基于絲素蛋白微球的可注射膠體凝膠的制備

錢坤煜, 薛敬哲, 陳 勝, 陸 楊

(合肥工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,安徽 合肥 230009)

由生物高分子制備的微球是一種可負(fù)載藥物和實(shí)現(xiàn)藥物緩釋的載體[1-2]。絲素蛋白提取自桑蠶蠶繭,與其他材料相比具有炎癥反應(yīng)低、生物相容性好[3]、機(jī)械性能優(yōu)越等優(yōu)點(diǎn)[4]?；诮z素蛋白制備的微球可以高效地負(fù)載生物活性分子,已經(jīng)廣泛用于藥物緩釋[5]、酶固定化[6]等領(lǐng)域。絲素蛋白微球(silk fibroin microspheres,SFMs)的合成方法主要有乳化法[7]、自組裝法[8]、微流控技術(shù)[9]等。與其他合成方法相比,乳化法裝置較簡(jiǎn)單,無需有毒溶劑,且有利于保持所負(fù)載生物分子的活性。在最近的報(bào)道中,絲素蛋白水溶液可以在聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)乳化作用下快速形成微球,并實(shí)現(xiàn)微球尺寸的調(diào)控[7]。但是該乳化法得到的產(chǎn)物粒徑較大,基于該方法進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化有望實(shí)現(xiàn)較小尺寸的絲素蛋白微球的可控制備。

水凝膠目前是一種受到廣泛關(guān)注的生物材料,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程、腫瘤治療等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。絲素蛋白可以通過升溫、調(diào)節(jié)pH值、加入化學(xué)交聯(lián)劑等方法制備成水凝膠,但是所制備凝膠的注射性較差[3]。與常規(guī)的聚合物凝膠相比,膠體凝膠是一種具有優(yōu)異的可注射性的生物材料,具有良好的黏彈性。膠體凝膠是由分散的膠體粒子組成的,膠體粒子之間通過可逆的、非共價(jià)交聯(lián)的作用力自組裝形成非均相微粒網(wǎng)絡(luò)。功能性的微納米粒子作為構(gòu)筑單元可以制備出具有多種功能性的可注射性膠體凝膠[10],為絲素蛋白凝膠的制備提供新方案。本文基于前期對(duì)膠體凝膠和絲素蛋白的研究,使用PEG乳化后再冷凍的改進(jìn)方法,并通過調(diào)節(jié)PEG和絲素蛋白的質(zhì)量濃度實(shí)現(xiàn)了250～400 nm尺寸的絲素蛋白微球的制備。進(jìn)一步通過與帶有相反電荷的明膠粒子在中性pH值條件下混合,利用靜電作用力交聯(lián)形成具有優(yōu)異的可注射性的絲素蛋白膠體凝膠。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

無水碳酸鈉購自國藥集團(tuán);溴化鋰,聚乙二醇(20、10、4 kDa)購自Aladdin。

采用卡爾蔡司Merlin Compact場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope,FESEM)分析樣品的形貌結(jié)構(gòu);采用馬爾文ZS90型Zeta電位儀進(jìn)行電位分析;采用Instron5695型萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行注射性評(píng)價(jià)。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 絲素蛋白溶液的制備

無水碳酸鈉對(duì)蠶繭脫膠處理后,使用溴化鋰溶液(9.3 mol/L)溶解干燥的蠶絲,并通過去離子水透析除雜獲得絲素蛋白水溶液。微球的合成需要質(zhì)量濃度為120 g/L的絲素蛋白溶液,因此需要將上述絲素蛋白溶液裝入透析袋(分子量3 500),在PEG溶液(10 kDa,100 g/L)中透析濃縮。透析袋內(nèi)絲素蛋白溶液體積減少至1/2左右時(shí)取出,即獲得高質(zhì)量濃度的絲素蛋白溶液。絲素蛋白溶液在4 ℃ 冰箱中保存,并利用干燥稱重法測(cè)定準(zhǔn)確質(zhì)量濃度。

1.2.2 絲素蛋白微球的可控制備

采用改進(jìn)的PEG乳化法制備絲素蛋白微球。取 2 mL一定質(zhì)量濃度的絲素蛋白溶液放置在磁力攪拌器上,緩慢攪拌(100 r/min)的同時(shí)滴加等體積的PEG溶液進(jìn)行乳化?；旌虾笤贁嚢?0 s左右,待其充分混勻后放入冰箱冷凍室處理48 h。冷凍處理結(jié)束后,將小玻璃瓶取出在室溫下解凍,并離心洗滌3次即可獲得絲素蛋白微球。研究PEG溶液質(zhì)量濃度對(duì)絲素蛋白的調(diào)控時(shí),絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度為60 g/L,PEG分子量為10 kDa,分別配制質(zhì)量濃度為200、300、500 g/L的3組PEG溶液進(jìn)行合成。研究絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度對(duì)絲素蛋白微球的調(diào)控時(shí),PEG分子量為10 kDa,質(zhì)量濃度為300 g/L,分別使用質(zhì)量濃度為20、60、80、120 g/L的4組絲素蛋白溶液進(jìn)行合成。通過FESEM對(duì)各組微球的形貌和尺寸進(jìn)行觀察。

