羽衣甘藍(lán)BoMAPK4原核表達(dá)、抗體制備及蛋白表達(dá)分析

栗赫銘 秦洪濤 魏德強(qiáng) 李 旭 藍(lán)興國

（東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040）

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)通路是真核生物中保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，典型的MAPK信號網(wǎng)絡(luò)由3種特定的蛋白激酶組成，即MAPK激酶激酶（MAPKKKs）、MAPK 激酶（MKKs）和MAPKs，其在保守的激活位點(diǎn)被磷酸化依次激活。MAPK在植物的生物和非生物脅迫反應(yīng)以及生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其轉(zhuǎn)錄水平通常受生長、發(fā)育和脅迫信號的調(diào)控。MAPK 信號級聯(lián)能夠?qū)е录?xì)胞骨架蛋白、磷脂酶和微管相關(guān)蛋白的激活，參與植物各種生理、發(fā)育和植物激素應(yīng)答反應(yīng)。

目前，植物MAPK 信號通路的研究集中在MAPK3/6 和MAPK4 上，通過與上下游蛋白組分相互作用，調(diào)節(jié)多種生理及發(fā)育反應(yīng)。MAPK4 在甘藍(lán)型油菜（）生長發(fā)育過程具有重要調(diào)節(jié)作用。MAPK4 控制擬南芥（）花粉及花藥的發(fā)育，并且MAPK3/4是授粉反應(yīng)所必需的，這兩個(gè)蛋白的丟失會導(dǎo)致花粉萌發(fā)和花粉管生長嚴(yán)重減少。MKK6-MAPK4/11 通路能夠直接調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂和有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞板擴(kuò)張和雄性特異性減數(shù)分裂。MAPK4 可引發(fā)細(xì)胞凋亡，MAPK4 的下游底物MAP56 通過參與Cd誘導(dǎo)的根細(xì)胞凋亡的方式參與控制細(xì)胞分裂和根系的生長。體外磷酸化位點(diǎn)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MAPK4/6具有調(diào)節(jié)植物生長素的運(yùn)輸以及調(diào)節(jié)植物器官生長情況的功能。MAPK4 可以通過影響花青素積累及生長發(fā)育過程中碳的分配進(jìn)而影響發(fā)育過程。在的RNAi植株中發(fā)現(xiàn)，提高了種子的產(chǎn)量。這些結(jié)果表明MAPK4 在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。

本研究以北方重要的耐寒觀賞性植物羽衣甘藍(lán)（var.）為材料，分離柱頭中基因，進(jìn)行序列分析；通過原核表達(dá)純化BoMAPK4 重組蛋白，制備MAPK4 多克隆抗體；利用免疫印跡技術(shù)分析MAPK4 在花各組織中的蛋白表達(dá)情況，為MAPK4 的生物學(xué)功能研究提供更多線索。

1 材料與方法

1.1羽衣甘藍(lán)BoMAPK4基因分離及序列分析

通過前期蛋白質(zhì)組學(xué)的研究獲得了羽衣甘藍(lán)BoMAPK4 的氨基酸序列，并參考從甘藍(lán)基因組（LOC106335943）中的序列，設(shè)計(jì)特異性上游引物MAPK4-RT-For 和下游引物MAPK4-RT-Rev（見表1）。通過E.Z.N.A.Plant RNA Kit（Omega公司）提取羽衣甘藍(lán)自交不親和系（S S）柱頭總RNA，用TranScriptOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金公司）反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得羽衣甘藍(lán)柱頭cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件設(shè)置如下：94 ℃2 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1.5 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。分離純化PCR 后，與pGEM-T 載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α菌株中，用藍(lán)白斑篩選法挑選陽性克隆。重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，進(jìn)行測序分析。

表1 BoMAPK4基因克隆及原核表達(dá)引物Table 1 Cloning and prokaryotic expression primers of BoMAPK4

1.2羽衣甘藍(lán)BoMAPK4的生物信息學(xué)分析

參照文獻(xiàn)［24-25］提供的生物信息分析方法，對BoMAPK4 氨基酸序列及保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析，通過網(wǎng)站ProtParam（http：//www.expasy.org）預(yù)測編碼蛋白的分子量及理論等電點(diǎn)等。通過SMART 網(wǎng) 站（https：//smart.embl-heidelberg.de）進(jìn)行活性結(jié)構(gòu)類型、跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽分布預(yù)測，通過SWISSMODEL 軟 件（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白活性基序位置。使用ClustalW 與NCBI數(shù)據(jù)庫的油菜BnMAPK4（NP_001303145.1）、蕪菁（）BrMAPK4（XP_009134529.1）和擬南芥AtMAPK4（NP_192046.1）進(jìn)行同源性分析比對。

