通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定花椒中草甘膦及代謝物殘留

王展華，施 貝，張文萍，岳 超，柴妍熙

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052；2.浙江中醫(yī)藥大學醫(yī)學技術(shù)與信息工程學院，浙江杭州 310053)

花椒是我國傳統(tǒng)的香辛料，在我國西南地區(qū)的菜肴烹飪中占有舉足輕重的作用，其衍生產(chǎn)品在醫(yī)藥、農(nóng)藥、防蟲等方面具有重要的使用價值。近年來隨著四川重慶火鍋風靡全國，花椒的產(chǎn)銷量呈遞增趨勢，預計到2025年，全國花椒的需求量將接近100萬t。花椒種植及相關(guān)產(chǎn)業(yè)規(guī)模逐年擴大，但是對于可以花椒上登記使用的農(nóng)藥品種尚無明確規(guī)定，導致花椒產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留超標的現(xiàn)象時有發(fā)生。

草甘膦屬于非選擇類除草劑，在使用后會發(fā)生降解，其主要降解產(chǎn)物是氨甲基膦酸，目前對于草甘膦項目的檢驗主要檢測草甘膦和氨甲基膦酸。隨著草甘膦在全球被廣泛大量應(yīng)用，草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸在環(huán)境及其生物體中富集，對人類的健康造成很大的威脅，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)于2015年3月20日判定，草甘膦具有遺傳毒性，它可以損壞DNA，對動物致癌。在日常監(jiān)測中由于草甘膦及其代謝物本身為強極性，且含膦酸基和氨基酸基兩性基團，缺少發(fā)色和熒光基團，無法直接使用紫外及熒光檢測器進行檢測。草甘膦沸點為465.8 ℃，其代謝物氨甲基膦酸沸點為358.0 ℃，無法直接使用氣相色譜進行檢測。目前用于草甘膦及其代謝物的檢測方法主要采用化學衍生的方法，通過降低沸點或增加發(fā)色熒光基團來改善GC和HPLC的色譜行為，提高檢測響應(yīng)值。

目前我國頒布的《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中對谷物、油料油脂等7類食品的草甘膦限量作出了具體的規(guī)定，限量標準0.05～7.00 mg/kg；但是其中調(diào)味料中僅對葉類調(diào)味料和胡椒作出了限量規(guī)定，對花椒沒有作出相應(yīng)的規(guī)定。在實際風險監(jiān)測中參照調(diào)味料草甘膦推薦測定方法SN/T 1923和GB/T 23750對花椒中的草甘膦殘留量進行監(jiān)測，由于2種方法均使用了CAX陽離子固相萃取柱進行凈化，為傳統(tǒng)的吸附-洗脫模式，試驗發(fā)現(xiàn)，上述2種檢測標準中采用凈化淋洗液為水相，水相凈化液需使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，耗時較長，凈化操作過程中需要頻繁轉(zhuǎn)移，操作步驟較為煩瑣。筆者選取花椒為研究基質(zhì)，利用親水親脂固相萃取柱的特點，使用通過式固相萃取技術(shù)對目標物的凈化，建立通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定花椒中草甘膦及其代謝物(氨基甲酸膦酸)殘留的分析方法，以期為日常監(jiān)督抽檢中花椒中草甘膦及其代謝物快速檢測提供依據(jù)，同時對香辛料中草甘膦及其代謝物殘留檢測標準制定和更新具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

Shimadzu LC-30AD超高效液相色譜儀(日本島津公司)；SCIEX Triple Quad5500+系統(tǒng)-QTRAPActivated質(zhì)譜儀(美國ABSciex公司)；Merck Milli-Q超純水儀(德國默克密理博公司)；Sorvall LYNX 6000 超速離心機(美國熱電公司)；XPE205分析天平(瑞士梅特勒公司)；MultiReax多通道旋渦混合器(德國Heidolph公司)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(美國waters公司)；Waters Oasis HLB (200 mg，6 mL) 固相萃取柱(美國沃特世公司)；0.22 μm有機濾膜(上海安譜實驗科技股份有限公司)。