1.2.3 絲素蛋白微球明膠粒子膠體凝膠的合成

根據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道的兩步去溶劑法制備明膠粒子。分別稱取一定量的絲素蛋白微球凍干粉末和明膠粒子凍干粉末,分散在去離子水中配制成質(zhì)量濃度為100、150、200 g/L的水溶液。使用Malvern Zetasizer Nano ZS90 Zeta電位分析儀對(duì)不同pH值下絲素蛋白微球和明膠粒子水溶液的Zeta電位進(jìn)行測(cè)試。將1 mL上述制備的絲素蛋白微球溶液與等體積、等質(zhì)量濃度的明膠粒子溶液混合,使用渦旋混合機(jī)充分混勻即獲得膠體凝膠。使用萬能力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)搭載自制支架對(duì)絲素蛋白微球明膠粒子膠體凝膠的可注射性進(jìn)行定量測(cè)試[12]。將合成好的膠體凝膠放在冷凍干燥機(jī)(Labconco, FreeZone6)中凍干,通過場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)凍干的樣品微觀形貌進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 絲素蛋白微球的調(diào)控和形貌表征

2.1.1 PEG質(zhì)量濃度對(duì)絲素蛋白微球的調(diào)控

在乳化法制備絲蛋白微球的過程中,PEG溶液可以作為乳化劑。當(dāng)PEG溶液滴入緩慢攪拌的絲素蛋白溶液中時(shí),溶液會(huì)逐漸變白,即乳化的過程。當(dāng)絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度為60 g/L,冷凍處理的時(shí)間為48 h,PEG分子量為10 kDa時(shí),不同PEG溶液質(zhì)量濃度下所得的產(chǎn)物的FESEM圖像如圖1所示。

由圖1可知，當(dāng)PEG溶液質(zhì)量濃度較低時(shí)(200 g/L)制備出的是粘連的凝膠;當(dāng)PEG溶液質(zhì)量濃度達(dá)到300 g/L時(shí),逐漸開始形成微球,尺寸為400～600 nm。但是球與球中間存在一些絲狀物粘連,可能是由于乳化不夠徹底;當(dāng)PEG溶液質(zhì)量濃度達(dá)到500 g/L時(shí),合成的微球尺寸較小,為250～400 nm,且大小比較均勻。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出如下結(jié)論:在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),PEG溶液的質(zhì)量濃度越高,乳化的效果越好,有利于形成微球;PEG質(zhì)量濃度太低則無法獲得單分散的微球結(jié)構(gòu)。在進(jìn)一步研究絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度對(duì)微球形貌和尺寸的影響時(shí),選擇PEG溶液的質(zhì)量濃度為500 g/L。

圖1 不同PEG溶液質(zhì)量濃度下合成的絲素蛋白微球的FESEM圖像

2.1.2 絲素蛋白質(zhì)量濃度對(duì)絲素蛋白微球的調(diào)控

不同絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度下，合成的絲素蛋白微球的FESEM圖像如圖2所示。

圖2 不同溶液質(zhì)量濃度下合成的絲素蛋白微球的FESEM圖像

作為微球生長合成過程中的前驅(qū)體溶液,絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度對(duì)合成的微球形貌與尺寸有明顯影響。

當(dāng)研究絲素蛋白質(zhì)量濃度的影響時(shí),選取的PEG(10 kDa)溶液的質(zhì)量濃度為500 g/L,冷凍處理的時(shí)間為48 h。當(dāng)絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度較低時(shí)(20 g/L),無法使絲素蛋白溶液形成微球(圖2a),此時(shí)形成的是相互交聯(lián)的絲素蛋白網(wǎng)絡(luò);當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到60 g/L時(shí),形成單分散的絲素蛋白微球(圖2b),尺寸為250 ～ 400 nm;當(dāng)絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度達(dá)到80 g/L時(shí),微球的尺寸逐漸開始變大(圖2c),大部分絲素蛋白微球的尺寸為500～800 nm;當(dāng)絲素蛋白的質(zhì)量濃度達(dá)到120 g/L時(shí),所合成的微球尺寸已經(jīng)達(dá)到微米級(jí)(圖2d),為1 ～ 2 μm,且表面較光滑,但是尺寸分布非常不均勻。

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出如下結(jié)論:絲素蛋白質(zhì)量濃度過低時(shí)無法形成微球,而隨著絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度的增加,乳化效果更好,所合成的微球的尺寸顯著增加,表面也更加光滑。

