白樺BpPIN3基因啟動(dòng)子序列及應(yīng)答特性分析

陳 坤 方功桂 穆懷志 姜 靜

（東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040）

生長(zhǎng)素（IAA）是一種非常重要的植物激素，參與植物的許多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，如根系形成、頂端優(yōu)勢(shì)、花序和葉序發(fā)育、維管組織分化、果實(shí)成熟，以及對(duì)光照和重力的響應(yīng)等。而在植物中觀(guān)察到異常的表型多是由于內(nèi)源生長(zhǎng)素濃度過(guò)高或不足引起的。生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體蛋白作為生長(zhǎng)素的運(yùn)輸載體，可通過(guò)在植物組織或器官中建立生長(zhǎng)素的不對(duì)稱(chēng)分布來(lái)建立生長(zhǎng)素濃度梯度，進(jìn)而在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出其生理效應(yīng)。在植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體中PIN 蛋白家族是最重要的生長(zhǎng)素外排載體基因家族之一，主要負(fù)責(zé)向胞外運(yùn)輸生長(zhǎng)素。擬南芥（）研究顯示，其共有8 個(gè)PIN 家族成員（～），該家族成員均為膜蛋白。其中是生長(zhǎng)素動(dòng)態(tài)運(yùn)輸?shù)闹匾M件，主要參與植物胚胎生長(zhǎng)素梯度的維持，以及維管束的分化等；定位于根尖組織細(xì)胞中，負(fù)責(zé)生長(zhǎng)素的分配進(jìn)而控制根的向地性；主要參與植物的向性生長(zhǎng)和側(cè)向器官的形態(tài)建成；、主要負(fù)責(zé)生長(zhǎng)素的非極性定位；而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的PINs主要包括、和，主要參與細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)素的穩(wěn)態(tài)和代謝。擬南芥中的分布較廣，在根分生組織的中柱鞘細(xì)胞、根冠柱，以及幼芽的內(nèi)皮層細(xì)胞中都可以觀(guān)測(cè)到其表達(dá)，能夠?qū)⒅亓Υ碳ば盘?hào)轉(zhuǎn)化為生長(zhǎng)素的非對(duì)稱(chēng)分布，從而控制植物的向性生長(zhǎng)，同時(shí)在光照條件下，受基因的影響，通過(guò)介導(dǎo)的膜泡運(yùn)輸過(guò)程受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致生長(zhǎng)素的分布發(fā)生變化來(lái)參與植物向光性的過(guò)程。

除擬南芥外，迄今為止，已通過(guò)全基因組測(cè)序方法在30 余種植物中鑒定出基因。其中基因在碎米薺（）中被證明參與植物小葉的分化；在玉米（）中被證明其參與玉米胚胎發(fā)育，以及生殖發(fā)育過(guò)程；在番茄（）中，通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素積累過(guò)程進(jìn)而控制番茄子葉的脫落。番茄中研究發(fā)現(xiàn)、參與莖發(fā)育過(guò)程。在煙草（）中，負(fù)調(diào)控腋芽生長(zhǎng)。紫苜蓿中，影響植物根瘤數(shù)量。在棉花（）中，PINs 蛋白具有調(diào)節(jié)棉花纖維生長(zhǎng)的作用。在木本植物中，參與毛果楊（）側(cè)根形成過(guò)程，參與楊樹(shù)的葉片形態(tài)建成過(guò)程。通過(guò)這些植物關(guān)于PINs的相關(guān)研究揭示了生長(zhǎng)素外排載體基因在生長(zhǎng)素介導(dǎo)的植物生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)理。

本研究團(tuán)隊(duì)前期以歐洲白樺（）的種內(nèi)變種裂葉樺（‘Dalecarlica’）為試驗(yàn)對(duì)象，基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了白樺葉脈遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。基于前期白樺葉脈遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素輸出載體PIN（PIN-FORMED）蛋白參與白樺葉脈發(fā)育分子調(diào)控過(guò)程，同時(shí)團(tuán)隊(duì)前期已經(jīng)將白樺中的PIN 家族基因鑒定出來(lái)，發(fā)現(xiàn)白樺的基因組中，家族基因有6 個(gè)成員。然而，關(guān)于白樺PINs家族中的基因表達(dá)水平和非生物脅迫之間的聯(lián)系的潛在機(jī)制在很大程度上是未知的。鑒于此，以白樺為試驗(yàn)材料，在對(duì)基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，開(kāi)展基因的不同組織部位表達(dá)特性分析，IAA、GA、ABA 及光脅迫處理下基因應(yīng)答特性分析。為闡明在白樺生長(zhǎng)發(fā)育和非生物脅迫中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

