酵方法培養(yǎng)，稱取柴胡黃芩藥材各25 g，加入柴胡黃芩總重量0.5%的CaCO3混合均勻，置于250 mL三角瓶中，分別加入20 mL、25 mL、30 mL的水，至高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、0.1 MPa滅菌60 min。滅菌后，至無菌操作臺(tái)上，將黑曲霉搖瓶種子液25 mL、50 mL、75 mL分別接種至滅菌后的三角瓶中，并將其分別放在24℃、28℃、32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10天后，取出發(fā)酵好的柴胡黃芩，滅活后烘干，含量測(cè)定。結(jié)果見表2和表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)的 L9(34) 表及實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

表3 發(fā)酵條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析

通過表2、表3的方差分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的順序依次為C>B>A，即液料比是顯著的影響因素，發(fā)酵溫度是次要影響因素，初始含水量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小。從各因素水平(K值分析) 并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際情況及實(shí)驗(yàn)操作，綜合以上分析結(jié)果，可以確定最佳的發(fā)酵條件為A1B2C2，即加入柴胡黃芩總重量0.5%的CaCO3混合均勻，置于250 mL三角瓶中，加入柴胡黃芩總重量40%的水。至高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、0.1 MPa、60 min進(jìn)行滅菌。滅菌后，至無菌操作臺(tái)上，柴胡黃芩總重量與黑曲霉搖瓶種子液按1∶1加入三角瓶中發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28℃。

2.3 最佳工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取柴胡黃芩各25 g，按本實(shí)驗(yàn)得出的最佳工藝方法：加入柴胡黃芩總重量0.5%的CaCO3混合均勻，置于250 mL三角瓶中，加入柴胡黃芩總重量40%的水。至高壓蒸汽滅菌鍋中121℃、0.1 MPa、60 min進(jìn)行滅菌。滅菌后，至無菌操作臺(tái)上，柴胡黃芩總重量與黑曲霉搖瓶種子液按1∶1加入三角瓶中發(fā)酵，發(fā)酵溫度為28℃。進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，測(cè)定樣品的總黃酮含量。結(jié)果說明三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合評(píng)分最高。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.26%，說明最佳發(fā)酵工藝條件穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)采用不同波長(zhǎng)對(duì)黑曲霉發(fā)酵柴胡黃芩藥對(duì)中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，參考《中華人民共和國藥典》2020 年版和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13-17]，同時(shí)考察了供試品溶液在271 nm、278 nm、415 nm、510 nm 處的待測(cè)成分吸收情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在510 nm處總黃酮具有良好的吸收。

通過正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)液料比、發(fā)酵溫度、含水量3個(gè)因素進(jìn)行考察，以總黃酮作為指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)，確定了發(fā)酵柴胡黃芩藥對(duì)的最佳工藝。黑曲霉發(fā)酵柴胡黃芩藥對(duì)，可使藥對(duì)中有效成分明顯提高，既可增加柴胡黃芩藥對(duì)的利用率，又使柴黃藥對(duì)中的一些活性成分進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化，有利于柴胡黃芩藥對(duì)的活性研究。此次實(shí)驗(yàn)首次將黑曲霉運(yùn)用在柴胡黃芩藥對(duì)的生物轉(zhuǎn)化中，為藥對(duì)的發(fā)酵以及黑曲霉的發(fā)酵提供了新的想法，為后續(xù)開展柴胡黃芩藥對(duì)的生物轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，并促進(jìn)了中藥資源的可持續(xù)發(fā)展。