硒化氨基多糖對黑鯛脾臟代謝物的影響

周秀錦，江曉瓊，邵宏宏，張 靜，冷向陽，楊會成 (.舟山海關(guān)綜合技術(shù)服務中心，浙江舟山 60；.舟山市科學技術(shù)局，浙江舟山 60；.上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司，上海 005；.浙江海洋開發(fā)研究院，浙江舟山 60)

黑鯛()因具有廣溫、廣鹽性、抗逆性強、生長迅速、肉質(zhì)好等優(yōu)點而成為我國東南沿海地區(qū)及太平洋西岸海水養(yǎng)殖的經(jīng)濟魚類。隨著海洋經(jīng)濟的不斷發(fā)展，黑鯛養(yǎng)殖集約化程度越來越高，海水中病原菌種類越來越多，黑鯛的發(fā)病率也越來越高。具有噬鹽性的副溶血弧菌()廣泛附著在海產(chǎn)品表面，是魚類弧菌病中危害最大的病原菌之一，是海水養(yǎng)殖黑鯛的主要危害因子。目前已有利用添加免疫增強劑的飼料飼喂海水魚類來防治疾病的文獻報道。硒是海魚機體必需的微量元素之一，它參與體內(nèi)一些決定性的新陳代謝。通過化學修飾方法將多糖與無機硒結(jié)合，獲得硒化氨基多糖。硒化氨基多糖的生物活性普遍高于硒和多糖，更易于吸收和利用。目前已有關(guān)于硒化氨基多糖作為增強適應性免疫性能潛力的含硒膳食補充劑的報道。目前關(guān)于外源硒可以提高黑鯛幼魚的生長性能和血清免疫活性的相關(guān)文獻，但關(guān)于硒化氨基多糖對黑鯛免疫調(diào)節(jié)機制的研究報道較少。

代謝組學是以組群指標分析為基礎(chǔ)、以高通量檢測和數(shù)據(jù)處理為手段、以信息建模與系統(tǒng)整合為目標的系統(tǒng)生物學，可以直接反映機體內(nèi)生物化學過程和狀態(tài)的變化，在系統(tǒng)研究生物內(nèi)源性小分子代謝物的整體和動態(tài)變化規(guī)律上具有獨特優(yōu)勢。目前代謝組學分析技術(shù)應用比較廣泛的主要有核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)技術(shù)和高分辨質(zhì)譜(high-resolution mass spectrometers,HRMS)技術(shù)2種。NMR技術(shù)因具有不損失檢測樣品且重復性良好等特點而被廣泛應用于代謝組學中，檢測靈敏度相對較低、不能完全反映代謝組學中的變化是該技術(shù)的主要缺點。HRMS技術(shù)與色譜聯(lián)用可獲得目標化合物的相對分子量及結(jié)構(gòu)信息，已成為代謝組學研究的主要技術(shù)手段。筆者采用高通量、高靈敏度、高分辨率的UPLC-QTOF-MS技術(shù)，結(jié)合非靶向代謝組學方法，研究硒化氨基多糖調(diào)節(jié)攻毒后黑鯛免疫力的潛在機制和靶標途徑，旨在為黑鯛免疫增強劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

低聚氨基多糖 (low molecular aminopolysaccharide,LA)分子量約50 ku；自制硒化低聚氨基多糖，其中硒有效含量為27.3 mg/g。黑鯛幼魚由浙江省海洋水產(chǎn)研究所實驗場提供，分組前停飼1 d，將初始體重(13.00±0.20)g的健康黑鯛幼魚隨機分成2組，每組3個重復，每個重復25尾，放入容積310 L(水體積260 L)的玻璃纖維缸內(nèi)微流水式飼養(yǎng)。試驗組飼喂添加0.6 mg Se/kg硒化氨基多糖的飼料，對照組飼喂未添加硒化氨基多糖的飼料，試驗期為8 w，飼喂試驗結(jié)束后停飼，黑鯛腹腔注射0.2 mL副溶血弧菌活菌液(副溶血弧菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上28 ℃下過夜培養(yǎng)，然后用滅菌生理鹽水洗脫，稀釋到試驗所需菌液濃度5.5×10CFU/mL時攻毒，觀察黑鯛的健康狀況并統(tǒng)計死亡率。對照組黑鯛脾臟分別在饑餓48和96 h時，使用MS-222(間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽60 mg/L，色譜純，美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品)麻醉后摘取；試驗組在攻毒試驗48和96 h時摘取黑鯛脾臟組織，每組10個平行樣，稱重后液氮快速冷凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