外源激素及光脅迫處理材料：東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的白樺（）繼代苗。分別取生長(zhǎng)一致的無(wú)根苗轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基（木本植物專(zhuān)用培養(yǎng)基Woody Plant Basal Medium（WPM）+0.4 mg·L吲哚丁酸（IBA）+20 g·L蔗糖，pH=5.8）中培養(yǎng)20 d左右，轉(zhuǎn)接至土壤基質(zhì)培養(yǎng)基（蛭石∶草炭土=2∶1，WPM+20 g·L蔗糖，pH=5.8）中培養(yǎng)40 d 左右，培養(yǎng)條件為16 h/8 h 光暗循環(huán)，平均溫度約為25 ℃。每處理15株苗，均重復(fù)3次。

組織表達(dá)特性研究材料：定植于東北林業(yè)大學(xué)白樺強(qiáng)化種子園（45.724726°N，126.636002°E）中的1年生和2年生白樺無(wú)性系苗木。

試劑：RNA 提取試劑盒（RNeasy Plant Mini Kit，百泰克生物技術(shù)有限公司）、IAA（Sigma，USA）、GA（Sigma，USA）、ABA（Sigma，USA）。

1.2方法

1.2.1啟動(dòng)子序列響應(yīng)元件預(yù)測(cè)

利 用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線(xiàn)網(wǎng)站獲得（基因號(hào)：Bpev01.c1162.g0001.m0001），以及其他13 個(gè)物種同源基因啟動(dòng)子上游2 001 bp 序列。利用在線(xiàn)工具PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webt?ools/plantcare/html）和PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）分析14 個(gè)物種的14個(gè)同源基因起始密碼子上游2 kB 的啟動(dòng)子區(qū)域的順式調(diào)控元件。選擇低溫，激素反應(yīng)和光反應(yīng)相關(guān)的順式作用元件motif來(lái)分析啟動(dòng)子非生物脅迫響應(yīng)特異性，然后使用TBtools 對(duì)其進(jìn)行可視化。

于2020 年6 月，選取1 年生和2 年生白樺無(wú)性系苗木各5株，分別取頂芽、第1～2片葉、嫩莖及根組織，相同組織部位混樣后分為3 份，用液氮迅速冷凍，置于超低溫冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根部取材具體操作如下：整株植物挖出后，用流水沖洗去除根系上附著的土壤，剪取幼嫩根尖組織部位吸干水分后置于液氮中保存。

外源激素處理：參考劉宇等的方法進(jìn)行激素處理。將100 μmol·LIAA、100 μmol·LGA、200 μmol·LABA分別噴灑在組培苗葉片的表面，每瓶組培苗噴灑處理溶液約20 mL，使葉片表面濕潤(rùn)；在噴灑0、2、4、8、16、24、48 h 后，采集所有葉片和根（根組織取材方法同上），迅速放入液氮中冷凍并置于冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

光脅迫處理：選取已生根的組培苗遮光暗處理3 h 后，隨機(jī)選取15 株組培苗，采集所有葉片和根，迅速放入液氮中冷凍并置于冰箱-80 ℃中保存?zhèn)溆谩２⑶以谡诠馓幚? h 后將組培苗置于約25 ℃條件下進(jìn)行連續(xù)光照處理（光照強(qiáng)度為1 100 lx），分別在連續(xù)光照1、3、6、12、24、48、72 h 后，采集所有葉片和根，迅速放入液氮中冷凍并置于冰箱中-80 ℃保存、備用。

