草地早熟禾SnRK2.2基因克隆及非生物脅迫響應(yīng)分析

金一鋒， 陳 陽(yáng)*， 高巖松， 尤 學(xué)， 熊 毅， 趙清峰， 蘭紅宇

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院， 黑龍江 齊齊哈爾161006)

蛋白激酶(Protein kinase)是植物逆境防御機(jī)制中的核心成分，可通過激活多種蛋白磷酸化途徑來調(diào)節(jié)與逆境反應(yīng)相關(guān)下游基因的表達(dá)，其中蔗糖非發(fā)酵相關(guān)蛋白激酶(SNF1-RELATED PROTEIN KINASE，SnRK)是一種Ser/Thr蛋白激酶，在植物信號(hào)通路、代謝過程中起重要作用[1-2]。植物SnRK家族可分化為SnRK1,SnRK2和SnRK3三類，SnRK1在植物生長(zhǎng)發(fā)育、感知糖信號(hào)和調(diào)節(jié)能量平衡中發(fā)揮一定作用[3]，SnRK2與多種非生物脅迫反應(yīng)途徑相關(guān)，如干旱、鹽、ABA等脅迫處理[4]，SnRK3可在Ca2+信號(hào)作用下與CBL蛋白相互作用，對(duì)鹽脅迫反應(yīng)較為敏感[5]。

研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)等SnRK2部分成員是ABA信號(hào)通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在干旱脅迫期間對(duì)種子發(fā)育、休眠和萌發(fā)、以及幼苗生長(zhǎng)和氣孔調(diào)節(jié)均有一定作用[8-9]。ABA可以激活A(yù)tSnRK2.2、AtSnRK2.3、AtSnRK2.6，擬南芥激酶相關(guān)蛋白磷酸酶KAPP可與蛋白激酶SnRK2.2/2.3/2.6相互作用，負(fù)向調(diào)節(jié)脫落酸信號(hào)過程[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtSnRK2.8、AtSnRK2.9、AtSnRK2.10，以及水稻SnRK2家族成員可以被高滲溶液和鹽脅迫激活[10-11]。水稻基因組中SnRK2含有10個(gè)成員，命名為SAPK (osmotic stress/ABA-activated protein kinase)，研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下SAPK2可通過調(diào)節(jié)氮代謝過程促進(jìn)水稻產(chǎn)量[12]。Lou研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶SAPK1和SAPK2可協(xié)同作用，提高水稻的耐鹽性[13]，OsSAPK2可提升水稻對(duì)干旱脅迫的脫落酸敏感性和耐性[14]。

目前，蛋白激酶SnRK基因家族在水稻、小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysL.)、二穗短柄草(BrachypodiumdistachyonL.)、燕麥(AvenasativaL.)等禾本科植物中已得到研究，但有關(guān)SnRK2基因在禾本科草坪草中的功能及應(yīng)用鮮有報(bào)道。城市建設(shè)中草坪建植與養(yǎng)護(hù)過程中經(jīng)常面臨干旱、鹽分、氮肥不足等逆境脅迫，探究草坪草響應(yīng)環(huán)境、抵抗外界脅迫信號(hào)的機(jī)制尤為重要[15-16]。草地早熟禾(PoapratensisL.)是禾本科(Poaceae)早熟禾屬(Poa.)冷季型草坪草，其憑借耐低溫、耐修剪等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于寒冷地區(qū)的園林綠化[17]。本研究以草地早熟禾為材料，利用RT-PCR方法克隆得到草地早熟SnRK2.2基因，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法觀測(cè)SnRK2.2基因的組織表達(dá)特異性及非生物脅迫反應(yīng)中該基因的表達(dá)模式，以期為揭示SnRK2.2基因應(yīng)答逆境脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，這將豐富草坪草SnRK2抗逆機(jī)制的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

供試材料為草地早熟禾‘午夜Ⅱ號(hào)’品種，購(gòu)于北京正道生態(tài)科技有限公司。將飽滿的種子置于營(yíng)養(yǎng)土中，其中：壤土：沙子：蛭石=3∶1∶1，培養(yǎng)條件為：相對(duì)濕度為60%，25℃光照14 h，15℃暗培養(yǎng)10 h，光照強(qiáng)度500 μmol·m-2·s-1。待營(yíng)養(yǎng)土中培養(yǎng)90 d后使用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培處理，待培養(yǎng)10 d后進(jìn)行模擬干旱脅迫、鹽脅迫、氮脅迫、磷脅迫處理。

