扇穗茅不同居群染色體數(shù)目及核型分析

楊 萍， 蘇 旭,3， 劉玉萍*， 王亞男， 胡夏宇， 陳金元

(1.青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 青海 西寧 810008； 2.青海師范大學(xué)青海省青藏高原藥用動植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008； 3.高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院， 青海 西寧 810016)

扇穗茅(Littledalearacemosa)是禾本科(Poaceae)雀麥族(Bromeae)扇穗茅屬(Littledalea)的一種高原特有疏叢短根莖禾草，主要分布于青藏高原及其毗鄰高山地區(qū)，僅有少部分居群處于鄰近的稍低海拔地區(qū)[1]。扇穗茅通常生長于高山草坡、河谷邊沙灘、灌叢草甸等極端環(huán)境下，是高山草甸的伴生種，具有較強(qiáng)的耐旱、耐寒、耐堿、耐貧瘠及抗病和抗風(fēng)沙能力[2]；同時，該物種具有相對發(fā)達(dá)的根系，是保土固沙的一種重要植物；營養(yǎng)價值較高，也是畜牧業(yè)上的優(yōu)良牧草[3]。目前，國內(nèi)外學(xué)者已對扇穗茅的形態(tài)特征、地理分布、分類修訂、葉綠體基因組特點(diǎn)及種質(zhì)資源等進(jìn)行了研究[3-6]。譬如，周勇輝等[6]采用廣義形態(tài)性狀將藏扇穗茅歸并到扇穗茅中，作為異名處理；劉玉萍等[3]通過Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，探討了扇穗茅的葉綠體基因組特點(diǎn)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，建立了雀麥族物種的標(biāo)準(zhǔn)測序流程，認(rèn)為其與小麥族(Triticeae)物種親緣關(guān)系較近。然而，目前從居群水平上對扇穗茅染色體的形態(tài)特征、核型參數(shù)及進(jìn)化關(guān)系的研究未見報道。

染色體是細(xì)胞遺傳物質(zhì)的載體[7]，其形態(tài)、數(shù)目和結(jié)構(gòu)往往受外界影響較小[8]，在植物生長發(fā)育和繁殖過程中具有較高的穩(wěn)定性。因此，通過對植物細(xì)胞染色體形態(tài)、數(shù)目、特征及核型參數(shù)的綜合分析，能夠有效探討不同物種或品種間的細(xì)胞學(xué)差異，從而闡明它們的起源和進(jìn)化關(guān)系，為今后植物物種界定、遺傳育種和新品種選育提供細(xì)胞學(xué)佐證[9]。迄今為止，許多學(xué)者采用植物染色體常規(guī)壓片技術(shù)對多種禾本科植物染色體核型的研究揭示了它們的相對進(jìn)化程度及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。譬如，張同林等[10]通過對小麥族披堿草屬(Elymus)、鵝觀草屬(Roegneria)和賴草屬(Leymus)共5個類群的核型分析，認(rèn)為賴草屬進(jìn)化程度最低、鵝觀草屬最高、披堿草屬介于兩者之間；楊慧芳[11]利用火焰干燥法對冰草(Agropyroncristatum)不同居群進(jìn)行了染色體制片并對核型作了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)冰草的中亞、東亞與青藏高原居群間以及歐洲與中亞居群間親緣較近，中亞居群起源較早且進(jìn)化較原始、歐洲居群起源相對較晚且進(jìn)化程度較高，認(rèn)為中亞是冰草的起源中心，染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目變異是對新環(huán)境的適應(yīng)；王亞男等[12]通過對沙鞭(Psammochloavillosa)6個不同居群染色體形態(tài)和核型的研究，發(fā)現(xiàn)沙鞭染色體數(shù)目恒定，有正中部著絲粒(Median point chromosome，M)、中部著絲粒(Median region chromosome，m)、近中部著絲粒(Submedian region cheomosome，sm)或近端部著絲粒(Subterminal region chromosome，st)4種類型，并推導(dǎo)了不同居群間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。據(jù)此，本研究采用染色體常規(guī)壓片技術(shù)，對扇穗茅6個自然地理居群的染色體數(shù)目、形態(tài)、核型參數(shù)等進(jìn)行系統(tǒng)分析；在此基礎(chǔ)上，探討不同居群間的核型差異和親緣關(guān)系，為扇穗茅系統(tǒng)進(jìn)化和優(yōu)良種質(zhì)資源篩選提供細(xì)胞學(xué)佐證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取扇穗茅6個自然地理居群的成熟種子為試驗(yàn)材料，具體采樣信息詳見表1。憑證標(biāo)本保存于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館(QTPMB)。