以上述采集樣品為材料，分別采用植物RNeasy提取試劑盒提取總RNA。用不含RNase的DNase Ⅰ（Promega）處理總RNA，以去除DNA 污染，通過(guò)分光光度法準(zhǔn)確定量RNA 濃度，取1 μg總RNA 于2%瓊脂糖凝膠上分離，檢測(cè)其完整性。然后以O(shè)ligo（dT）作為引物使用ReverTra AceqP?CR RT Master Mix 試劑盒（ToYoBo）對(duì)DNase 處理的RNA（2 μg）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，總體積為20 μL。將合成的cDNA 稀釋10 倍后置于冰箱中-20 ℃保存，備用。

根據(jù)基因片段序列使用Oligo7.0軟件設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)RT-PCR 分析的引物，引物為BpPIN3F（5′-CTGGGCCGGTGAGGAATCTA-3′）和BpPIN3R（5′-GTCGATCTCGATACTCTCCGATGCC-3′）。以18S rRNA（18S）為內(nèi)參基因，引物為18SF（5′-ATCTTGGGTTGGGCAGATGG-3′）和18SR（5′-CATTACTCCGATCCCGAAGG-3′）。用ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，具體操作參照黃海嬌等的方法。

使用18S 作為內(nèi)參基因，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量時(shí)，組織特異性試驗(yàn)中，將1年生白樺頂芽表達(dá)量設(shè)為“1”；不同激素和光脅迫處理下，以同期未處理材料為對(duì)照組，將其表達(dá)量設(shè)為“1”，采用7500 Sys?tem 軟件和2法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。采用SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組平均值之間進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并采用鄧肯新復(fù)極差法比較對(duì)照組與處理組間的差異顯著性，＜0.05 代表差異顯著。Graph Pad Prism 8.0軟件作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpPIN3基因啟動(dòng)子序列分析

在線(xiàn)分析軟件Plantcare（http：//bioinformatics.psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）和PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html）分析顯示，該啟動(dòng)子序列具有基本轉(zhuǎn)錄元件如核心元件TATA-box 和控制轉(zhuǎn)錄效率及頻率的CAAT-box，同時(shí)在的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)的順式作用元件。如表1 和圖1 所示，包括茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件（CGTCA-motif）、干旱脅迫響應(yīng)元件（MBS）、ABA響應(yīng)元件（ABRE）、赤霉素響應(yīng)元件（GARE-box 和P-box），以及各種光響應(yīng)元件如GT1-motif、G-box、TCT-box、box 4。在不同物種啟動(dòng)子元件差異分析發(fā)現(xiàn)：不同物種的光響應(yīng)元件數(shù)量存在差異，其他生理性響應(yīng)元件只在個(gè)別物種特異性出現(xiàn)，其主要差異體現(xiàn)在不同激素響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件的種類(lèi)以及數(shù)量上。白樺啟動(dòng)子中光響應(yīng)元件，ABA響應(yīng)元件以及赤霉素響應(yīng)元件的數(shù)量要明顯多于其他物種啟動(dòng)子。

圖1 14個(gè)物種的14個(gè)PIN3同源基因啟動(dòng)子元件展示Fig.1 14 PIN3 homologous gene promoter elements display of 14 species

表1 BpPIN3啟動(dòng)子區(qū)域主要順式作用元件預(yù)測(cè)Table 1 Prediction of major cis-acting elements in BpPIN3 promoter region

2.2 BpPIN3組織表達(dá)模式分析

白樺在不同組織部位的qRT-PCR 分析顯示（見(jiàn)圖2），無(wú)論是1年生還是2年生的白樺，該基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量顯著不同（＜0.05），其中1年生時(shí)，在第2葉片和莖段的相對(duì)表達(dá)量最高，而2 年生時(shí)其在第1 葉片的相對(duì)表達(dá)量最高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，2 年生的白樺的表達(dá)量明顯高于1 年生白樺，例如，2 年生時(shí)其頂芽表達(dá)量較1 年生的頂芽高151.76倍。

圖2 白樺BpPIN3不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量不同小寫(xiě)字母代表不同組織間差異顯著（P＜0.05）Fig.2 Relative expression of BpPIN3 in different tissues of B.platyphyllaDifferent lowercase letters represent significant differences between different tissue（sP＜0.05）

