基于微生物法甾體羥基化反應(yīng)

黃娟， 朱惠萱， 田懷香， 于海燕， 陳臣， 榮紹豐

上海應(yīng)用技術(shù)大學香料香精化妝品學部，上海 201418

甾體藥物誕生于20世紀40年代，是僅次于抗生素的第二大類化學藥。常見的甾體藥物包含雄烯二酮及其衍生產(chǎn)品系列、雄二烯二酮及其衍生產(chǎn)品系列、9-羥基雄烯二酮及其衍生產(chǎn)品系列。甾體藥物除了具有免疫抑制、抗炎、抗風濕、促孕、利尿、鎮(zhèn)靜、合成代謝和避孕劑等作用外，其還能治療癌癥、骨質(zhì)疏松癥、艾滋病毒感染等疾?。?］。甾體藥物或其中間體的制備可分為化學法和生物法。與化學法相比，生物轉(zhuǎn)化常在溫和條件下進行，具有區(qū)域和立體專一性、對映體專一性的特點［2］，是目前甾體藥物生產(chǎn)主要采用的方法。

甾體微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物的多個酶系或單一酶，對甾體母核的某一或多個特定部位進行反應(yīng)，從而產(chǎn)生一種或多種結(jié)構(gòu)類似且高價值化合物的過程。不同轉(zhuǎn)化位點涉及反應(yīng)如圖1所示，包括加氫、水解與羥化等反應(yīng)。

圖1 甾體化合物生物轉(zhuǎn)化位點Fig.1 Biotransformation sites of steroid compounds

羥基化反應(yīng)（hydroxylation）是甾體化合物功能化重要的反應(yīng)之一，該反應(yīng)是指在有機化合物各個基團上引入羥基。孕酮11-α羥基化是第一個被發(fā)現(xiàn)的羥基化反應(yīng)［3］。羥基化一方面能夠為化學合成提供中間體；另一方面，利用微生物進行羥基化反應(yīng)可以到達一般化學反應(yīng)達不到的部位，在不同位置或不同空間經(jīng)羥基化形成具有不同藥效的甾體藥物。此外，羥基化可以增加甾醇類化合物的極性，影響其細胞分泌、毒性及跨細胞膜的外排作用，增強化合物的生物活性。與極性較低的非羥基化甾體相比，羥基化甾體通常表現(xiàn)出更高的生物活性，如羥基化產(chǎn)物潑尼松龍的活性是母體化合物的3～5倍［4］。脫氫表雄甾酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）的7α-羥基衍生物表現(xiàn)出高免疫保護和免疫調(diào)節(jié)特性［5］。真核生物中，羥基化主要發(fā)揮對外源底物解毒的作用，如一些乙甾酮的羥基化衍生物表現(xiàn)出酪氨酸酶抑制作用［6］；一些新的羥基衍生物，如20-羥甲基孕甾-1，4-二烯-3-酮［（20S）-20-hydroxymethylpregna-1，4-dien-3-one］，與非羥基化底物不同，對HeLa癌細胞系表現(xiàn)出細胞毒性［7］。細菌中，羥基化則表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)改造過程。羥基化的甾體具有消炎等方面的活性，如Resttaino等［8］采用玫瑰產(chǎn)色鏈霉菌對氫化可的松進行了C-16位的α-羥基化，獲得生產(chǎn)抗炎藥物丙縮羥強龍的重要中間體16α-羥基氫化可的松。

甾體微生物轉(zhuǎn)化是甾體藥物生產(chǎn)的必然趨勢。目前國外上市的甾體藥物已有400多種，我國現(xiàn)有品種僅為其1/3，且多為中低檔產(chǎn)品，我國在甾體藥物方面的研究，與世界先進國家相比尚存在較大差距。甾體藥物新資源的開發(fā)是醫(yī)藥行業(yè)重點發(fā)展的方向之一?；诖?，本文從反應(yīng)原理、反應(yīng)類型、影響因素等方面，對甾體微生物羥基化反應(yīng)的最新研究進展做一簡要綜述，以期為未來開展相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 甾體羥基化反應(yīng)

1.1 反應(yīng)原理

一般來說，甾體羥基化反應(yīng)由底物、溶解于水中的分子氧、用于底物結(jié)合和氧化催化的P450酶、起電子轉(zhuǎn)移穿梭作用的氧化還原和提供還原等價物的輔因子醌氧化還原酶1［quinone oxidoreductase，NAD（P）H］共同作用完成，以坎利酮11α-羥基化反應(yīng)為例，其化學反應(yīng)如圖2所示。