甲醇(hypergrade for LC-MS，Merck KGaA)；乙腈(hypergrade for LC-MS，Merck KGaA)；丙酮(AR，國藥集團化學試劑有限公司)；氯甲酸-9-芴基甲酯(衍生級，純度≥99.9%，上海安譜科學儀器有限公司)；草甘膦(純度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；氨甲基膦酸(純度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；1，2-CN草甘膦(純度≥99.8%，TRC Canada);二氯甲烷(AR，國藥集團化學試劑有限公司)；十水合四硼酸鈉(AR，國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸二氫鉀(AR，國藥集團化學試劑有限公司)；花椒(采購于杭州聯(lián)華超市)。

標準溶液的配制。

草甘膦及其代謝物標準儲備液的配制。準確稱取草甘膦和氨甲基膦酸各10.0 mg置于50 mL容量瓶中，用純水溶解后定容至刻度，得到濃度為200 μg/mL的混合標準儲備液。

草甘膦及其代謝物標準中間液的配制。準確量取草甘膦及其代謝物標準儲備液50 μL置于10 mL容量瓶中，用純水至刻度，得到濃度為1 mg/L的混合標準中間液。

同位素內(nèi)標儲備溶液的配制。準確稱取1 mg的1，2-CN草甘膦置于10 mL容量瓶中，用純水定容至10.0 mL得濃度為100 μg/mL同位素內(nèi)標儲備溶液。

同位素內(nèi)標工作溶液的配制。取1 mL同位素內(nèi)標儲備溶液于10 mL容量瓶中，用純水定容至10.0 mL得濃度為10 μg/mL同位素內(nèi)標儲備溶液。

樣品前處理。準確稱取粉碎后的花椒樣品2.0 g于50 mL 塑料離心管中，同時加入100 μL同位素內(nèi)標儲備溶液(濃度為10 μg/mL)，靜置10 min，加入10 mL水，置于MultiReax多通道旋渦混合器上渦旋混合20 min，加入5 mL二氯甲烷，渦旋混合10 min，以5 000 r/min離心10 min，取水相于10 mL玻璃試管中作為待凈化液。取5 mL凈化液，使用Waters Oasis HLB(200 mg，6 mL)親水親脂固相萃取柱進行凈化，棄去初始2 mL樣液，收集洗脫液，待衍生。取1 mL樣品洗脫液于10 mL具塞玻璃比色管中，加入200 μL 5%硼酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻。加入200 μL 1.0 g/L 氯甲酸-9-芴基甲酯-丙酮溶液，渦旋混勻。在20 ℃下放置4 h，進行衍生化反應(yīng)。衍生化溶液使用0.22 μm有機濾膜過濾后進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

標準曲線溶液的制備。分別量取草甘膦及其代謝物混合標準中間液(1 mg/L)50、100、500、1 000、2 000、5 000 μL，置于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，作為混合標準工作溶液，濃度分別為5、10、50、100、200、500 μg/L。移取標準工作溶液各1.0 mL加入同位素內(nèi)標工作溶液(100 μg/mL)10 μL，按樣品衍生化方法進行衍生化處理，用0.22 μm有機濾膜過濾，進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件。島津LC-30AD超高效液相色譜系統(tǒng)串聯(lián)Applied Biosystems Qtrap 5500三重四級桿質(zhì)譜儀，包括二元泵，在線脫氣，自動進樣器；色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 (150 mm×2.1 mm，1.8 μm)；柱溫為35 ℃；流動相為0.1%甲酸混合水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈混合溶液(B)；梯度洗脫程序：0～2 min，10%B，2～5 min，10%～80%B，5～8 min，80%～10%B；流速0.35 mL/min；進樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：離子源為TurboV 電噴霧(ESI)離子源；電離方式為正離子；霧化電壓(IS)5 500 V；離子源溫度(TEM)500 ℃；霧化氣壓力(GS1)344.7 kPa；輔助加熱氣壓力(GS2)344.7 kPa；碰撞室入口電壓(EP)10 V；碰撞室出口電壓(CXP)13 V；碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)、定性離子對、定量離子對、化合物分子量見表1。