2.3 BpPIN3基因響應(yīng)IAA 、GA3、ABA及光脅迫的表達(dá)特性分析

順式作用元件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，基因啟動(dòng)子上具有IAA、GA和ABA 多種激素相關(guān)以及光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，試驗(yàn)選取IAA、GA和ABA 等3 種激素及光脅迫處理白樺組培苗，以不同激素和光照時(shí)間處理的白樺組培苗的cDNA為模板，以同期未處理的白樺組培苗為對(duì)照組，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)各處理?xiàng)l件下在不同組織及處理時(shí)間的表達(dá)模式進(jìn)行分析。

經(jīng)不同激素處理后，的相對(duì)表達(dá)分析顯示，IAA、ABA 處理后的白樺根組織中均呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，IAA 處理后的24 h 時(shí)的表達(dá)水平達(dá)到最高值，較0 h上調(diào)了2 082.39倍（見(jiàn)圖3A），而ABA 處理后的則是在48 h 時(shí)的表達(dá)水平達(dá)到最高值，較0 h 上調(diào)了29.06 倍（見(jiàn)圖3C）；GA處理后的根組織中僅在4、8 h 時(shí)呈顯著下調(diào)表達(dá)，其他時(shí)間點(diǎn)也是呈上調(diào)表達(dá)（見(jiàn)圖3B）。3 種激素處理后白樺葉片組織中該基因的應(yīng)答不盡相同，例如，在IAA 處理的2、8、16、24 h 時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)表達(dá)，只有4、48 h 呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)（見(jiàn)圖3A）；GA處理?xiàng)l件下，在葉片中呈顯著上調(diào)表達(dá)，尤其在8 h 時(shí)該基因表達(dá)量最高，較0 h 上調(diào)了1 663.78 倍（見(jiàn)圖3B）；ABA 處理后，只有4、16 h呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)（見(jiàn)圖3C）。

圖3 生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）處理后白樺BpPIN3基因相對(duì)表達(dá)量的變化A.100 μmol·L-1 IAA處理；B.100 μmol·L-1 GA3處理；C.200 μmol·L-1 ABA處理；不同小寫(xiě)字母代表不同處理間差異顯著（P＜0.05）；下同F(xiàn)ig.3 Changes of relative expression of BpPIN3 gene in B.platyphylla after IAA，GA and ABA treatmentA.100 μmol·L-1 IAA treatment；B.100 μmol·L-1GA3 treatment；C.200 μmol·L-1 ABA treatment；Different lowercaseletters represent distinct differences between different treatments（P＜0.05）；The same as below

遮光3 d 后連續(xù)光照脅迫條件下白樺基因的相對(duì)表達(dá)量分析顯示：無(wú)論在葉片還在根組織中，均呈顯著上調(diào)或上調(diào)表達(dá)（見(jiàn)圖4），在葉片中處理的3、6 h 時(shí)該基因被顯著誘導(dǎo)表達(dá)，而在根組織中12 h 時(shí)該基因顯著上調(diào)表達(dá)，較0 h上調(diào)表達(dá)21.14倍。

圖4 遮光3 天后連續(xù)光照脅迫條件下白樺BpPIN3 基因的相對(duì)表達(dá)量的變化Fig.4 Changes in the relative expression of BpPIN3 gene in B. platyphylla under continuous light stress after shading for 3 d

試驗(yàn)結(jié)果表明，在白樺中，當(dāng)其受到非生物脅迫時(shí)，通過(guò)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)發(fā)揮其功能。外源生長(zhǎng)素和赤霉素處理后，葉片組織白樺基因的相對(duì)表達(dá)量呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，但經(jīng)脫落酸處理后，除4、16 h 相對(duì)表達(dá)量顯著提高外，其余處理時(shí)間該基因的相對(duì)表達(dá)量則未能顯著提高；而這3種激素處理后，白樺根組織中的的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。經(jīng)遮光3 d后持續(xù)光照的脅迫處理后，葉片組織在顯著誘導(dǎo)的表達(dá)，但在根組織中12 h 后才開(kāi)始被誘導(dǎo)表達(dá)。總之白樺參與IAA、GA和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及植物的光響應(yīng)過(guò)程。但在不同激素處理、光脅迫以及處理時(shí)間條件下白樺的表達(dá)模式各異。

