馮金華,于華華,李麗娜,姜 帥,鄭文靜 (.河北農(nóng)業(yè)大學海洋學院,河北秦皇島 06600;.中國科學院海洋研究所,山東青島 6607;.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院,上海 006;.青島科技大學環(huán)境與安全工程學院,山東青島 660)
水母是刺胞動物在浮游生物中的代表,廣泛分布于溫帶、亞熱帶及熱帶海域。刺細胞是刺胞動物特有的細胞器,是刺胞動物賴以捕食和御敵的武器,當刺細胞受到物理、化學、生物等因素的刺激時可釋放出毒液。海洋中的水母有10 000余種,其中100余種對人類有毒性,當人類與其接觸時刺細胞中的毒液成分可經(jīng)管狀的刺絲注入皮內(nèi),引起蜇傷。
不同水母所含刺細胞的種類各異,其釋放的毒液成分及其活性特征各不相同。不同水母造成的蜇傷癥狀復雜多樣。目前已報道的水母蜇傷癥狀最常見的是局部炎癥反應,嚴重的還包括休克、臟器衰竭,甚至死亡。隨著全球水母暴發(fā),水母蜇傷已經(jīng)成為危害嚴重的海洋生物傷害之一。目前,國內(nèi)外對水母蜇傷的研究著重于臨床癥狀觀察以及治療、護理等方面。由于水母毒素中致病性物質(zhì)及其致病機理還不明確,水母蜇傷后的急救治療缺乏理論依據(jù)。
白色霞水母是典型的有害水母種類,既無經(jīng)濟價值,又對接觸者有較大的蜇傷毒性。自20世紀末起,東海北部至黃海、渤海水域連續(xù)發(fā)生白色霞水母暴發(fā)現(xiàn)象,且有愈演愈烈之勢。被白色霞水母蜇傷后,往往引起嚴重的皮膚損傷,受傷皮膚出現(xiàn)紅斑、瘀斑、出血等蕁麻疹斑塊;同時,還可能伴有呼吸道癥狀和全身癥狀,比如劇烈咳嗽、呼吸困難,甚至喪失意識。研究表明,白色霞水母刺細胞內(nèi)毒素具有溶血活性、神經(jīng)毒性、金屬蛋白酶和磷脂酶A活性等。目前,雖然對白色霞水母毒素的毒性成分越來越了解,但是白色霞水母毒素對哺乳動物的毒理特性還未見報道。筆者研究了白色霞水母刺細胞毒素對小鼠的毒性作用,檢測刺細胞毒素對小鼠的致死毒性、對皮膚和內(nèi)臟組織的病理損害,探索白色霞水母毒素蟄傷的中毒機理,旨在為白色霞水母蜇傷治療和蜇傷特效藥物的研制提供理論依據(jù)。
試驗材料。白色霞水母(Kishinouye)于2010年8月采自青島第一海水浴場附近,由中國科學院海洋研究所高尚武教授進行品種鑒定。觸手從水母傘蓋處人工切除后,立即于-80 ℃下冷凍保存,備用。
主要儀器。GL-20B-Ⅱ高速冷凍離心機,由上海安亭科學儀器廠生產(chǎn);3110BXEUR美國Mini Beadbeater珠磨機,由上海上碧實驗儀器有限公司生產(chǎn);PMS-100解剖鏡,由浙江托普儀器有限公司生產(chǎn);XSZ-G光學顯微鏡,由重慶光學儀器廠生產(chǎn);722S紫外可見分光光度計、FD-5N真空冷凍干燥儀,由上海精密科學儀器有限公司生產(chǎn);H-7000透射式電鏡,由日立高新技術公司生產(chǎn);HH-2恒溫水浴鍋,由常州國華電器有限公司生產(chǎn);902-ULTS超低溫冰箱,由美國Thermo公司生產(chǎn)。
主要試劑。硫酸鈉(AR)、三羥甲基氨基甲烷(AR)、磷酸氫二鈉(AR)、磷酸二氫鈉(AR),由國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn);牛血清白蛋白BSA(AR)由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn);戊二醛(AR)由天津歐博凱化工有限公司生產(chǎn);鹽酸(AR)由上海環(huán)發(fā)化工有限公司生產(chǎn)。
實驗動物。SPF級KM(昆明)小鼠,平均體重(20±2)g,購于青島市藥品檢驗所。
刺細胞毒素的制備。