具體處理分組為：(1)干旱脅迫處理：1/2 Hoagland水培液中加入10% PEG6000(Polyethylene glycol)，干旱誘導(dǎo)時(shí)間分別為：0 h，2 h，16 h。(2)鹽脅迫處理：配置0 mM，30 mM，100 mM，300 mM NaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每日更換一次營(yíng)養(yǎng)液，處理5 d后取樣。(3)氮脅迫處理：NaNO3為氮源，配置0 mM，1.5 mM，15 mM NaNO3的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每日更換一次營(yíng)養(yǎng)液，處理21 d后取樣。(4)磷脅迫處理：KH2PO4為磷源，配置0 mM，0.01 mM，1 mM濃度的KH2PO4的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，每日更換一次營(yíng)養(yǎng)液，處理21 d取樣。(5)ABA、BR處理：ABA濃度為5 mg·L-1,15 mg·L-1，每日噴施10 mL于葉部，于0 d,7 d,21 d取樣。BR濃度為0.1 mg·L-1、1.0 mg·L-1，每日噴施10 mL于葉部，于0 d,7 d,21 d取樣。以上逆境脅迫取樣部位均為葉部，各處理取樣均三次生物學(xué)重復(fù)，置于-80℃保存。

1.2 草地早熟禾SnRK2.2基因的克隆

利用天根植物總RNA提取試劑盒(TianGen，Beijing)，提取并檢測(cè)供試材料總RNA濃度、純度及完整性。以RNA為模板，采用PrimeScriptTMⅡ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，Japan) 進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，用于草地早熟禾SnRK2.2基因的克隆。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到草地早熟禾SnRK2.2部分序列為基礎(chǔ)(RNA-Seq在NCBI登錄號(hào)為PRJNA517968)，結(jié)合Genebank公布的小麥SnRK2.2(XM_044466822)、節(jié)節(jié)麥SnRK2.2(XM_020335235.2)，設(shè)計(jì)特異性引物SnRK2.2-F,SnRK2.2-R引物序列見表1。以cDNA為模板，利用2xEs Taq MasterMix(CWBIO，CW0690)對(duì)草地早熟禾SnRK2.2基因編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程股份有限公司(上海)完成測(cè)序。

1.3 草地早熟禾SnRK2.2基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測(cè)SnRK2.2開放性閱讀框；利用NCBI CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析SnRK2.2蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域；利用MEGA7.0,MEME,Tbtools構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用ClustalW (http://www.clustal.org/)進(jìn)行多個(gè)禾本科植物SnRK2.2編碼氨基酸同源性分析；利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)基本理化性質(zhì)，Netphos(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)，Motifscan (https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)分析目的蛋白生物活性位點(diǎn)；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)在線預(yù)測(cè)SnRK2.2蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 草地早熟禾SnRK2.2基因組織特異性及非生物脅迫表達(dá)模式分析

本研究提取草地早熟禾植株根部、莖部、葉部、穗的RNA；提取干旱、鹽、氮、磷脅迫后的草地早熟禾葉部RNA；提取ABA、BR誘導(dǎo)處理后草地早熟禾葉部RNA，以RNA模板反轉(zhuǎn)錄獲得第一條cDNA，作為qRT-PCR模板。采用qRT-PCR相對(duì)定量方法，總反應(yīng)體系為50 μL，包含：4 μL cDNA，2 μL Q-SnRK2.2-F/R，17 μL ddH2O，25 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Takara)，采取兩步法進(jìn)行擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃、5 s,60℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)，選擇草地早熟禾UBQ為內(nèi)參基因。該試驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次，利用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

表1 所需RT-PCR及qRT-PCR引物Table 1 The Primers used for RT-PCR and qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾SnRK2.2基因編碼區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