3 討論

植物在生命周期中不可避免地受到鹽、冷、高溫、光、外源激素和干旱等非生物脅迫。一系列證據(jù)也表明生長(zhǎng)素在參與調(diào)節(jié)植物對(duì)各種生物脅迫和環(huán)境刺激的響應(yīng)中起關(guān)鍵作用，環(huán)境脅迫響應(yīng)依賴(lài)生長(zhǎng)素在不同植物組織內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。生長(zhǎng)素的穩(wěn)態(tài)常常受到非生物脅迫的干擾，從而導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育的變化。研究植物體內(nèi)生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體基因與植物形態(tài)建成以及響應(yīng)抗逆調(diào)控的關(guān)系，以輔助育種工作，有著重要的理論和實(shí)踐意義。

生長(zhǎng)素通過(guò)調(diào)控大量被認(rèn)為參與非生物脅迫應(yīng)答的生長(zhǎng)素響應(yīng)基因來(lái)介導(dǎo)植物的各種非生物脅迫應(yīng)答。據(jù)報(bào)道，生長(zhǎng)素的再分配是植物在挑戰(zhàn)環(huán)境中生存的重要過(guò)程。各種環(huán)境和非生物信號(hào)可通過(guò)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素運(yùn)輸和PIN 蛋白極性來(lái)改變生長(zhǎng)素的分布進(jìn)而參與對(duì)非生物脅迫（如激素、干旱、冷、光脅迫和堿性脅迫）的響應(yīng)。在水稻（）中，基因表現(xiàn)出組織特異性，葉中被發(fā)現(xiàn)受到激素的調(diào)控，研究表明除和外，其余基因均受到IAA誘導(dǎo)表達(dá)。在玉米的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IAA 處理后，莖 組 織 中、、、和的表達(dá)水平顯著上調(diào)；根中和的表達(dá)水平顯著上調(diào)，其余許 多 基 因，如、、、、和的表達(dá)水平則顯著下調(diào)。對(duì)歐洲白樺及其種內(nèi)變種裂葉樺間的不同組織部位中表達(dá)特性分析顯示，在兩種樺樹(shù)中均明顯下調(diào)表達(dá)，說(shuō)明其在白樺生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。對(duì)白樺啟動(dòng)子克隆以及外源激素應(yīng)答分析試驗(yàn)證明，在白樺第1 葉的裂葉邊緣和第2 葉葉柄及根組織中經(jīng)ABA、GA、Me-JA、SA 和IAA 處理后均有響應(yīng)，響應(yīng)的變化趨勢(shì)也基本一致。以上研究均證明廣泛參與植物體內(nèi)生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在植物器官發(fā)育以及形態(tài)建成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也是脅迫響應(yīng)和防御反應(yīng)的重要參與者。