表1 試驗(yàn)材料及來源Table 1 Experimental materials and sources

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子萌發(fā) 從扇穗茅6個代表居群中挑選飽滿成熟的種子，且每個居群中選取10粒種子進(jìn)行萌發(fā)。首先將種子在—20℃冰箱中處理24 h，然后將其均勻放置于鋪有蒸餾水濕潤兩層濾紙的培養(yǎng)皿中[13]，隨后置于22℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)種子根長為0.5～1 cm時取樣預(yù)處理。

1.2.2預(yù)處理 預(yù)先將2.0 mL離心管用蒸餾水噴濕，保持管內(nèi)外濕潤；然后，將剪下的扇穗茅根尖放于其中，立即將盛有根尖的離心管置于充滿N2O的密封罐中處理130 min，壓強(qiáng)設(shè)置為0.75 MPa。

1.2.3固定與解離 從密封罐取出離心管，預(yù)處理的根尖迅速放入含卡諾氏固定液(95%酒精∶冰醋酸=3∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用)的離心管中，使根尖充分浸入固定液，隨后將離心管置于4℃冰箱中固定10 min以上，最后用45%乙酸解離5 min待用。

1.2.4制片、染色和觀察 解離好的根尖輕輕取出并放置于載玻片中央，用刀片切除多余部分僅保留根尖頂端分生組織，滴一滴改良的石炭酸品紅溶液，染色7～8 min后蓋上蓋玻片，用鑷子尖端輕輕敲擊使其充分均勻分散，迅速將載玻片放置于酒精燈上輕輕灼燒，待組織區(qū)域的液體蒸干后，用濾紙垂直向下按壓載玻片，保持細(xì)胞均勻分散，利用顯微鏡(Olympus BX53)觀察染色體的形態(tài)和數(shù)目，選取分散良好、形態(tài)清晰的染色體拍照[14]。

1.2.5數(shù)據(jù)分析 從扇穗茅每個居群中，選取10個分散良好、形態(tài)清晰、數(shù)目完整的染色體中期分裂圖拍照，同時進(jìn)行染色體形態(tài)觀察、數(shù)目統(tǒng)計(jì)及數(shù)據(jù)測量與分析。即采用Adobe Photoshop 2020軟件測量所有居群的染色體長臂與短臂長度[15]，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel軟件中統(tǒng)計(jì)分析；依據(jù)李懋學(xué)[16]方法計(jì)算染色體總長度、臂比(Arm ratio，AR)、相對長度(Relative length，RL)；基于這些數(shù)據(jù)進(jìn)行每個細(xì)胞同源染色體配對，統(tǒng)計(jì)同源染色體長臂和短臂平均值及總長度等參數(shù)，主要包括平均臂比(Mean arm ratio，MAR)、染色體長度比(Chromosome length ratio，CLR)、核不對稱系數(shù)(Karyotype asymmetry coefficient，As.K%)及臂比大于2∶1的染色體百分比(Chromosome proportion of arm ratio excess to 2)等，其中臂比大于2∶1的染色體百分比=臂比大于2的同源染色體數(shù)目/同源染色體組總數(shù);核不對稱系數(shù)=(染色體長臂總長/全組染色體總長)×100%；然后，根據(jù)同源染色體核型參數(shù)，按照相對長度從大到小排序、著絲點(diǎn)排列在同一直線上、短臂在上、長臂在下，利用Excel和Photoshop軟件繪制染色體核型圖。此外，本研究涉及的相對長度系數(shù)(Relative length coefficient，I.R.L)依據(jù)Kuo等[17]方法、核不對稱系數(shù)根據(jù)Arano[18]方法及核型分類依照Stebbins[19]方法進(jìn)行計(jì)算、統(tǒng)計(jì)和分析。