圖2 坎利酮11α-羥基化反應(yīng)方程式Fig.2 Equation for 11α-hydroxylation of canrenone

根據(jù)同位素18O追蹤試驗的結(jié)果，羥基化反應(yīng)的原理為羥基直接取代甾體碳骨架上的氫，取代過程中未產(chǎn)生立體構(gòu)型的變化，也不是通過形成烯的中間體來完成的。羥基取代的立體構(gòu)型（α或β型）是由氫原子原來所占空間位置決定的［9］。

1.2 反應(yīng)類型

甾體化合物中常見的羥基化反應(yīng)有9-α、11-α、11-β、16-α、17-α、19-角甲基上的羥基化反應(yīng)等［9］。工業(yè)上重要的甾體微生物羥基化反應(yīng)類型及常利用的微生物和底物詳見表1。

表1 工業(yè)中重要的甾體微生物轉(zhuǎn)化羥基化反應(yīng)[10-14]Table 1 Important microbial hydroxylation of steroids in industry[10-14]

1.3 催化機制

甾體微生物羥基化的實質(zhì)是酶的催化反應(yīng)，研究表明，羥化酶均為細胞色素P450酶，與來源無關(guān)［15］。該類型的酶廣泛分布于生物體內(nèi)，在天然產(chǎn)物生物合成、外源物質(zhì)降解、甾體化合物生物合成和藥物代謝中起著至關(guān)重要的作用。目前已知的甾體羥化酶，主要來自于哺乳動物、巨大芽孢桿菌及霉菌，如黑根霉、少根根霉、黑曲霉、赭曲霉、彎孢霉和小克銀漢霉等［9］。真菌細胞色素P450羥化酶通常位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)膜上，主要由外源甾體化合物誘導，羥化酶負責解毒［16］。

P450作為末端氧化酶，利用分子氧且需要一個與還原型輔酶Ⅱ（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）依賴的脫氫酶相連接的電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)完成催化反應(yīng)?；谘趸€原伴侶蛋白不同，P450酶可分為5大類，在甾體微生物羥基化過程中所需要的P450酶屬于如圖3所示的種類。

圖3 P450酶的類別Fig.3 Categories of P450 enzymes

細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP450）屬于含血紅素酶，通常作為單加氧酶，催化分子氧的還原斷裂，將1個氧原子引入底物，而第2個氧原子被還原成水［17］。P450酶催化過程如圖4所示。具體催化過程可分為以下過程：①P450細胞酶中的血紅素FeⅢ六配位的靜息態(tài)（A）與底物的結(jié)合，失去1個配位的水分子，形成中間體B；②在NAD（P）H輔酶參與的電子傳遞反應(yīng)下，五配位的FeⅢ被還原為FeⅡ，形成中間體C；③與分子氧結(jié)合形成鐵超氧化物絡(luò)合物D［Cys-FeⅡ-O2］；④催化中心獲得第2個電子形成鐵過氧中間體E［Cys-FeⅢ-O-O］-；⑤被迅速質(zhì)子化形成鐵氫過氧化物 F［Cys-FeⅢ-O-OH］-；⑥第2個質(zhì)子化和O-O鍵的斷裂伴隨著失去1個水分子獲得高鐵氧中間體G［Cys-FeⅣ=O］＋；⑦這個具有極高反應(yīng)活性的中間體能夠奪取底物中臨近C-H鍵的氫原子，產(chǎn)生底物自由基和中間體H［Cys-FeⅣ-OH］；⑧羥基與底物自由基結(jié)合后形成中間體I；⑨羥化產(chǎn)物（R-OH）在水分子的參與下從活性位點釋放，P450酶重新恢復至起始靜息態(tài)［18-20］。

圖4 P450酶的催化機制Fig.4 Catalytic mechanism of P450 enzyme

2 甾體羥基化反應(yīng)影響因素

2.1 培養(yǎng)基組成

碳源是培養(yǎng)基的主要成分之一，可為細胞生長繁殖以及合成某些必需物質(zhì)提供能量和碳成分。常用的碳源有葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、玉米糖漿、甲殼素、甘油等。茅燕勇［21］研究表明，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的最佳碳源為葡萄糖。Jones等［22］將甘油、葡萄糖進行比較發(fā)現(xiàn)，20℃下，底物轉(zhuǎn)化率無明顯差異，但隨著溫度的升高，在30℃和37℃時，選用甘油為碳源的轉(zhuǎn)化率較葡萄糖高15%左右。