1.3原核表達(dá)質(zhì)粒pET-14b-MAPK4的構(gòu)建

設(shè) 計(jì) 引 物MAPK4-pET-For（5′-GACGGTAC?CATGTCGGCGGAGAACTGTTT-3′）及MAPK4-pETRev （5′-GACGGATCCTTACTGAGGATTGAACTT?GA-3′）（見表1）進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：98 ℃，5 min；98 ℃，10 s，60 ℃，10 s，72 ℃10 s，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物純化回收后與pET-14b 載體進(jìn)行連接，構(gòu)建pET-14b-BoMAPK4 載體，轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌（）感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR 鑒定、酶切條帶鑒定以及測序分析。

1.4羽衣甘藍(lán)BoMAPK4的原核表達(dá)及純化

參考李陽等的方法進(jìn)行純化。提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）大腸桿菌表達(dá)菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)中期OD=0.6，加入異丙基--硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol·L。37 ℃誘導(dǎo)4 h 后少量菌液（500 μL）樣品離心收集菌體，進(jìn)行12%的SDS-PAGE 電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀察蛋白表達(dá)情況。大量菌液（100 mL）經(jīng)過4 ℃6 000 r·min離心收集菌體，用5 mL bind?ing buffer（30 mmol·LNaCl；10 mmol·L咪唑；20 mmol·LTris-base；pH=8.0）重懸菌體，于冰上進(jìn)行超聲破碎，4 ℃12 000 r·min離心20 min 收集上清液。取用Binding buffer 新平衡后層析柱，加入100 μL Ni-NTA Agarose（Novagen 公司），室溫結(jié)合2 h 后，采用washing buffer（20、30、40 mmol·L咪唑含量binding buffer，pH=8.0）依順序進(jìn)行柱洗脫。最終采用250 mmol·L咪唑收集液（pH=8.0）進(jìn)行洗脫收集流出液。向Amicon Ultra-4（3000）透析柱中加入PBS緩沖液（2.68 mmol·LKCl，1.46 mmol·LKHPO，137 mmol·LNaCl，8.1 mmol·LNaHPO，pH=7.4）在4 ℃下對收集的融合蛋白進(jìn)行透析，經(jīng)PierceBCA Protein Assay Kit 試劑盒（Thermo 公司）定量分裝于冰箱中-20 ℃保存。

1.5羽衣甘藍(lán)BoMAPK4多克隆抗體的制備及檢測

多克隆抗體制備方法參照Li等的文獻(xiàn)。將獲得蛋白通過弗氏完全佐劑（Freund’s Adjuvant）乳化后免疫6～8 周雄性Balb/C 小鼠，進(jìn)行3 次后間隔3 d，第4次加強(qiáng)免疫無弗氏完全佐劑，直接注射小鼠腹腔，共4次免疫。3 d后處死小鼠取血，室溫靜置離心后獲得anti-BoMAPK4 血清多克隆抗體，混合等量100%甘油后，-80 ℃保存。分別對pET-14b 載體和BoMAPK4-pET-14b 重組載體轉(zhuǎn)化的BL21（DE3）菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE以及免疫印跡鑒定抗體特異性。

1.6羽衣甘藍(lán)BoMAPK4的表達(dá)分析

收集羽衣甘藍(lán)自交不親和系（S S）萼片、花瓣、花藥、柱頭、花柱和子房。參考Lan等的方法分別進(jìn)行花的各組織總蛋白提取及定量。將材料充分研磨，加入總蛋白提取緩沖液（50 mmol·LHepes，pH=7.5；5 mmol·LEDTA；10 mmol·LDTT；1 mmol·LPMSF；10%甘油；Cocktail tablet）分別進(jìn)行提取。按照BSA 終濃度從0～100 mg·L含量以PBS 緩沖液稀釋，每孔加入考馬斯亮藍(lán)染色液及樣品。結(jié)合5 min 后，在SPARK 酶標(biāo)儀（Tekan）595 nm 下測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對蛋白樣品進(jìn)行定量。取各組織定量后樣品10 μg，進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳。通過濕轉(zhuǎn)印法（280 V，1 h）將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜中，在室溫下，用含有5%牛 血 清 白 蛋 白 的TBST（137 mmol·LNaCl，20 mmol·LTris base，0.1%Tween-20）封閉1 h。以制備的BoMAPK4 多克隆抗體作為一抗，以山羊抗鼠抗體IgG 抗體（HRP）（亞科因公司）作為二抗進(jìn)行孵育，通過ECLPrime Western Blotting Detection Reagents（Cytiva公司）在Tanon 2000儀器下觀察進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1羽衣甘藍(lán)MAPK4基因的克隆及生物信息學(xué)分析