另外，參照邢世巖等[20]方法進(jìn)行核型進(jìn)化趨勢分析，利用Microsoft Excel 2010軟件繪制扇穗茅核型不對稱性程度散點(diǎn)圖，即核型二維進(jìn)化圖；同時，聚類分析依據(jù)李曉莉等[21]方法，采用SPSS 26軟件統(tǒng)計(jì)分析染色體臂比平均值與方差、相對長度方差、染色體長度比和正中部著絲粒(M)、中部著絲粒(m)、近中部著絲粒(sm)或近端部著絲粒(st)染色體比例等，進(jìn)行扇穗茅不同居群的染色體聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目與倍性鑒定

通過對扇穗茅中期分裂相的觀察和測量，發(fā)現(xiàn)扇穗茅染色體均為二倍體，數(shù)目較為穩(wěn)定，為2n=2x=28，不存在染色體數(shù)目和形態(tài)異?，F(xiàn)象(圖1)。

圖1 扇穗茅有絲分裂中期染色體Fig.1 Mitotic chromosomes in metaphase of L. racemosa注：A，P119；B，P120；C，P067，D；P83；E，P84；F，P94。下同Note:A:P119；B，P120；C，P067；D，P83；E，P84；F，P94. The same as below

2.2 不同居群染色體形態(tài)特征與類型分析

從扇穗茅每個參試居群中，各選取10個分散良好、數(shù)目清晰、形態(tài)完整的染色體中期分裂圖，依據(jù)每條染色體位置和參數(shù)進(jìn)行同源染色體配對，共獲得14對染色體，參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表2所示。

表2 扇穗茅不同居群染色體參數(shù)Table 2 Chromosome parameters of different populations in L. racemosa

續(xù)表2

由表2可知，扇穗茅居群119和居群84的染色體為中部著絲點(diǎn)(m)和近中部著絲點(diǎn)(sm)染色體，居群120，67，83和94的染色體均為中部著絲點(diǎn)染色體，并且中部著絲點(diǎn)染色體占比較高；同時，依據(jù)染色體相對長度系數(shù)和Kuo分類標(biāo)準(zhǔn)，扇穗茅不同居群的染色體可以被劃分為短染色體S型(<0.76)、中短染色體M1型(0.76～1.00)、中長染色體M2型(1.01～1.25)和長染色體L型(≥1.26)四種類型(表2)。

2.3 不同居群染色體核型分析

通過對扇穗茅不同居群中期分裂相染色體的統(tǒng)計(jì)分析，本研究獲得了染色體長度比、臂比大于2的比率、核型公式與類型、核不對稱系數(shù)等參數(shù)(表3)；同時，根據(jù)各居群同源染色體參數(shù)繪制了核型模式圖(圖2)。

表3 扇穗茅不同居群的核型比較Table 3 Karyotype comparison of different populations in L.racemosa

圖2 扇穗茅不同居群的染色體核型模式圖Fig.2 Chromosome idiograms of different populations in L. racemosa

由表3可知，扇穗茅6個居群的染色體核型類型有2A，1B和2B三種，其中居群120的染色體核型類型是2A型，居群67是1B型，其余4個居群是2B型；就扇穗茅染色體臂比而言，居群83的臂比范圍為1.32～1.55(圖2D)，平均臂比最大(1.44)，居群67和84的臂比范圍分別為1.25～1.28(圖2C)和1.19～1.35(圖2E)，平均臂比最小(1.27)，其余3個居群的平均臂比介于兩者之間(表3)；同樣，扇穗茅居群67的染色體核不對稱系數(shù)最小，為55.67，而居群83的核不對稱系數(shù)最大，為57.88，表明扇穗茅不同參試居群的染色體核型差異較大。