氮源的主要作用是構(gòu)成菌體的細胞物質(zhì)（如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等）和含氮目的產(chǎn)物，且酶的合成也需要氮源，一般涉及到酶的生物過程（如生物轉(zhuǎn)化）需要足量的、合適的氮源。氮源包括有機氮源和無機氮源兩種。微生物在有機氮源中常表現(xiàn)出生長旺盛、菌絲濃度增長迅速的特點。常用的碳源有蛋白胨、豆粉、牛肉膏、蠶蛹粉、硫酸銨、豆粕水解液、酵母膏、玉米粉、L-天冬氨酸等。甾體羥基化過程中，茅燕勇［21］認為玉米漿為最佳氮源，杜卓蓉等［23］認為硫酸銨為最佳氮源。

碳源和氮源不適當?shù)谋壤焕诩毎L和外源蛋白的表達和積累，過低的碳氮比會使菌體提早自溶，導致菌體喪失生理活性，過高的碳氮比會使菌體的代謝不平衡。李迎光［24］在 17α-羥基黃體酮的轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中碳氮比值為2時底物的轉(zhuǎn)化率更高。

無機鹽和微量元素在微生物生長繁殖和合成目的產(chǎn)物的過程中，可作為其生理活性物質(zhì)的組成或合成生理活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)物；無機鹽作為構(gòu)成微生物結(jié)構(gòu)的要素，還與能量傳遞、代謝調(diào)節(jié)等生理活動相關(guān)。常用的無機鹽包含七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）和磷酸二氫鉀（KH2PO4）、硫酸銨［（NH4）2SO4］等。

有研究表明，在羥基化的轉(zhuǎn)化體系中加入金屬離子可以有效地刺激底物轉(zhuǎn)化。可能是由于金屬離子激發(fā)了電子的傳遞，促進或抑制了分子酶間的相互作用，從而影響酶對底物的催化。一般在低濃度時對微生物生長和目的產(chǎn)物合成有促進作用，在高濃度時常表現(xiàn)出明顯的抑制作用［25］，如潑尼松龍的轉(zhuǎn)化過程中，添加Ca2+和Mg2+金屬離子的潑尼松龍轉(zhuǎn)化率顯著提高10%～15%；Co2+和Cu2+組的產(chǎn)量顯著降低，其中Cu2+的加入使轉(zhuǎn)化率降低到10%［26］。簡單節(jié)桿菌轉(zhuǎn)化膽固醇時，加入Co2+或Ni2+等金屬離子可以抑制膽固醇的母核降解，而使雄甾烯雙酮作為產(chǎn)物積累下來［27］。此外，培養(yǎng)基中還可加入營養(yǎng)因子，如維生素、甘氨酸、3，5-二硝基水楊酸等，調(diào)節(jié)菌體細胞對碳源、氮源等的代謝。培養(yǎng)基成分對甾體微生物轉(zhuǎn)化的影響程度不同，如Li等［28］研究表明，影響7α，15α-二羥基-DHEA產(chǎn)量的顯著因子順序為：硫酸亞鐵＞酵母抽提物＞葡萄糖＞玉米漿。

2.2 底物溶解性

2.2.1 有機溶劑 甾體化合物是脂溶性化合物，其在水中溶解度較低，而甾體羥基化反應(yīng)主要在水中進行。因此，很多學者在實驗過程中通常先將底物用少量的有機溶劑溶解，然后再將溶液加至培養(yǎng)基中。由于不同的有機溶劑對菌體生長的抑制程度不同，甚至一些毒性大的溶劑有時會直接導致菌體死亡，因此選用合適的有機溶劑溶解底物至關(guān)重要。最常用的有機溶劑包含甲醇、乙醇、丙酮、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等。趙沙沙［29］分別用適量的氯仿、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丙酮、二甲基亞砜溶解0.1 g的底物4-雄甾烯-3、17-二酮（4-androsten-3，17-dione，4-AD），探究不同有機溶劑對轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明，氯仿對底物的溶解性最好，對目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率最高（約84%），因此確定溶解底物4-AD的最佳助溶劑為氯仿。榮紹豐等［30-31］在采用赭曲霉催化17α-羥基黃體酮進行11α-羥基化反應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1%二甲基甲酰胺，轉(zhuǎn)化率可提升至93.3%，較未添加時高8.4%；在制備9α-羥基-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的過程中，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加由乙醇和聚乙二醇組成的復合促溶劑，轉(zhuǎn)化率可達84.3%。