在白樺中，通過(guò)進(jìn)一步的研究，包括對(duì)生長(zhǎng)素外排載體的生啟動(dòng)子分析以及基因表達(dá)特性和應(yīng)答特性分析，將提高我們對(duì)白樺中生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)體與非生物脅迫關(guān)系的認(rèn)識(shí)。啟動(dòng)子順式作用元件分析表明，該基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活受水楊酸、赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯等激素的調(diào)控以及光響應(yīng)、干旱誘導(dǎo)、低溫等環(huán)境脅迫的調(diào)控，特別是脫落酸和光響應(yīng)元件，分別各為7 個(gè)（見(jiàn)表1）并且響應(yīng)元件數(shù)量多于其他物種基因。本研究對(duì)白樺的組織表達(dá)特性分析顯示，該基因具有組織特異性，在頂芽、葉片、莖和根等組織部分均有表達(dá)，且在不同的組織中表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)模式。同樣，在其他植物中，例如，在茶樹(shù)（）中，花組織中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量最低，并且隨著芽的發(fā)育表達(dá)量呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。在擬南芥中，在第十五花期的花中表達(dá)量最高，而在心皮組織中表達(dá)量最低。在裂葉樺中嫩莖的表達(dá)量最高，而在歐洲白樺中頂芽的表達(dá)量最高，裂葉樺和歐洲白樺的葉組織中基因的表達(dá)量均低于其他組織部位。在不同植物組織中的這種不同響應(yīng)可能解釋為植物適應(yīng)不同組織的特定作用、發(fā)育和環(huán)境條件的需要。通過(guò)1 年生與2 年生植株組織部位間比較發(fā)現(xiàn)，各組織部位中的表達(dá)量均較前一年顯著上調(diào)，這些結(jié)果表明，可能在白樺的各個(gè)時(shí)期和各個(gè)組織部位都發(fā)揮作用，并隨著白樺的生長(zhǎng)發(fā)育，作用效果愈發(fā)顯著，推測(cè)該基因易受外界條件變化影響。本研究中，在用外源激素IAA、GA、ABA，以及光脅迫條件分別處理后白樺葉片和根部的表達(dá)情況表明，在葉片中，在GA以及光脅迫條件下呈穩(wěn)定的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，而在其他兩種激素處理下，除16、48 h 外，ABA 處理下基因表現(xiàn)出與IAA 處理下相反的表達(dá)模式。說(shuō)明在白樺葉片中，這種差異可能是由于A(yíng)BA 對(duì)生長(zhǎng)素水平的反作用造成的：ABA 既可以通過(guò)激活I(lǐng)AA 結(jié)合降低生長(zhǎng)素含量，也可以通過(guò)激活I(lǐng)AA 合成促進(jìn)其積累，進(jìn)而影響葉片中生長(zhǎng)素外排載體基因的表達(dá)量。在根組織中，感知外源GA和光脅迫處理后的表達(dá)差異只有在處理后一段時(shí)間（GA處理16 h，光脅迫12 h）后才出現(xiàn)穩(wěn)定的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，而在A(yíng)BA 和IAA 處理下基因快速呈現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。不同外源激素以及光脅迫處理下，白樺根部基因激活時(shí)間的差異很可能是由于該基因在白樺體內(nèi)參與各激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和光響應(yīng)過(guò)程中傳遞方式的差異所導(dǎo)致（圖3：A～C，圖4）。研究表明單側(cè)光和重力刺激都會(huì)刺激植物體內(nèi)3 極化，進(jìn)而導(dǎo)致植物器官形態(tài)發(fā)生變化。紫苜蓿中，在低R/FR 光處理下，被誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)遮蔭產(chǎn)生響應(yīng)，說(shuō)明和在不同環(huán)境下對(duì)避光反應(yīng)起雙重調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)遮光處理后，基因在白樺葉片以及根部中均被誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)光照反應(yīng)產(chǎn)生響應(yīng)，證明參與白樺光響應(yīng)的調(diào)控過(guò)程，但感應(yīng)外源激素和光脅迫刺激而表達(dá)的基因是如何參與調(diào)節(jié)白樺適應(yīng)外界環(huán)境刺激，仍有待深入研究。

本研究分析了白樺基因的啟動(dòng)子順式作用元件并研究了白樺不同發(fā)育時(shí)期不同組織部位以及在外源激素以及光脅迫條件下不同組織間的表達(dá)差異，探討了生長(zhǎng)素外排載體基因在白樺IAA、GA和ABA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及光響應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)模式，為深入揭示生長(zhǎng)素調(diào)控抗逆分子機(jī)制以及生長(zhǎng)發(fā)育提供了理論依據(jù)。但生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體數(shù)量眾多，且參與生長(zhǎng)素調(diào)控抗逆以及影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的基因有很多。如生長(zhǎng)素內(nèi)流載體（AUX/LAX）、生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家（ABCB/MDR/PGP）、生長(zhǎng)素受體基因TIR 等。因此，作為生長(zhǎng)素信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵點(diǎn)，下一步應(yīng)將與其他基因相結(jié)合，從其功能以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面深入挖掘生長(zhǎng)素外排載體基因調(diào)控白樺器官形成與發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

通過(guò)分析白樺上游2 001 bp的啟動(dòng)子序列發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子序列包含赤霉素、脫落酸、茉莉酸甲酯等不同類(lèi)型的生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，以及多個(gè)與逆境相關(guān)的順式調(diào)控元件。組織表達(dá)特性試驗(yàn)證明在不同生長(zhǎng)年份白樺的多個(gè)組織部位均有表達(dá)，尤其在葉片中表達(dá)量較高，并且所有組織部位中第二年的表達(dá)量均高于第一年。不同激素和光脅迫處理發(fā)現(xiàn)，基因受外源IAA、GA和ABA 誘導(dǎo)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)參與白樺光響應(yīng)調(diào)控過(guò)程。