草地早熟禾cDNA為模板，以SnRK2.2-F/R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約為1284 bp的條帶(圖1)，ORF預(yù)測(cè)其包含一個(gè)1026 bp開放閱讀框，共編碼341個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白相對(duì)分子量為 38.70 kD，等電點(diǎn)為5.48。草地早熟禾SnRK2.2編碼氨基酸為SRK/SAPK family serine/threonine-protein kinase，保守域分析表明，其包含典型的絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域STKc_SnRK2，屬于PKc_like Superfamily (圖2)。利用MEGA和Tbtools軟件對(duì)草地早熟禾SnRK2.2與其他18個(gè)其他植物SnRK2.2的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)(圖3)，結(jié)果顯示，草地早熟禾SnRK2.2與燕麥SnRK2.2(QIH55250.1)進(jìn)化關(guān)系上較近、與小麥SnRK2.2(XP_037484113.1)、節(jié)節(jié)麥SnRK2.2(XP_020190824.1)、二穗短柄草SnRK2.2(NP_001304800.1)屬于同一個(gè)分支，同源性分別為96.19%,95.31%,95.31%,93.84%，可見，SnRK2.2氨基酸序列在禾本科植物中高度保守。草地早熟禾SnRK2.2與燕麥、小麥、節(jié)節(jié)麥、二穗短柄草SnRK2.2氨基酸序列進(jìn)行多序列比較，發(fā)現(xiàn)其ATP binding site、Active site、Activation loop，及Polypeptide substrate binding site典型的多肽位結(jié)合位點(diǎn)等位置。草地早熟禾SnRK2.2氨基酸磷酸化位點(diǎn)含有16個(gè)絲氨酸、5個(gè)蘇氨酸和5個(gè)酪氨酸。蛋白生物活性位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果，其包含5個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，氨基酸位置分別為96～99 aa，129～132 aa，172～175 aa，250～253 aa，287～290 aa，2個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn):110～115 aa，304～309 aa，3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn):54～56 aa，92～94 aa，172～174 aa，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(140～146 aa)，1個(gè)蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)(10～33 aa)，1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)(119～131aa)(圖4)。草地早熟禾SnRK2.2與擬南芥、水稻、大麥SnRK2 s進(jìn)行同源進(jìn)化關(guān)系比對(duì)，發(fā)現(xiàn)草地早熟禾SnRK2.2與HvSnRK2.2,OsSnRK2.2,OsSnRK2.1,HvSnRK2.4,AtSnRK2.7這5個(gè)SnRK2成員屬于同一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近(圖5)。

圖1 草地早熟禾SnRK2.2 基因PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoresis of SnRK2.2 gene of Poa pratensis

圖2 草地早熟禾SnRK2.2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Conserved domain prediction of SnRK2.2 protein

圖3 草地早熟禾SnRK2.2與其他植物SnRK2.2的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Poa pratensis SnRK2.2 protein and SnRK2.2 in other species

圖4 草地早熟禾SnRK2.2與其他植物SnRK2.2同源蛋白的多序列比對(duì)Fig.4 Poa pratensis SnRK2.2 with other plants SnRK2.2 multiple sequence alignment of homologous proteins注：I代表蛋白激酶ATP結(jié)合信號(hào)區(qū)，Ⅱ代表N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)，Ⅲ代表絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)Note:I represents ATP binding signal region of protein kinase,Ⅱ represents N-myristoylation site,and Ⅲ represents serine/threonine protein kinase active site

圖5 草地早熟禾SnRK2.2與擬南芥、水稻、大麥SnRK2家族成員同源進(jìn)化關(guān)系比對(duì)Fig.5 Kentucky bluegrass SnRK2 Comparison of homologous evolutionary relationship between SnRK2 family members and Arabidopsis,Oryza sativa and Hordeum vulgare注：擬南芥，水稻，大麥SnRK2家族成員分別是：AtSnRK2.1-2.10，OsSnRK2.1-2.10，HvSnRK2.1-2.10Note:SnRK2 family in Arabidopsis (SnRK2.1-2.10)，Oryza sativa (OsSnRK2.1-2.10) and Hordeum vulgare (HvSnRK2.1-2.10)