以羽衣甘藍(lán)柱頭總cDNA 為模板，通過RTPCR 的方法獲得了長度為1 193 bp 的cDNA 序列，將其命名為BoMAPK4（見圖1）。BoMAPK4 中含有一個(gè)長度為1 122 bp 的開放閱讀框（open read?ing frame，ORF），編碼373 個(gè)氨基酸（見圖2）。BoMAPK4 的分子量約42.5 kDa，等電點(diǎn)為5.85。在結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)287 個(gè)氨基酸長度的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，位于43～329 的氨基酸序列，無跨膜區(qū)和信號肽，MAPK 活化環(huán)序列位于197～204位置，201-203為TEY基序（見圖3）。

圖1 羽衣甘藍(lán)BoMAPK4的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification products of ornamental kale BoMAPK4 gene by RT-PCR

圖2 BoMAPK4全長cDNA核苷酸序列及推測氨基酸序列Fig.2 Full-length cDNA sequence of BoMAPK4 and putative amino acid sequence

圖3 BoMAPK4蛋白功能結(jié)構(gòu)域及位置預(yù)測藍(lán)色條紋處代表從氨基酸序列43～329位置為絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域；紅色代表活化環(huán)位置，其上綠色代表TEY基序Fig.3 Prediction of BoMAPK4 protein functional domain and siteThe blue stripe represents the serine/threonine domain from positions 43～329 in the amino acid sequence；The red color represents the position of the activation loop，and the green color above it represents the TEY motif

氨基酸序列比對分析表明，BoMAPK4 與油菜BnMAPK4 具有99.7%的一致性，與蕪菁BrMAPK4具有99.5%的一致性，與擬南芥AtMAPK4 具有95.4%的一致性（見圖4）。這說明MAPK4 蛋白在十字花科（Brassicaceae）植物中高度保守。

圖4 羽衣甘藍(lán)BoMAPK4與油菜BnMAPK4、蕪菁BrMAPK4、擬南芥AtMAPK4氨基酸序列比對Fig.4 Comparison of amino acid sequences of BoMAPK4 with BnMAPK4，BrMAPK4 and AtMAPK4

2.2羽衣甘藍(lán)MAPK4原核表達(dá)及多克隆抗體制備

通過構(gòu)建的pET-14b-BoMAPK4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）菌株，對BoMAPK4 蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明在45 kDa左右有蛋白條帶特異性的誘導(dǎo)?？紤]載體的His標(biāo)簽具有2 kDa分子量，因此特異誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白與預(yù)期的重組BoMAPK4大小相符。通過親和純化后，SDS-PAGE結(jié)果獲得的重組BoMAPK4蛋白的條帶單一，純度較好（見圖5）。

圖5 BoMAPK4原核表達(dá)及純化的結(jié)果將誘導(dǎo)前細(xì)菌蛋白、誘導(dǎo)后細(xì)菌蛋白和通過Ni2+-NTA 樹脂純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色Fig.5 The prokaryotic expression and purification of BoMAPK4SDS-PAGE was performed on the bacterial protein before induction，the bacterial protein after induction，and the protein purified by Ni2+-NTA Agarose，the result was stained with Coomassie Brilliant blue

利用獲得重組BoMAPK4 免疫小鼠，獲得BoMAPK4 的多克隆抗體。為了檢測獲得的抗體特異性，分別將通過IPTG 誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的pET-14b空載體以及BoMAPK4轉(zhuǎn)化的BL21（DE3）菌液進(jìn)行免疫印記分析。結(jié)果表明在45 kDa處空載體以及未IPTG 誘導(dǎo)pET-14b-BoMAPK4 轉(zhuǎn)化菌液沒有條帶，而誘導(dǎo)后BoMAPK4 菌液有目標(biāo)條帶（見圖6）。這說明該多克隆抗體能特異性結(jié)合BoMAPK4，具有良好的特異性。

圖6 免疫印跡分析BoMAPK4多克隆抗體特異性a.SDS-PAGE 的考馬斯亮藍(lán)染色；b.使用抗BoMAPK4抗體進(jìn)行蛋白印跡；空pET-14b載體及構(gòu)建的pET-14b-BoMAPK4用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞，IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)；每個(gè)泳道中加入來自IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)之前（-）或之后（+）的菌液Fig.6 Western blotting analysis to detect the specificity of BoMAPK4 polyclonal antibodya.Coomassie brilliant blue staining of SDS-PAGE；b.Western blotting with BoMAPK4 antibody；The empty pET-14b vector or the construct pET-14b-BoMAPK4 was used to transform E.coli BL21 cells，and expression of the fusion protein was induced by IPTG；Bacteria cell extracts from be?fore（-）or afte（r+）IPTG induction of protein synthesis were loaded in each lane