表1 質(zhì)譜條件Table 1 Mass spectrometry conditions

分離色譜柱的選擇。選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3(150 mm×2.1 mm，1.8 μm)和Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)進行分離試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱進行分離時，草甘膦衍生物和氨甲基磷酸衍生物分離較好、峰型良好，響應(yīng)優(yōu)于Waters ACQUITY UPLC BEH-C色譜柱。主要原因是其C烷基鍵合相進行了基端封尾，提升了極性化合物的保留，能夠更好分離2種物質(zhì)。

液相色譜條件的優(yōu)化。該研究采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱作為分離柱，比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(0.1%甲酸)、乙腈-水(0.1%甲酸)4種流動相，結(jié)果表明，乙腈-水作為流動相時，由于乙腈的洗脫能力強于甲醇，對于草甘膦衍生物和氨甲基膦酸的分離度和靈敏度明顯優(yōu)于甲醇-水；在水相中添加0.1%甲酸可使草甘膦及其代謝物的衍生物預先在流動相中質(zhì)子化，提高離子化效率，從而提高檢測靈敏度。通過比較0.1%甲酸濃度對2種衍生物的影響，最終確定流動相為乙腈-水(0.1%甲酸)。在此流動相條件下各物質(zhì)均能很好地分離。進一步對梯度洗脫條件進行了優(yōu)化，目標物分離度良好、保留時間適中，優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖見圖1～3。

由于草甘膦和氨甲基膦酸衍生物均適合在ESI正離子模式下進行檢測，使用500 μg/L的草甘膦和氨甲基膦酸標準溶液，按方法標準進行衍生化處理后，在正離子模式掃描下，根據(jù)相應(yīng)物質(zhì)的分子量確定一級質(zhì)譜的掃描范圍，分別進行一級質(zhì)譜掃描找到母離子，進行二級質(zhì)譜掃描確定出2～3個相應(yīng)比較高的子離子，最后通過多反應(yīng)檢測掃描優(yōu)化相應(yīng)質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化結(jié)果見表1。

圖1 1,2-14C215N草甘膦衍生物多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring ion chromatogram of 1,2-14C215N glyphosate-FMOC

圖 2 草甘膦衍生物多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring ion chromatogram of glyphosate-FMOC

圖3 氨甲基膦酸衍生物多反應(yīng)監(jiān)測離子流色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring ion chromatogram of aminomethyl phosphonic-FMOC

提取條件的優(yōu)化。草甘膦及其代謝物溶于水，不溶于一般的有機溶劑，目前的國家標準和相應(yīng)研究中均使用水提取溶劑?；ń窐悠分泻腥?、甾醇、酰胺、生物堿等化合物，其揮發(fā)油含量大于0.025 mL/g。這些大分子物質(zhì)進行液相質(zhì)譜分析時在對色譜柱和離子源產(chǎn)生污染的同時，產(chǎn)生較為嚴重的基質(zhì)效應(yīng)，對該研究試驗結(jié)果產(chǎn)生較大影響。在實際研究中發(fā)現(xiàn)使用純水提取的樣品提取液，顏色較深，呈渾濁狀態(tài)，衍生化上機后，離子化效率過低，定量限難以滿足日常檢驗要求。該研究對純水提取的提取液，使用5 mL二氯甲烷通過液液萃取的方式進行除脂，有效地降低了雜質(zhì)過多而產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)。