利用Wolf-Psort亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示草地早熟禾SnRK2.2定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。利用SOPMA進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(圖6)，結(jié)果顯示草地早熟禾SnRK2.2蛋白質(zhì)是一種混合型結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由不規(guī)則卷曲(42.23%)、α-螺旋(36.66%)、延伸鏈(14.96%)和β-轉(zhuǎn)角(6.16%)共同構(gòu)成。利用SWISS-MODEL對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模(圖7)，發(fā)現(xiàn)其與蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

圖6 草地早熟禾SnRK2.2蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure of SnRK2.2 protein in Poa pratensis.注：圖中藍(lán)色表示α-螺旋、紅色表示延伸鏈、綠色表示β-轉(zhuǎn)角、紫色表示不規(guī)則卷曲Note:In the figure,blue represents α-helix,red represents extended chain,green represents β-turn,and purple represents irregular coil

圖7 草地早熟禾SnRK2.2蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Tertiary structure of SnRK2.2 protein in Poa pratensis.

2.2 草地早熟禾SnRK2.2基因的組織特異性分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，草地早熟禾SnRK2.2基因相對(duì)表達(dá)量存在組織特異性(P<0.05)，由圖8-a可見，草地早熟禾穗中SnRK2.2相對(duì)表達(dá)量最高，其次是葉部、莖部，根部最低，成熟穗中相對(duì)表達(dá)量是根部的32.82倍。

圖8 草地早熟禾SnRK2.2基因表達(dá)水平的組織特異性分析Fig.8 Expression level analysis of SnRK2.2 gene in Kentucky Bluegrass under tissue注：不同小寫字母表示不同組織部位中SnRK2.2基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate significant differences in SnRK2.2 gene expression in different tissue at the 0.05 level.

2.3 草地早熟禾SnRK2.2基因?qū)Ω珊?、鹽、氮、磷脅迫的響應(yīng)

由圖9可以看到，草地早熟禾SnRK2.2積極響應(yīng)PEG、鹽、氮、磷非生物脅迫。10% PEG6000模擬干旱脅迫顯著促進(jìn)葉部SnRK2.2基因表達(dá)，2 h>16 h>0 h，其中，2 h的SnRK2.2相對(duì)表達(dá)量為峰值，是0 h的11.85倍，隨著干旱時(shí)間增加其相對(duì)表達(dá)量下降，但16 h仍為0 h的8.52倍(見圖9A)。由圖9B可知，不同梯度NaCl濃度處理顯著影響SnRK2.2基因的表達(dá)量(P<0.05)，25 mM NaCl>100 mM NaCl>300 mM NaCl>0 mM NaCl(CK組)。隨著鹽濃度的增加，其相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，其中25 mM NaCl處理組的表達(dá)量CK組的6.75倍。由圖9C可知，不同梯度NaNO3氮素處理顯著影響草地早熟禾SnRK2.2基因的表達(dá)量(P<0.05)，1.5 mM NaNO3>0 mM NaNO3>15 mM NaNO3，與適氮組(15 mM NaNO3)相比，SnRK2.2積極響應(yīng)低氮(1.5 mM NaNO3)及無(wú)氮(0 mM NaNO3)環(huán)境，其中1.5 mM NaNO3處理組的表達(dá)量是15 mM NaNO3的4.18倍。草地早熟禾SnRK2.2基因表達(dá)水平隨著KH2PO4濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)(P<0.05)，0.01 mM KH2PO4低磷處理組相對(duì)表達(dá)量分別是0 mM KH2PO4、1 mM KH2PO4的2.23倍、2.11倍(見圖9D)，低磷環(huán)境(0.01 mM KH2PO4)可促進(jìn)該基因的表達(dá)。