2.2.2 離子液體 雖然有機溶劑可提高底物溶解性，但常用的有機溶劑具有高易燃性、揮發(fā)性和毒性。近年來，采用的離子液體因其獨特的性質(zhì)，如可忽略的蒸汽壓、偶極性質(zhì)、高溶解度、可調(diào)性、化學和熱穩(wěn)定性，被認為是有機溶劑的綠色替代品［32-33］。離子液體又稱熔融鹽，是指在100℃以下熔化的陽離子和陰離子的混合物。咪唑類離子液體仍是大多數(shù)研究的核心，但研究焦點也正在轉(zhuǎn)向其他陽離子基團（如季磷離子液體），但也有研究者曾對其高成本、毒性和生物降解性提出質(zhì)疑［34］。

Petkovic團隊［35］研究了氯化烷基三丁基磷對絲狀真菌構(gòu)巢曲霉分生孢子的毒性機理，其通過熒光顯微鏡來評估離子液體對質(zhì)膜完整性的影響，結(jié)果表明，帶有長烷基取代基的磷離子液體的毒性較高的原因可能是它們與分生孢子細胞邊界的強相互作用，雖然離子液體在一定程度可以提高細胞通透性，但也會對質(zhì)膜完整性造成損傷。

2.2.3 深共晶溶劑 深共晶溶劑（deep eutectic solvents，DESs）是銨鍵和氫鍵供體如氯化膽堿和尿素的共晶混合物，與離子液體有一些相似的溶劑性質(zhì)，且前者更容易制備、價格更低、生物相容性和生物降解性更高，被認為是一種更有前途的溶劑體系［36］。

Mao等［37］在研究DESs對單純節(jié)桿菌1，2-脫氫生成醋酸可的松和醋酸潑尼松的影響中，分別將氯化膽堿（choline chloride，ChCl）和尿素（urea，U）、乙二醇（ethylene glycol，Eg）及甘油（glycerol，Gly）形成的3種深共晶溶劑添加入轉(zhuǎn)化體系中，并對固定化簡單節(jié)桿菌細胞膜完整性、底物溶解度以及醋酸可的松生物轉(zhuǎn)化能力進行了考察。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的乙醇（0.032 8 g·L-1）相比，底物在4%ChCl：U（0.046 3 g·L-1）中的溶解度有明顯地提升，并且ChCl：U作為共溶劑對甾體生物脫氫最有效，當?shù)孜餄舛葹? g·L-1時，生物轉(zhuǎn)化率提高至93%以上，并將DESs和固定化細胞回收進行重復使用性評價，5次循環(huán)利用后，最終轉(zhuǎn)化率超過80%。

DESs也可以提高酶的催化作用，從而提高生物的轉(zhuǎn)化效率，如Cao等［38］利用DESs-DMSO體系作為反應(yīng)介質(zhì)，首次成功固定化黑曲霉脂肪酶，用于催化二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）的酶促?；磻?yīng)，最終得到DMY轉(zhuǎn)化率為91.6%，較之前有明顯提升。但目前關(guān)于離子液體和深共晶溶劑在甾體羥基化過程中的研究較少，有待進一步探索。

2.2.4 包埋材料 環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）是直鏈淀粉在由芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱。由于環(huán)糊精外緣親水而內(nèi)腔疏水，因而其能夠像酶一樣提供一個疏水的結(jié)合部位，作為主體包絡(luò)各種適當?shù)目腕w，如有機分子、無機離子及氣體分子等。環(huán)糊精能有效增加一些水溶性不良的藥物在水中的溶解度和溶解速度，改善化學穩(wěn)定性和生物利用度［39-40］。

不同類型的環(huán)糊精均顯示出增強甾體化合物溶解性的效應(yīng)。環(huán)糊精已被證明與分枝桿菌細胞表面相互作用，破壞最外層的脂質(zhì)細胞包膜的雙層，引起蛋白質(zhì)從細胞中滲透，并增加甾體化合物和營養(yǎng)物質(zhì)的細胞壁滲透性，從而有助于促進細胞生長和甾醇生物轉(zhuǎn)化［41-42］。β-CD在膽固醇、植物甾醇或富含植物甾醇等工業(yè)底物中促進3-酮甾類如雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和9α-羥基-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的形成［43-44］。