2.2 絲素蛋白微球和明膠粒子的電位分析

當(dāng)2種帶電粒子帶有相反的電荷時(shí),在合適的條件下進(jìn)行混合，可以在靜電作用力下形成穩(wěn)定的膠體凝膠。不同pH值條件下粒子的表面電荷會(huì)發(fā)生改變,在pH值為5～10的范圍內(nèi)絲素蛋白微球和明膠粒子的Zeta電位值結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，絲素蛋白微球(圖1c中所制備的250～400 nm SFMs)在pH值為6～10的范圍內(nèi)帶有較強(qiáng)的負(fù)電荷;明膠粒子在pH值為9～10之間發(fā)生了電位翻轉(zhuǎn),由負(fù)電荷轉(zhuǎn)變成正電荷,且電位值隨著pH值的下降顯著增長。在溶液pH值為5 ～ 9的范圍內(nèi),絲素蛋白微球和明膠粒子帶有相反的電荷。

圖3 不同pH值下絲素蛋白微球和明膠粒子的Zeta電位值

2.3 絲素蛋白微球明膠粒子膠體凝膠的合成

基于對(duì)絲素蛋白微球和明膠2種粒子Zeta電位的測(cè)量,并且考慮到所制備的凝膠的生物用途,選擇在中性pH值條件下將分別帶相反電荷的2種粒子混合。此時(shí),絲素蛋白微球表面為負(fù)電荷,明膠粒子所帶的是正電荷,2種粒子在靜電作用力下可以形成穩(wěn)定的顆粒凝膠網(wǎng)絡(luò)。其合成過程如圖4所示,需將2種粒子的水溶液渦旋混勻,最終形成凝膠。

絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠合成實(shí)物及其FESEM圖像如圖5所示。

由圖5a可以看出，當(dāng)2種粒子水溶液剛混合時(shí),此時(shí)由于2種膠體粒子還沒有混合均勻,仍具有流動(dòng)性。

混合溶液經(jīng)過渦旋均勻之后所合成的產(chǎn)物如圖5b、圖5c所示,從圖5b、圖5c可以看出，倒置或者斜置時(shí)能長時(shí)間保持形態(tài),明顯失去了流動(dòng)性,從而證明已經(jīng)成功制備出膠體凝膠。

凍干凝膠在FESEM下的微觀形貌如圖5d所示,由圖5d可知凝膠結(jié)構(gòu)是由膠體粒子交聯(lián)形成的。

圖4 絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠合成過程

圖5 絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠合成實(shí)物和FESEM圖像

2.4 膠體凝膠的注射性評(píng)價(jià)

絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠的注射性評(píng)價(jià)結(jié)果如圖6所示。

圖6c～圖6e所示為粒子凝膠制備時(shí)，固體顆粒在水溶液中質(zhì)量濃度分別為100、150、200 g/L的注射率-荷載關(guān)系。因?yàn)橛晌⑶蚝兔髂z粒子組成的膠體凝膠相對(duì)于傳統(tǒng)的聚合物網(wǎng)絡(luò)凝膠體系具有顯著的剪切變稀的優(yōu)勢(shì)(圖6a),所以該絲蛋白膠體凝膠可以從注射器中推注出來,即具有良好的可注射性(圖6b)。

為了進(jìn)行定量表征,將絲蛋白膠體凝膠移入1 mL注射器中,然后將注射器固定在自制的載樣支架上。注射器的上端緊貼在Instron萬能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)的上壓盤,確保啟動(dòng)壓縮模式測(cè)試時(shí)凝膠可以從注射器中被勻速擠壓出,并測(cè)試擠出過程中的壓力,可以反饋膠體凝膠的注射過程。100、150、200 g/L 3個(gè)質(zhì)量濃度的膠體凝膠從注射器中全部擠出前所需要施加的注射力基本保持恒定,未出現(xiàn)顯著的相分離和堵塞(圖6c～圖6e),都表現(xiàn)出良好的可注射性。

圖6 絲素蛋白微球-明膠粒子膠體凝膠的注射性評(píng)價(jià)

3 結(jié) 論

本文采用改良的PEG乳化法合成了一系列不同尺寸的絲素蛋白微球。FESEM表征結(jié)果表明,通過調(diào)節(jié)絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度和PEG溶液質(zhì)量濃度可以實(shí)現(xiàn)對(duì)絲素蛋白微球形貌與尺寸可控合成。制備小尺寸的絲素蛋白微球的優(yōu)化合成條件為60 g/L的絲素蛋白溶液質(zhì)量濃度和500 g/L的PEG(10 kDa)溶液質(zhì)量濃度,冷凍處理的時(shí)間為48 h。在中性pH值溶液中帶有正電荷的明膠粒子和帶有負(fù)電荷的絲素蛋白溶液混合均勻后通過靜電作用力形成可注射的膠體凝膠。

同時(shí),絲素蛋白和明膠都是良好的藥物載體,在構(gòu)筑單元膠體粒子上通過物理吸附[10]負(fù)載抗腫瘤藥物,可以制備出載藥的膠體凝膠。因?yàn)榫哂辛己玫目勺⑸湫院腕w系可擴(kuò)展性,所以該粒子凝膠有望用于腫瘤微環(huán)境的響應(yīng)性藥物釋放。