2.4 外源ABA、BR對(duì)草地早熟禾SnRK2.2基因表達(dá)水平的影響

ABA和BR是調(diào)節(jié)植物生理過程和缺水條件下重要的應(yīng)激激素，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法觀察草地早熟禾SnRK2.2響應(yīng)ABA，BR誘導(dǎo)的表達(dá)模式。本研究測(cè)定植物激素ABA、BR不同濃度及不同時(shí)間對(duì)草地早熟禾葉部SnRK2.2基因表達(dá)水平的影響(圖10A、10B)。將5 mg·L-1ABA噴施誘導(dǎo)7 d,21 d與0 d(CK組)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 mg·L-1ABA誘導(dǎo)7 d時(shí)SnRK2.2基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于21 d,0 d(P<0.01)。但當(dāng)15 mg·L-1ABA誘導(dǎo)時(shí)，隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，SnRK2.2基因相對(duì)表達(dá)量顯著提升，21 d>7 d>0 d。不同ABA濃度誘導(dǎo)7 d、21 d時(shí)SnRK2.2基因差異顯著，處理相同天數(shù)時(shí)15 mg·L-1ABA的相對(duì)表達(dá)量均高于5 mg·L-1ABA。可見外源ABA噴施濃度及誘導(dǎo)時(shí)間顯著影響SnRK2.2基因的表達(dá)水平。圖10B可知，BR誘導(dǎo)顯著促進(jìn)草地早熟禾SnRK2.2基因的表達(dá)水平(P<0.01)，21 d>7 d>0 d。0.1 mg·L-1BR處理下，21 d的相對(duì)表達(dá)量是7 d、0 d的9.10,10.71倍，而1.0 mg·L-1BR處理下，21 d的相對(duì)表達(dá)量是7 d,0 d的2.68,5.84倍，可見，低濃度0.1 mg·L-1BR的促進(jìn)效果更為顯著。

圖9 草地早熟禾SnRK2.2基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析Fig.9 Expression pattern analysis of SnRK2.2 gene of Kentucky Bluegrass induced under various abiotic stress注：不同小寫字母表示干旱、鹽、氮、磷脅迫過程中該基因表達(dá)量在0.05水平上差異顯著。Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the P<0.05,under drought,salt,nitrogen and phosphorus stress.

圖10 草地早熟禾SnRK2.2基因在植物激素ABA、BR誘導(dǎo)下的表達(dá)模式分析Fig.10 Expression pattern analysis of SnRK2.2 gene of Kentucky Bluegrass by ABA and BR treatment注：**表示ABA、BR處理中該基因的表達(dá)量在0.01水平上差異顯著Note:** indicates significant difference at the 0.01 level，during ABA and BR treatment

3 討論

蛋白激酶SnRK2 s屬于多基因家族，在擬南芥中SnRK2家族包含10個(gè)成員，水稻、大麥、二穗短柄草基因組中也鑒定出了11,10,10個(gè)基因編碼SnRK2家族基因[18-19]。本研究克隆獲得一個(gè)草地早熟禾SnRK2蛋白激酶基因SnRK2.2，其開放閱讀框ORF序列與小麥、節(jié)節(jié)麥、二穗短柄草SnRK2.2高度同源。水稻OsSAPK2表達(dá)水平存在組織特異性，其相對(duì)表達(dá)量排序?yàn)槿~>根>種子>幼苗>莖部[14]，這與本研究結(jié)果存在一定差異。草地早熟禾SnRK2.2的表達(dá)也存在組織特異性，但成熟穗中最高，其次是葉部、莖部、根部，地上部位的SnRK2.2相對(duì)表達(dá)量顯著高于地下根部。研究表明水稻SAPK2與水稻籽粒含量有關(guān)聯(lián)[12]，猜測(cè)草地早熟禾SnRK2.2組織表達(dá)模式與植株不同部位的蔗糖、淀粉代謝可能存在一定關(guān)聯(lián)。草地早熟禾SnRK2.2蛋白含有絲氨酸/蘇氨酸激酶的催化結(jié)構(gòu)域STKc_SnRK2，也包含SnRK2典型的功能域，如蛋白激酶ATP結(jié)合信號(hào)區(qū)、N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)，這與燕麥、二穗短柄草等植物的研究結(jié)果一致，可見表明禾本科植物中SnRK2蛋白激酶成員結(jié)構(gòu)較為保守[19-20]。N-肉豆蔻酰化作用位點(diǎn)是植物應(yīng)答環(huán)境脅迫反應(yīng)中調(diào)節(jié)膜靶向和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵區(qū)域[21]，SnRK2蛋白激酶家族包含的蛋白激酶ATP結(jié)合信號(hào)區(qū)、N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)等可能積極參與非生物脅迫信號(hào)傳遞。