參考該課題組前期研究所用代謝組學分析方法進行黑鯛脾臟樣品前處理、液相色譜分離、黑鯛脾臟樣品中的內(nèi)源性代謝物檢測。利用XCMS結(jié)合上海愛博才思分析儀器貿(mào)易有限公司(SCIEX)獨有的內(nèi)源性代謝物二級譜庫(Metabolite HR MSlibrary，該譜庫包含代謝物的分子式、分子量、CAS碼、結(jié)構(gòu)式、一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜等信息)對質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)進行全面的非靶向代謝組學分析。采用XCMS軟件進行內(nèi)源性代謝物的主成分分析(principal component analysis,PCA)，使用MetaboAnalyst 4.0 網(wǎng)站軟件在線進行代謝通路分析。

2 結(jié)果與分析

黑鯛在攻毒48和96 h時均未發(fā)生死亡現(xiàn)象，個別魚體在攻毒72 h時表現(xiàn)出攝食能力降低、游動相對緩慢，其他臨床癥狀均不明顯。在快速分析試驗中，采用UPLC分析系統(tǒng)可以獲得較高的重現(xiàn)性和分離效果。該試驗中醋酸銨和醋酸組合的流動相為大分子代謝物和小分子代謝物提供了最佳的色譜條件。采用2種不同性質(zhì)的色譜柱對脾臟樣品進行分離：極性小的小分子代謝物在T色譜柱上呈現(xiàn)較好的分離，極性大的小分子代謝物則在HILLIC色譜柱上分離效果最好；在正、負離子模式下對對照組、試驗組攻毒48和96 h時的脾臟樣本進行QTOF-MS/MS分析和數(shù)據(jù)采集。圖1為各組樣品典型的總離子流色譜圖(total ion chromatograms,TIC)。由圖1可知，對照組攻毒48和96 h時黑鯛脾臟的指紋圖譜存在一定的差異，表明試驗組黑鯛脾臟的內(nèi)源性代謝物主要組分有明顯變化。

注：A.HILLIC、負離子模式；B.HILLIC、正離子模式；C.T3、負離子模式；D.T3、正離子模式；a.對照組；b.攻毒48 h；c.攻毒96 h Note：A.HILLLIC，ESI-;B.HILIC，ESI+;C.T3，ESI-;D.T3，ESI+；a.Control group;b.Virus challenge after 48 h；b.Virus challenge after 96 h圖1 不同采集模式下各組樣品典型色譜圖樣品TIC圖譜Fig.1 Typical TIC patterns of each group of samples under different acquisition modes

為了考察飼喂硒化氨基多糖后副溶血弧菌活菌液攻毒后黑鯛脾臟代謝物的變化，使用XCMS軟件分析在正、負離子模式下采集的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采取主成分分析(PCA)方法自動進行PCA輪廓分析。黑鯛脾臟代謝PCA輪廓分析結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，試驗組攻毒48和96 h后，與對照組相比，在正、負離子模式下經(jīng)HILLIC色譜柱和T色譜柱分離的脾臟代謝物主成分均有明顯的分離趨勢，無交叉和重疊現(xiàn)象，表明試驗組在副溶血弧菌攻毒后黑鯛脾臟代謝產(chǎn)物指紋圖譜均發(fā)生了顯著變化。

潛在生物標志物的鑒定方法為試樣經(jīng)色譜柱分離后被離子化為不同質(zhì)量的離子，進入質(zhì)譜質(zhì)量分析器，形成賴以定性的一級和二級質(zhì)譜信息，通過一級質(zhì)譜信息可以確定相對分子量，利用二級質(zhì)譜信息可以獲得其結(jié)構(gòu)碎片信息。將經(jīng)T色譜柱和HILLIC色譜柱分離，在正、負離子模式下的高分辨質(zhì)譜檢測結(jié)果，經(jīng)檢索Metabolite HR MSlibrary數(shù)據(jù)庫(SCIEX)發(fā)現(xiàn)，飼喂硒化氨基多糖的試驗組攻毒48 h時共準確鑒定出31個有顯著差異的潛在生物標志物，與對照組相比除甜菜堿水平升高外，30種潛在生物標志物水平呈現(xiàn)明顯的降低趨勢；攻毒96 h時共準確鑒定出36個有顯著差異的潛在生物標志物，與攻毒48 h時相比，除了L-精氨酸和鳥氨酸水平升高外，其他34種潛在生物標志物水平均呈明顯下降趨勢；在整個試驗過程中，4-胍基丁酸和α-亞麻酸呈現(xiàn)先上升(攻毒48 h)后下降(攻毒96 h)的趨勢。這表明硒化氨基多糖對黑鯛脾臟具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。具體結(jié)果見表1。