刺細胞的制備。冷凍的白色霞水母觸手用無菌海水4 ℃下浸泡(體積比1∶4),每24 h換1次新鮮海水(保留沉淀,在此期間可用玻璃棒輕輕攪拌幾次)。4 d后,用54 μm 孔徑的濾篩過濾,去除未溶解的觸手組織和較大的組織碎片,濾液離心并收集沉淀。沉淀用0.9% NaCl溶液懸浮,13 000 r/min 離心15 min后,去掉上清液;通過顯微鏡觀察,用小勺輕輕將沉淀上層破碎的刺細胞和小的組織碎片去除,底層的沉淀重新用0.9% NaCl溶液懸浮,13 000 r/min離心;顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)沉淀中刺細胞含量在90%以上時,將沉淀收集、冷凍干燥后即得水母刺細胞樣品,-80 ℃下保存,備用。
刺細胞毒素的提取。使用Mini Beadbeater珠磨機破碎刺細胞;破碎管中加入1/2體積直徑0.5 mm的玻璃珠,再加入冷凍干燥的刺細胞和Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 7.8),4 600 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩破碎,每次1 min,共4~5次,每破碎1次冰水預冷1 min。將破碎液13 000 r/min下冷凍離心15 min,所得上清液即為白色霞水母刺細胞毒素(CNV),-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>
蛋白質(zhì)含量的測定。以牛血清白蛋白(BSA)作為標準,采用Bradford法測定CNV中總蛋白的含量。
CNV對小鼠的致死毒性檢測。用昆明種清潔級小鼠,設置5個試驗組(A、B、C、D、E),每組6只,雌雄各半,皮內(nèi)注射不同濃度的CNV溶液200 μL;對照組6只小鼠,注射200 μL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 7.8)。觀察并記錄各組小鼠的表現(xiàn),記錄死亡時間并統(tǒng)計24 h后的死亡數(shù),計算LD。
CNV致皮膚壞死作用觀察。清潔級昆明小鼠10只,對照組和試驗組各5只。試驗前1 d,用8%硫化鈉將小鼠背部脫毛。在備毛處,采用皮內(nèi)注射的方法,試驗組注射1個LD劑量的毒素樣品200 μL,對照組注射相同體積的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 7.8),觀察注射毒素1 h、1 d、2 d 后小鼠皮膚的變化。
CNV致小鼠組織病理變化的透射電鏡觀察。試驗前1 d,將小鼠背部的被毛先用剪刀剪去,盡量剪短,但不要剪破皮膚。然后,用溫水將該部位潤濕,再用紗布包扎棉球的小棒蘸脫毛劑(8%NaS溶液),在需脫毛部位涂1層,2~3 min后用溫水洗去該部位脫下的毛,自然晾干,備用。
將小鼠完全隨機分為試驗組和對照組2組,每組5只。試驗組在小鼠背部備皮處皮內(nèi)注射1個LD劑量的毒素樣品200 μL;對照組注射相同體積的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 7.8)。
配制含5%戊二醛的PBS緩沖液(150 mmol/L,pH 7.3~7.4)及生理鹽水,置于4 ℃下預冷,作為固定液。
注射毒素樣品4 h后,立即將小鼠解剖,取對照組和試驗組注射部位皮膚、心、肺、肝、腎。取材時,先在解剖盤上滴2滴固定液,在5%固定液中迅速用雙面刀片切取小塊樣品放入固定液中,1 h內(nèi)迅速將小塊樣品切成體積0.5 mm的小塊,放入盛有固定液的樣品瓶(置于4 ℃冰箱中預冷)。由于肺組織內(nèi)部有氣體無法徹底排放,導致肺組織懸浮于固定液表面,固定液不能及時滲透進組織內(nèi)部,從而導致大部分組織固定不良,所以取紗布條壓于肺組織小塊上,使組織沉底,全部浸泡在固定液中保存。應用解剖鏡,將心臟組織小塊沿肺纖維方向修成長條狀。為了防止采集過程中細胞快速死亡自溶,環(huán)境溫度應保持在0~10 ℃。將上述固定好的樣品用1%OsO作后固定,經(jīng)乙醇梯度脫水、國產(chǎn)618環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片機切片,用醋酸雙氧鈉和檸檬酸鉛染色,最后使用日立H-7000型透射電鏡進行觀察。