Shtratnikova等［45-46］分析了甲基化-β-環(huán)糊精（methlated-β-cyclodextrin，M-β-CD）存在的情況下，3-酮-4-烯甾體化合物積累和植物甾醇消耗的特定速率的時間過程曲線，結(jié)果表明，甲基化-β-CD可促進甾醇轉(zhuǎn)化酶活性的誘導。含甲基化-β-CD的甾體轉(zhuǎn)化過程中，增強的機制有多種，包括甾體化合物的溶解、細胞壁組成的改變、甾體化合物和可溶性營養(yǎng)物的細胞壁滲透性的增加、脂雙層的解體以及與細胞表面弱相關(guān)的甾體化合物轉(zhuǎn)化酶的釋放［47］。此外，反應(yīng)過程中即使存在甲基化-β-CD，也不涉及參與特定生物途徑的蛋白質(zhì)或具有特定分子功能或作用于特定細胞位置蛋白質(zhì)的表達變化，即其不會影響基因水平的甾體分解代謝，但甲基化-β-CD介導的必需甾體中間體細胞內(nèi)含量的改變是可能的。有研究表明，已知的甾體化合物分解代謝基因簇中不存在這些調(diào)節(jié)基因的同源物，即它們不參與甾體化合物分解代謝［46］。此外，類固醇生物轉(zhuǎn)化過程中，β-環(huán)糊精衍生物會影響細菌的生長速度和細胞形態(tài)，如轉(zhuǎn)化醋酸可的松過程中，隨機甲基化衍生物抑制單純節(jié)桿菌的細胞生長，而磺丁醚衍生物則促進其生長［48］。環(huán)糊精對放線菌甾體化合物生物轉(zhuǎn)化的影響存在劑量依賴性，即在高濃度下可能導致細胞活力的喪失以及結(jié)構(gòu)和生理變化［46］，如分枝桿菌。因此，在進行甾體微生物轉(zhuǎn)化時，應(yīng)考慮這些因素。

有機二氧化硅空心球（organic silica hollow spheres，OSHS）吸附性能較好，榮紹豐等［49］在以β-谷甾醇為底物制備-11α-羥基-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的過程中，向體系內(nèi)添加OSHS進行混合培養(yǎng)，首次證明添加OSHS有助于細胞的生物轉(zhuǎn)化。原因在于β-谷甾醇和OSHS兩層之間形成了吸附絡(luò)合物，這種吸附顯著增加了β-谷甾醇在水中的溶解性，從而改善了底物生物的轉(zhuǎn)化效率。

2.2.5 表面活性劑 羥基化過程中，表面活性劑的加入能顯著促進底物的分散和溶解。張曉麗等［50］考察了不同乳化劑（sp-60、sp-80、Tween-60、Tween-80）及其復配對坎利酮羥基化的影響，發(fā)現(xiàn)乳化劑對底物坎利酮有增溶作用，且Tween-80、復合乳化劑Tween80-sp60對坎利酮微生物轉(zhuǎn)化有促進作用，其中單組分乳化劑Tween-80的最佳質(zhì)量分數(shù)為0.18%，底物轉(zhuǎn)化率為90.32%；復合乳化劑Tween80-sp60最佳質(zhì)量分數(shù)為0.09%，轉(zhuǎn)化率為92.22%。

Avramova等［51］研究發(fā)現(xiàn)，非離子表面活性劑Tween-80在紅球菌生物轉(zhuǎn)化4雄烯-3，17-二酮的過程中能加速9α-甾體羥基化反應(yīng)。Li等［28，52］和 Lobastova等［53］在脫氫表雄酮的生物轉(zhuǎn)化過程中，研究非離子表面活性劑（Tween-40、Tween-60、Tween-80、Triton X-100、Triton X-114）在1%質(zhì)量濃度下對DHEA產(chǎn)二羥基化的影響。發(fā)現(xiàn)添加1%Tween-80作為助溶劑，5 g·L-1底物DHEA 的 7α，15α-二醇-DHEA 摩爾轉(zhuǎn)化率為77.4%，比原始生物轉(zhuǎn)化過程的摩爾轉(zhuǎn)化率提高了10.1%。添加2%Tween-80，底物溶解度為0.477 g·L-1，是對照（0.054 g·L-1）的 7.8倍，7α，15α-二氫-DHEA和DHEA摩爾轉(zhuǎn)化率分別提高了87%和34.6%。此外，研究表明，Tween-80存在時，培養(yǎng)的菌絲體更大且具有更光滑的表面，菌體不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸的比例顯著增加，不飽和脂肪酸的增加在一定程度上可增強膜的滲透性［51］，即Tween-80引起的 7α，15α-二氫-DHEA產(chǎn)率的顯著提高可能與其提高跨細胞膜轉(zhuǎn)運活性的能力有關(guān)［54］。