2.4 不同居群染色體核型進(jìn)化趨勢分析

以扇穗茅染色體的平均臂比為橫坐標(biāo)，以長度比和核不對稱系數(shù)為縱坐標(biāo)，分別繪制二維進(jìn)化趨勢圖(圖3)。結(jié)果表明，扇穗茅的染色體核型呈“雙向進(jìn)化趨勢”，如居群83的染色體沿平均臂比方向進(jìn)化較快，居群119的染色體則沿長度比方向進(jìn)化較快(圖3A)；然而，就染色體總體進(jìn)化趨勢而言，居群83的進(jìn)化程度較高，居群67的進(jìn)化程度較低(圖3A)。同時，通過對扇穗茅染色體平均臂比和核不對稱系數(shù)的分析，我們發(fā)現(xiàn)扇穗茅染色體的總體進(jìn)化趨勢沿二維圖右上角方向進(jìn)化，即右上方的居群往往具有較高的進(jìn)化程度，而左下方的居群進(jìn)化程度相對較低。其中，居群83的平均臂比與核不對稱系數(shù)最大，位于二維圖右上方，進(jìn)化程度較高；居群67的平均臂比與核不對稱系數(shù)最小，位于二維圖左下方，進(jìn)化程度較低(圖3B)。因此，本研究認(rèn)為扇穗茅居群83的起源較晚，進(jìn)化程度較高；居群67的起源較早，進(jìn)化程度較低。

圖3 扇穗茅不同居群染色體核型進(jìn)化趨勢Fig.3 Evolution trend of chromosome karyotypes in different populations of L. racemosa

2.5 不同居群染色體核型聚類分析

扇穗茅染色體核型的聚類分析結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳距離為25時，扇穗茅的6個參試居群聚為A和B兩大分支，其中居群119，120，94和83聚為A支，居群67和84聚為B支，每個分支上的居群間親緣關(guān)系相對較近，不同分支居群間則具有相對較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；當(dāng)遺傳距離約為11時，扇穗茅的6個參試居群則形成3個分支，其中居群119，120和94聚為一支，居群83單獨(dú)形成一支，居群67和84聚為一支，相比居群94，居群83與居群120和119則具有相對較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；當(dāng)遺傳距離約為1時，居群119和120優(yōu)先聚為一支，彼此間親緣關(guān)系相對最近。

圖4 扇穗茅不同居群染色體核型聚類分析Fig.4 Clustering analysis of chromosome karyotypes in different populations in L. racemosa

3 討論

研究表明，染色體作為遺傳物質(zhì)的載體，其數(shù)目、形態(tài)和結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，因而通過對植物染色體核型的綜合分析，不僅可以探究不同物種以及同一物種不同居群間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，而且也可為該物種的細(xì)胞學(xué)研究提供科學(xué)依據(jù)[22-23]。通過對扇穗茅6個不同地理居群染色體核型的比較分析，本研究發(fā)現(xiàn)扇穗茅所有居群的染色體均為二倍體、數(shù)目為28條(圖1)，然而染色體的相對長度、長度比、平均臂比等在扇穗茅的不同居群間卻存在一定差異。張建波等[24]基于川西北高原垂穗披堿草(Elymusnutans)12個居群染色體核型的研究，認(rèn)為地理氣候環(huán)境可以顯著影響植物染色體核型的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，其也是造成染色體形態(tài)多樣性的主要原因；王亞男等[12]通過對內(nèi)蒙古高原沙鞭6個居群染色體核型特征和進(jìn)化關(guān)系的分析，發(fā)現(xiàn)生長環(huán)境不同導(dǎo)致了沙鞭不同居群的染色體形態(tài)特征產(chǎn)生差異，并逐漸形成穩(wěn)定的生態(tài)型[25]。本研究中，扇穗茅的6個參試居群來自不同的地域，其分布的經(jīng)緯度和海拔高度存在差異(表1)，據(jù)此我們認(rèn)為扇穗茅6個參試居群的染色體形態(tài)差異也是由其地域分布和生態(tài)環(huán)境不同造成的，這與先前的研究結(jié)論是一致的[12,24-25]。