小鼠皮內(nèi)注射毒素后開始觀察,發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)靜伏少動、豎毛、蜷縮、后肢伸展、松弛、走路蹣跚、感覺稍遲鈍、行動緩慢,睜眼困難,食欲減退,嚴重者出現(xiàn)全身抽搐、呼吸急促、死亡等中毒癥狀。
如表1所示,CNV致小鼠死亡率呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當毒素劑量為43.65 mg/kg時可致小鼠快速死亡,小鼠出現(xiàn)全身抽搐、呼吸急促,1~4 h內(nèi)死亡4只,24 h后死亡6只;當毒素劑量為38.80 mg/kg時,小鼠4 h內(nèi)死亡2只,另有3只出現(xiàn)靜伏少動、不食、呼吸急促、睜眼困難等癥狀,24 h后死亡5只。隨著毒素劑量的降低,注射毒素后小鼠越活潑,癥狀越不明顯,存活時間越長。
經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn),全部動物均表現(xiàn)為呼吸先完全停止,待肉眼觀察到小鼠呼吸停止后再打開胸腔,暴露出心臟,心臟仍維持跳動2~10 min。
參照熊浩明等的方法,按表1數(shù)據(jù)計算得出,CNV致小鼠死亡的LD為33.64 mg/kg。
表1 CNV對小鼠的致死作用Table 1 The lethal effect of CNV on mice
如圖1所示,試驗組小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的毒素樣品200 μL,1 h后注射部位開始隱現(xiàn)紅色區(qū)域,隨著時間的推移,皮膚損傷癥狀逐漸明顯;1 d后,注射部位皮膚中央凹陷,出現(xiàn)暗紅色斑塊,周圍出現(xiàn)小鼠抓傷的痕跡;隨著時間的延長,斑塊繼續(xù)向外沿擴展,顏色變?yōu)樽虾稚?,表面皮膚變硬;2 d后,注射部位形成焦痂,呈壞死癥狀。隨著時間的延長,深褐色焦痂繼續(xù)增厚甚至潰爛。對照組小鼠皮膚沒有觀察到明顯病理變化。
皮膚超微結(jié)構變化。圖2為注射33.64 mg/kg的CNV 4 h后對照組(Control)和試驗組(A)小鼠注射部位皮膚的超微結(jié)構圖。從圖2可以看出,對照組細胞器超微結(jié)構正常,細胞核核膜完整,可見核仁。試驗組小鼠皮膚腺體細胞的超微結(jié)構出現(xiàn)多種明顯結(jié)構變化,腺體顆粒囊泡化(黑色箭頭所示為白色泡狀結(jié)構);細胞呈溶解狀態(tài);電子密度明顯降低;細胞核皺縮,細胞核的核膜溶解(N所示);染色質(zhì)濃縮,邊緣化凝集成板塊樣,分布于核膜處。從超微結(jié)構圖可以看出,細胞變性,出現(xiàn)壞死特征。
注:Ⅰ.SPF級小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的CNV 1 h后;Ⅱ.SPF級小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的CNV 1 d后;Ⅲ.SPF級小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的CNV 2 d后 Note:Ⅰ.After SPF mice were injected 33.64 mg/kg CNV by intradermal injection 1h;Ⅱ.After SPF mice were injected 33.64 mg/kg CNV by intradermal injection 1 d;Ⅲ.After SPF mice were injected 33.64 mg/kg CNV by intradermal injection 2 d圖1 CNV致小鼠皮膚壞死作用Fig.1 The skin necrosis of mice induced by CNV