2.3免疫印跡分析BoMAPK4在羽衣甘藍(lán)各組織中的表達(dá)

提取羽衣甘藍(lán)萼片、花瓣、花藥、柱頭、花柱和子房的總蛋白質(zhì)，利用制備的BoMAPK4 的抗體對BoMAPK4 蛋白進(jìn)行組織特異性蛋白表達(dá)分析。免疫印跡的結(jié)果表明，在檢測的蛋白樣品中，在分子量大約43 kDa 處有特異條帶表達(dá)，這與預(yù)期的BoMAPK4 的大小相符；BoMAPK4 在花瓣、花藥和子房中表達(dá)的較少，萼片和花柱中表達(dá)的較多，在柱頭中的表達(dá)量最高（見圖7）。

圖7 BoMAPK4免疫印跡分析通過BoMAPK4抗體對羽衣甘藍(lán)萼片、花瓣、花藥、柱頭、花柱和子房的總蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測；通過考馬斯亮藍(lán)（CBB）對膜進(jìn)行染色Fig.7 Western blotting analysis of BoMAPK4Western blotting detection of BoMAPK4 using sepal，petal，anther，stigma，style and ovary of ornamental kale by the polyclonal antibody against BoMAPK4；The membrane was stained with Coomassie Brilliant Blue（CBB）

3 討論

在本研究中，通過分離羽衣甘藍(lán)的基因序列，對其進(jìn)行氨基酸序列分析及結(jié)構(gòu)分析，對BoMAPK4 蛋白的基礎(chǔ)特征進(jìn)行展現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)BoMAPK4具有絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，具有磷酸化下游蛋白底物的功能。 TEY 基序證明了BoMAPK4蛋白具有B 類MAPK 家族蛋白的活性特征。進(jìn)行蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，BoMAPK4 與油菜、蕪菁、擬南芥的序列相似度較高，氨基酸序列差異的數(shù)量和位置也基本相似，這說明MAPK4 在十字花科植物進(jìn)化中高度保守，并在十字花科植物中MAPK4 因結(jié)構(gòu)相似可能存在部分類似功能。BoMAPK4 原核表達(dá)純化結(jié)果在45 kDa 處得到被誘導(dǎo)的蛋白；采用親和層析方式可以得到純度較高的BoMAPK4 蛋白。使用該蛋白進(jìn)行小鼠免疫獲得多克隆抗體，檢測結(jié)果表示抗體特異性較好。利用制備的BoMAPK4 多克隆抗體，發(fā)現(xiàn)BoMAPK4在花各組織中均有表達(dá)，而且BoMAPK4在柱頭中表達(dá)量最高。

MAPK 級聯(lián)通路是真核生物中常見的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與植物多種生理、發(fā)育和植物激素反應(yīng)。其中MAPK3/6 是研究最多的A 類MAPK，而MAPK4 是B 類MAPK 蛋白的研究熱點(diǎn)。YDAMAPKK4/MAPKK5-MAPK3/6 級聯(lián)能通過磷酸化來控制氣孔的發(fā)育及閉合和植物花器官發(fā)育。此外，MAPK3 調(diào)節(jié)根的數(shù)量，參與芽形成；MAPK6調(diào)節(jié)根的長度和強(qiáng)壯情況，控制水稻（）的谷物粒大小。而MAPK4在調(diào)節(jié)植物器官生長功能表現(xiàn)為調(diào)節(jié)植物生長素的運(yùn)輸。并且參與有絲分裂/胞質(zhì)分裂和微管組織的動態(tài)變化，以及影響根細(xì)胞凋亡。通過磷酸化MYB75 底物方式參與光誘導(dǎo)花青素的合成，進(jìn)一步影響碳的分配，從而對營養(yǎng)生長正調(diào)控。在擬南芥中MAPK4 影響花粉及花藥的發(fā)育，擬南芥柱頭特異性抑制突變體表現(xiàn)出柱頭花粉附著和萌發(fā)的嚴(yán)重減少，結(jié)果表明為授粉必需，且這一MAPK 途徑集中于。本研究從羽衣甘藍(lán)自交不親和系S S中分離基因，制備多克隆抗體及免疫印跡對BoMAPK4 進(jìn)行組織特異性蛋白表達(dá)分析，明確BoMAPK4 為柱頭表達(dá)豐富蛋白，表明BoMAPK4可能在柱頭授粉中具有功能。在未來的研究中，我們將進(jìn)一步解析BoMAPK4 在羽衣甘藍(lán)柱頭中的具體功能，為MAPK 家族的生物學(xué)功能提供更多線索。