研究表明擬南芥10個(gè)SnRK2中，SnRK2.2-2.3-2.6在應(yīng)對(duì)ABA和干旱時(shí)起到調(diào)節(jié)作用，其中蛋白激酶SnRK2.2和SnRK2.3在水分虧缺條件下可調(diào)節(jié)種子休眠、萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)[7]。聚乙二醇和鹽處理可顯著上調(diào)水稻SAPK2基因的表達(dá)水平[14]，這與本研究結(jié)果一致。研究表明水稻轉(zhuǎn)錄因子OsbZIP23是脫落酸依賴的抗旱耐鹽反應(yīng)中重要調(diào)節(jié)因子，干旱脅迫下水稻SAPK2可以與OsbZIP23相互作用并使其磷酸化以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活[22]。干旱脅迫下質(zhì)膜相關(guān)Ca2+結(jié)合蛋白PCaP2(plasma membrane-associated Ca2+-binding protein)可以激活SnRK2.2-2.3-2.6和ABFs等干旱響應(yīng)基因的表達(dá)[23]。鹽脅迫處理可促進(jìn)水稻SAPK1和SAPK2基因的表達(dá)[13]。Liu研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)煙草NtSnRK2.2可調(diào)節(jié)碳水化合物代謝和側(cè)根發(fā)育從而增強(qiáng)煙草耐鹽性[24]。本研究中，鹽脅迫處理組(25 mM-300 mM NaCl)中草地早熟禾SnRK2.2的表達(dá)均高于未處理組，低鹽處理(25 mM NaCl)更有利于該基因的表達(dá)。在缺氮、缺鉀環(huán)境中SAPK2能顯著影響水稻幼苗生長(zhǎng)和根系發(fā)育，SAPK2通過調(diào)節(jié)硝酸鹽相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體促進(jìn)硝酸鹽的吸收和同化，進(jìn)而調(diào)控碳氮代謝過程[12]。本研究中，草地早熟禾SnRK2.2基因積極響應(yīng)低氮、低磷脅迫。許多研究表明，SnRK2和SnRK3主要參與對(duì)滲透脅迫和逆境信號(hào)分子ABA的應(yīng)答。本研究將擬南芥、水稻、大麥SnRK2家族成員與草地早熟禾SnRK2.2進(jìn)行親緣關(guān)系分析，由圖5可見，AtSnRK2.8與草地早熟禾SnRK2.2進(jìn)化關(guān)系較近，AtSnRK2.8與草地早熟禾SnRK2.2結(jié)構(gòu)特征相似，其功能可能也有一定相似性，研究發(fā)現(xiàn)AtSnRK2.8可以被ABA誘導(dǎo)激活，這與本研究結(jié)果一致草地早熟禾SnRK2.2也可被ABA激活，玉米ZmSnRK2.2，ZmSnRK2.4的研究也得到相似結(jié)果[25-26]。水楊酸SA誘導(dǎo)下，甘藍(lán)型油菜的蔗糖增加，而SnRK2.2和AREB2表達(dá)受到抑制[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，外源ABA、BR噴施濃度及誘導(dǎo)時(shí)間可顯著影響SnRK2.2基因的表達(dá)水平，高濃度ABA(15 mg·L-1)、低濃度BR(0.1 mg·L-1)處理更有利于該基因的表達(dá)。以上結(jié)果說明，草地早熟禾SnRK2.2基因可能作為一個(gè)調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)干旱、鹽、低氮、低磷、植物激素等非生物脅迫所引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)，SnRK2.2在植物的抗逆性改良中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究克隆得到草地早熟禾SnRK2.2基因，包含絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域STKc_SnRK2，屬于SnRK2家族基因，禾本科植物中SnRK2.2具有較高的保守性。草地早熟禾SnRK2.2基因的表達(dá)存在組織特異性，穗中最高，根部最少。草地早熟禾SnRK2.2積極響應(yīng)干旱、鹽、低氮、低磷脅迫及ABA、BR誘導(dǎo)處理。本研究系統(tǒng)分析草地早熟禾SnRK2.2基因特征，為進(jìn)一步了解草地早熟禾SnRK2家族的特征，探究草坪草SnRK2家族基因在逆境脅迫下的分子調(diào)控機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。