圖2 CNV致小鼠皮膚超微結(jié)構變化Fig.2 Ultrastructural changes of mice skin induced by CNV
肝臟細胞超微結(jié)構變化。如圖3所示,注射33.64 mg/kg 的CNV 4 h后,對照組(Control)小鼠肝臟組織細胞超微結(jié)構清晰、正常,肝細胞核呈圓形,胞質(zhì)中糖原顆粒豐富(黑色箭頭所示),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體豐富。試驗組(A)小鼠肝細胞細胞器最顯著的變化為肝糖原顆粒大量減少,甚至消失;其他變化包括核膜有部分溶解,核內(nèi)基質(zhì)略有減淡,染色質(zhì)向核膜聚集,線粒體有腫脹現(xiàn)象;但細胞核大小、形狀正常。此外,肝臟細胞超微結(jié)構無其他明顯變化。
圖3 CNV致小鼠肝臟細胞超微結(jié)構變化Fig.3 Ultrastructural changes of mice liver cells induced by CNV
腎臟細胞超微結(jié)構變化。從圖5可以看出,與對照組(Control)相比,受毒素的影響,試驗組小鼠腎臟細胞超微結(jié)構發(fā)生明顯的病理變化。主要表現(xiàn)如下:細胞核發(fā)生皺縮,染色質(zhì)凝集程度增加、呈邊緣化聚集,部分區(qū)域板塊樣聚集(A),核內(nèi)電子密度明顯降低(A)并出現(xiàn)核膜溶解(A);部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張水腫,呈現(xiàn)泡狀結(jié)構(黑色箭頭所指);大量線粒體腫脹、基質(zhì)減淡,嵴減少,有空泡化現(xiàn)象,外膜部分溶解,部分線粒體內(nèi)開始出現(xiàn)無定形電子致密物(A、A),并出現(xiàn)髓樣結(jié)構。這表明毒素使小鼠腎臟組織受到嚴重損傷,細胞有壞死跡象。
心臟細胞超微結(jié)構變化。如圖6所示,與對照組相比,試驗組小鼠的肌漿網(wǎng)和肌原纖維沒有明顯變化;細胞核出現(xiàn)微皺縮;線粒體完整,部分線粒體出現(xiàn)腫脹,但內(nèi)嵴有微溶解現(xiàn)象;細胞內(nèi)出現(xiàn)髓樣結(jié)構。整個心臟向功能衰弱的方向發(fā)展,但并未出現(xiàn)衰竭的跡象。
圖4 CNV致小鼠肺細胞超微結(jié)構變化Fig.4 Ultrastructural changes of mice lung cells induced by CNV
注:A1、A2為試驗組小鼠腎小管細胞的超微結(jié)構 Note:A1 and A2 were the ultra-structure of tubular cells in mice in the experimental group 圖5 CNV致小鼠腎臟細胞超微結(jié)構變化Fig.5 Ultrastructural changes of mice kidney cells induced by CNV