扇穗茅6個參試居群的染色體均為中部著絲點(diǎn)(m)和近中部著絲點(diǎn)(sm)染色體，其中中部著絲點(diǎn)染色體比例較高，這與先前報道的近緣種無芒雀麥(Bromusinermis)[26]和沙地雀麥(B.ircutensis)[27]的染色體核型類型相同。同時，通過對扇穗茅6個參試居群染色體核型的比較分析，本研究發(fā)現(xiàn)扇穗茅的染色體核型類型主要有2A,1B和2B三種，其中居群120是2A型、居群67是1B型、其余4個居群均為2B型(表3)，表明它們均具有較好的對稱性，與先前報道的無芒雀麥[28]、沙地雀麥[27]和扁穗雀麥(B.catharticus)[29]等的研究結(jié)果類似。Stebbins[19]認(rèn)為，植物染色體核型由對稱性向不對稱性進(jìn)化，對稱性越高染色體變異越小，進(jìn)化程度越低；反之，非對稱性越高染色體變異越大，進(jìn)化程度越高。因此，我們推測雀麥族植物可能是一個進(jìn)化上較為保守的類群，進(jìn)化水平相對較低；染色體形態(tài)和結(jié)構(gòu)差異可能是由其生長環(huán)境不同導(dǎo)致的。此外，植物進(jìn)化程度與其環(huán)境適應(yīng)性密切相關(guān)[30]，通常對環(huán)境適應(yīng)性越強(qiáng)的植物其進(jìn)化程度往往越高[31]。據(jù)此，我們推測扇穗茅的居群83理應(yīng)對環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，未來遺傳育種上可能具有潛在價值。

聚類分析可以利用樣本的多變量信息將其劃分為相對同質(zhì)的集群，從而清晰地展現(xiàn)不同集群間的系統(tǒng)親緣關(guān)系[32]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳距離為25時，扇穗茅6個參試居群聚為A和B兩大分支，其中居群119,120,94和83聚為A支，居群67和84聚為B支，同一分支上不同居群間具有相對較近的親緣關(guān)系；當(dāng)遺傳距離約為1時，居群119和120優(yōu)先聚類，彼此間親緣關(guān)系最近。同時，我們還發(fā)現(xiàn)分支A的4個居群分布于海拔相對較高的區(qū)域，而分支B的兩個居群分布的海拔高度相對較低。研究表明，隨著海拔高度的升高溫度會逐漸降低，并且降水、地表溫度及升溫速率等環(huán)境因子也會隨之發(fā)生改變[33]，因而我們認(rèn)為扇穗茅6個參試居群的親緣關(guān)系可能與其分布的海拔高度和生境存在必然聯(lián)系。本研究首次報道了扇穗茅的染色體數(shù)目、核型特征及進(jìn)化趨勢，為將來進(jìn)一步探究扇穗茅屬乃至雀麥族植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供了有力的細(xì)胞學(xué)佐證。

4 結(jié)論

綜上所述，扇穗茅的染色體為二倍體，數(shù)目恒定，為2n=2x=28；染色體有中部著絲粒(m)型和亞中部著絲粒(sm)型染色體，其中中部著絲粒型染色體占比較高，包含2A，1B和2B三種類型；扇穗茅不同參試居群的染色體核型臂比和平均臂比差異較大，呈“雙向進(jìn)化趨勢”；扇穗茅染色體總體沿二維圖右上角方向進(jìn)化，即右上方居群具有較高的進(jìn)化程度，左下方居群進(jìn)化程度相對較低；聚類分析顯示，當(dāng)遺傳距離為25時，扇穗茅6個參試居群聚為A和B兩大分支，每個分支上的居群間親緣關(guān)系相對較近，不同分支居群間親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。