注：A.T3、負離子模式；B.T3、正離子模式；C.HILLIC、負離子模式；D.HILLIC、正離子模式；紅色表示攻毒48 h；藍色表示攻毒96 h；綠色表示對照組 Note：A.T3，ESI-;B.T3，ESI+;C.HILLIC，ESI-;D.HILLIC，ESI+;The red represent virus challenge after 48 h；The blue represent virus challenge after 96 h;The green represent the control group圖2 不同采集模式下脾臟代謝分析的PCA輪廓分析Fig.2 PCA profile analysis of spleen metabolic analysis under different acquisition models

表1 非靶向代謝組學分析的差異代謝物

接下表 續(xù)表1

根據(jù)Metabolite HR MSlibrary數(shù)據(jù)庫檢索得出的潛在生物標志物，錄入MetaboAnalyst 4.0網(wǎng)站，以魚為分析模型，進行相關(guān)代謝通路分析。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌攻毒48 h時，黑鯛脾臟代謝物中有顯著差異的31種潛在生物標志物主要指向8條代謝通路(<0.05)；攻毒96 h時，黑鯛脾臟代謝物中有顯著差異的36種潛在生物標志物主要指向10條代謝通路(<0.05)，主要涵蓋纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，氨酰轉(zhuǎn)移核糖核酸合成、嘌呤代謝等，具體見表2～3。

脾臟是魚類的造血組織和重要的外周免疫器官，在其發(fā)揮免疫作用的過程中其內(nèi)源性代謝物也發(fā)生相應變化。在整個試驗過程中，黑鯛脾臟組織在副溶血弧菌攻毒48和96 h時可鑒定出的代謝物種類和代謝模式明顯不同，揭示了其內(nèi)源性代謝物的種數(shù)呈現(xiàn)明顯的動態(tài)變化。內(nèi)源性代謝物中氨基酸是構(gòu)成機體免疫系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)物質(zhì)，與免疫系統(tǒng)的組織發(fā)生、器官發(fā)育以及功能發(fā)揮起著重要的作用。該研究試驗組黑鯛脾臟中脯氨酸、谷氨酸、賴氨酸等多種氨基酸的含量明顯低于對照組，表明硒化氨基多糖促進了黑鯛機體內(nèi)的蛋白質(zhì)和氨基酸代謝；代謝通路分析結(jié)果證實14種氨基酸參與了機體免疫，其中谷氨酸和谷氨酰胺在攻毒48 h時參與氨基?；D(zhuǎn)移核糖核酸生物合成、嘧啶代謝和嘌呤代謝3條主要代謝通路，在攻毒96 h時參與氨基?；D(zhuǎn)移核糖核酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝和組氨酸代謝等5條主要代謝通路。機體內(nèi)谷氨酸可能是對細胞免疫和體液免疫均有一定抑制作用的潛在抑制劑。谷氨酸的前體是谷氨酰胺，谷氨酰胺通過減少HO的積累、保護DNA免受損害而發(fā)揮著重要的抗氧化作用，同時促進了巨噬細胞和淋巴細胞的有絲分裂和分化增殖，增加了機體炎癥因子的產(chǎn)生，增強了免疫功能，攻毒后谷氨酸和谷氨酰胺水平呈現(xiàn)下降趨勢，提示可能是因為硒化氨基多糖參與了調(diào)節(jié)脾臟免疫反應；纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸屬于機體必需氨基酸中的支鏈氨基酸(BCAAs)，其含量占動物肌肉蛋白質(zhì)中必需氨基酸含量的35%，具有蛋白質(zhì)合成、能量產(chǎn)生、神經(jīng)傳遞和免疫功能。該研究中試驗組脾臟樣品中的BCAAs水平在攻毒后均呈現(xiàn)下降的趨勢，表明BCAAs通過線粒體的支鏈氨基轉(zhuǎn)移酶被分解代謝為乙酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，然后進入三羧酸循環(huán)[其中亮氨酸產(chǎn)生乙酰輔酶A(CoA)及乙酰乙酰CoA、纈氨酸產(chǎn)生琥珀酸單酰CoA、異亮氨酸產(chǎn)生乙酰CoA及琥珀酸單酰CoA]，參與機體能量代謝來促進乳酸-葡萄糖的循環(huán)和通過促進糖異生保持體內(nèi)能量平衡，減少乳酸的累積，抑制腦內(nèi)5-羥色胺的合成，起到緩解肌肉酸痛和延緩疲勞發(fā)生發(fā)展的效果。該研究黑鯛脾臟內(nèi)多種氨基酸水平的變化現(xiàn)象表明了硒化氨基多糖對黑鯛脾臟的免疫增強調(diào)節(jié)功能與氨基酸代謝有密切關(guān)系。