該研究結(jié)果表明CNV可引發(fā)小鼠明顯的中毒反應,甚至死亡。CNV皮內(nèi)注射對小鼠的LD為33.64 mg/kg,屬于高度危害毒性。王蓓蕾采用尾靜脈注射的方式進行檢測,發(fā)現(xiàn)獅鬃水母()的觸手提取液對小鼠的LD為5.484 mg/kg;Li等研究發(fā)現(xiàn)沙蜇()對小鼠靜脈注射的LD為2.92 μg/g。通過不同水母毒素的LD大小可以看出毒性的強弱。由此可見,白色霞水母毒素相對于我國常見大型蜇人水母毒性較弱,可能這也是目前尚未見到關于白色霞水母致重癥蟄傷患者報道的原因。
注射1個LD劑量的CNV 4 h后,超微結(jié)構觀察發(fā)現(xiàn)小鼠注射部位皮膚細胞線粒體、基質(zhì)、細胞核、染色質(zhì)等都發(fā)生明顯壞死。1~2 d后,小鼠皮膚表現(xiàn)出壞死癥狀,注射部位顏色變深,隨著時間的延長,出現(xiàn)結(jié)痂和潰爛現(xiàn)象。據(jù)報道,水母蜇傷后的局部癥狀以紅斑、丘疹為主,嚴重蟄傷時可導致色素沉著、瘢痕形成、壞疽。這與該研究報道的CNV具有皮膚壞死活性相吻合。
小鼠皮內(nèi)注射33.64 mg/kg的CNV 4 h后,對皮膚及臟器的超微結(jié)構觀察發(fā)現(xiàn)小鼠的皮膚和臟器表現(xiàn)出不同程度的損傷。其中,比較明顯的損傷出現(xiàn)在皮膚、肺臟和腎臟,而肝臟和心臟的損傷相對較輕。注射獅鬃水母的觸手提取液2.4 mg/kg 1 h后致大鼠模型引起嚴重的心肺損傷,但其對肝、腎的損傷較輕。沙蟄毒素可引起肺水腫和惡性胸腔積液,病理切片分析顯示腎臟和肝臟受到嚴重損傷,但心臟、脾、胃未見明顯改變。由于不同水母中所含毒性成分的差異,其引起的中毒癥狀、作用部位及中毒機理等有所差別。
CNV致小鼠肺組織細胞病變嚴重,出現(xiàn)明顯水腫樣變化,肺水腫病變會直接引起呼吸困難。從CNV致小鼠肺組織病變可以看出,白色霞水母蟄傷嚴重者可能會出現(xiàn)嚴重的肺水腫。多篇文獻記載水母蟄傷致患者出現(xiàn)呼吸困難、咳大量泡沫樣痰等急性肺水腫表現(xiàn),最終導致的呼吸循環(huán)衰竭也被認為是致死的常見原因之一。肺水腫可能是多種水母蟄傷嚴重患者出現(xiàn)的共有癥狀。
腎功能衰竭可能是CNV引起小鼠死亡的又一重要原因。毒素除了引起小鼠肺臟細胞超微結(jié)構發(fā)生明顯病變外,也引起腎臟嚴重的病理變化,腎細胞超微結(jié)構出現(xiàn)壞死。腎細胞的嚴重病變可能導致腎功能衰竭。目前已有關于海月水母、海蜇蜇傷致急性腎功能衰竭的報道。
據(jù)報道,水母毒素有心臟毒性,可能是發(fā)狀霞水母蜇傷致死的主要原因。但是,CNV在致死劑量下對小鼠心臟細胞超微結(jié)構的影響不明顯,且解剖發(fā)現(xiàn)小鼠呼吸停止但心臟仍能維持跳動一段時間。這說明心臟毒性可能不是白色霞水母毒素致死的主要原因。
注:Control Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ為對照組小鼠心肌細胞的超微結(jié)構,A1、A2、A3為試驗組小鼠心肌的超微結(jié)構 Note: Control Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ were the ultra-structure of the myocardial cells in mice in the control group, A1, A2, A3 were the ultra-structure of the myocardial cells in mice in the experimental group 圖6 CNV致小鼠心臟細胞超微結(jié)構變化Fig.6 Ultrastructural changes of mice heart cells induced by CNV
該研究揭示了白色霞水母毒素的部分毒性特征,為白色霞水母蟄傷的救治提供了試驗依據(jù)。若要進一步了解其毒理特性,還需要明確毒素中每一種毒性成分及其功能。