固相萃取柱的選擇和優(yōu)化。香辛料中草甘膦測定方法SN/T 1923和GB/T 23750均使用了CAX陽離子固相萃取柱進行凈化，日常監(jiān)測試驗發(fā)現(xiàn)，目標物洗脫時由于洗脫液中主要為水相從而導致濃縮時間較長、步驟復雜煩瑣。在該研究，根據(jù)草甘膦及氨甲基膦酸強極性的特點，采用了Waters Oasis HLB固相萃取柱對花椒的水提取溶液進行凈化。

取濃度50和200 μg/L的草甘膦及其代謝物標準混合溶液，按樣品前處理方法使用Waters Oasis HLB固相萃取柱進行凈化，草甘膦及其代謝物的回收率在93.1%～98.2%，結(jié)果表明采用Waters Oasis HLB固相萃取柱進行通過式凈化，固相萃取柱未吸附待測物質(zhì)，可以用于草甘膦及其代謝物檢測的凈化。

衍生條件的選擇。SN/T 1923中規(guī)定使用氯甲酸-9-芴基甲酯丙酮溶液衍生需要在室溫下放置過夜，使試驗時間過長，在該研究中將衍生過程放置于在25 ℃恒溫振蕩器中，取濃度為100 mg/L的草甘膦及氨甲基膦酸標準儲備液100 μL，用水定容至10 mL的1 mg/L標準中間液，添加過量衍生試劑條件下，50 r/min進行恒溫振蕩衍生2～8 h，每隔1 h 上機檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)衍生4 h后，測得值與衍生過夜測得值相比無明顯變化，說明在衍生4 h后，衍生基本完全。此次研究確定草甘膦及其代謝物衍生時間為4 h。

方法的檢出限、定量限和線性范圍。采用混合標準中間液配制成5～500 μg/L的系列標準工作液繪制標準工作曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明, 草甘膦及其代謝物衍生物在5～500 μg/L線性關(guān)系良好(>0.99)。

在2 g花椒空白基質(zhì)樣品中加入10 μL混合標準工作液(1 000 μg/L)，理論加標濃度為5.0 μg/kg，按照已建立方法檢測，信噪比>3為檢出限，結(jié)果表明加標濃度為5.0 μg/kg時，草甘膦和氨甲基膦酸的信噪比均大于100，滿足檢出限信噪比>3的要求，該方法的檢出限低于SN/T 1932規(guī)定的標準(50.0 μg/kg)要求，可滿足日常監(jiān)督檢測的需求。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸的線性方程、決定系數(shù)、檢出限Table 2 Linear equations, determination coefficients and detection limits of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid

方法的回收率和精密度。分別選取了5、50和200 μg/kg 3個濃度梯度水平對空白樣品進行加標試驗，每個濃度水平測定6次，計算加標回收率和RSD值，檢驗結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，草甘膦及氨甲基膦酸的回收率分別為87.4%～96.4%、88.7%～97.1%，RSD分別為3.3%～4.2%、2.5%～4.1%，表明該方法穩(wěn)定、可靠。

表3 草甘膦和氨甲基膦酸的加標回收率及其RSD(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSD of glyphosate and aminomethyl phosphonic acid

應(yīng)用該方法分析了市場上采購的10份花椒樣品，其中1批次樣品花椒樣品有氨甲基膦酸檢出，檢出值為20.7 μg/kg。實際樣品檢測結(jié)果與SN/T 1923 測得結(jié)果相比沒有明顯差異，說明該方法能夠替代SN/T 1923用于草甘膦及其代謝物的日常檢測。

3 小結(jié)

該研究建立了通過式固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定花椒中草甘膦及代謝物殘留的檢測方法，方法對提取液采用通過式固相萃取的凈化方式，其凈化方案與國標及其他文獻中吸附-洗脫模式相比較，具有操作簡便、步驟簡單的特點。研究結(jié)果表明，與目前的國家相關(guān)標準相比，該方法檢出限更低，定量結(jié)果更為準確，分析總耗時更短，為花椒及其他香辛料中草甘膦和氨甲基膦酸殘留檢測提供更加準確可靠的定性篩查和定量分析方法，也為香辛料的食品安全監(jiān)管及質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。