甜菜堿具有活性甲基，作為一種直接有效的甲基供體，DNA、RNA、蛋白質(zhì)和許多其他重要的含甲基(CH)代謝化合物都需要甲基基團。對甲基群代謝和調(diào)控的研究表明，甲基供體、代謝與疾病之間存在著顯著的相關(guān)關(guān)系；同時，甜菜堿可以增強細胞的保水能力，可能是通過控制細胞體積、穩(wěn)定蛋白質(zhì)和維持細胞膜完整性，保護細胞內(nèi)酶免受滲透或溫度引起的滅活。已有文獻報道甜菜堿能降低炎癥因子IL-6和TNF-α的表達，具有降低炎癥相關(guān)疾病發(fā)生率的潛力。它們在免疫反應中的重要性可能是由于其在免疫識別和抗體產(chǎn)生過程中發(fā)生DNA甲基化，也能改善魚類紅細胞生成、血清蛋白質(zhì)和脂肪水平、抗氧化狀態(tài)、免疫功能、神經(jīng)傳遞。脾臟內(nèi)代謝物甜菜堿水平在攻毒48 h時呈相對上調(diào)趨勢，96 h時呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，提示硒化氨基多糖可能干預了脾臟甲基循環(huán)的生化通路，從而增強了黑鯛脾臟的抗病力。

表2 MetPA分析攻毒48 h后的代謝通路分析結(jié)果 Table 2 The analysis results of metabolic pathways after virus challenge 48 h by MetPA

表3 MetPA分析攻毒96 h后的代謝通路分析結(jié)果 Table 3 The analysis results of metabolic pathways after virus challenge 96 h by MetPA

精氨酸和脯氨酸可轉(zhuǎn)化為鳥氨酸，鳥氨酸攻毒96 h的水平相對上調(diào)，其原因可能是副溶血弧菌攻毒后黑鯛機體內(nèi)蛋白質(zhì)分解加速，鳥氨酸含量上升，通過鳥氨酸循環(huán)的轉(zhuǎn)氨基作用，將毒性較高的-NH轉(zhuǎn)化為低毒的尿素排出體外，同時鳥氨酸參與了谷氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸的生物合成，從而增強黑鯛脾臟的免疫力。在核苷酸代謝過程中，嘧啶、嘌呤等堿基成分對單胺氧化酶的活性具有抑制作用，能夠提高活性氧自由基的清除能力，增強小鼠的抗氧化作用。該研究中試驗組黑鯛脾臟中嘧啶、嘌呤在攻毒后均呈現(xiàn)下降趨勢，說明黑鯛體內(nèi)的氧化應激狀態(tài)減弱。

3 結(jié)論

該研究采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)在副溶血弧菌活菌液攻毒后對飼喂硒化氨基多糖的黑鯛脾臟進行了代謝組學研究。分別采用T和HILLIC 2種色譜柱分離結(jié)合XCMS方法進行分析，攻毒96 h時篩選出36個有顯著差異的潛在生物標志物，經(jīng)MetaboAnalyst 4.0網(wǎng)站軟件分析，飼喂硒化氨基多糖對黑鯛脾臟的10個代謝通路產(chǎn)生了影響。該研究結(jié)果表明硒化氨基多糖發(fā)揮免疫增強作用與氨基酸代謝存在密切的關(guān)系，為今后深入探討硒化氨基多糖的免疫增強機制和合理開發(fā)免疫增強劑奠定了實驗基礎(chǔ)。