2.3 底物跨膜運輸

由于甾體轉(zhuǎn)化酶屬于胞內(nèi)酶，甾體分子必須穿過細胞壁和細胞膜才能與酶反應(yīng)，所以細胞壁和細胞膜的通透性對甾體轉(zhuǎn)化成功與否非常重要［55］。在保持生物活性的前提下，消除或降低細胞外膜的阻礙作用可促進生物轉(zhuǎn)化，即通過生物或化學手段均可改變細胞外膜滲透性。

2.3.1 化學法 化學法最早在1982年由Sedlaczek等［56］發(fā)現(xiàn)，研究者在去氫可的松的11β羥化中添加適量的稀KOH溶液、解旋酶、乙二胺四乙酸處理秀麗隱桿線蟲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孢子膨脹、外源化學物質(zhì)更易穿透進入細胞，經(jīng)化學試劑處理后的羥化產(chǎn)量可以提高2～4倍。

相轉(zhuǎn)移催化劑（phase transfer catalyst，PTC）是可以幫助反應(yīng)物從一相轉(zhuǎn)移到能夠發(fā)生反應(yīng)的另一相中，從而加快異相系統(tǒng)反應(yīng)速率的一類催化劑，目前主要應(yīng)用于有機化學反應(yīng)［57］。PTC不僅能增加疏水性底物的溶解度，同時還能改變細胞外膜的通透性和流動性［58］。

唐曉慶［59］、榮紹豐等［60］針對甾體底物的高度疏水性以及反應(yīng)過程需要跨膜運輸?shù)奶卣?，將PTC應(yīng)用到坎利酮微生物轉(zhuǎn)化中。在轉(zhuǎn)化體系中添加四丁基溴化銨（tetrabutylammonium bromide，TBABr）和1-丁基-3-甲基-咪唑六氟磷酸鹽（1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate，［BMIM］PF6）兩種PTC。結(jié)果表明，兩種PTC均能提高菌體對坎利酮的轉(zhuǎn)化能力。冷模條件下，TBABr及［BMIM］PF6均能提高底物坎利酮在水相中的溶解度，且PTC加入濃度越高，底物溶出越快，最終體系中底物的濃度越高；當體系中添加5 g·L-1［BMIM］PF6時，坎利酮溶解度較對照組高34.44%，添加10 g·L-1［BMIM］PF6坎利酮溶解度較對照組高64.83%。相同PTC濃度下，TBABr的促溶作用高于［BMIM］PF6，如添加濃度為 2 g·L-1時，前者體系中坎利酮的溶解度較后者體系中高2.69%。從兩種PTC的結(jié)構(gòu)可知，PTC疏水性烷基鏈可以攜帶疏水性底物坎利酮進入水相，提高水相中底物坎利酮的濃度。

唐曉慶［59］、榮紹豐等［60］對兩種PTC處理的菌體進行核酸和滲漏蛋白測定，并將其作為衡量菌體細胞通透性的指標。研究表明，在加入不同PTC種類及濃度下，蛋白質(zhì)滲漏量從高到低依次為5 g·L-1［BMIM］PF6組＞10 g·L-1TBABr組＞2 g·L-1［BMIM］PF6組＞2 g·L-1TBABr組＞對照組。菌體核酸的滲漏量趨勢與蛋白質(zhì)滲漏量一致。結(jié)果表明，處理組的細胞通透性高于對照組，且［BMIM］PF6的作用更顯著。表明 TBABr、［BMIM］PF6的加入能提高細胞通透性，從而加速底物坎利酮向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運速率，提高轉(zhuǎn)化率，且在投料濃度為30 g·L-1的條件下，底物的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率達到95.0%，轉(zhuǎn)化時間低于60 h。除一些化學試劑以外，羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）也可以通過改變細胞膜的大小、清晰度和表面結(jié)構(gòu)，從而增強簡單節(jié)桿菌對甾體1-脫氫的生物轉(zhuǎn)化。研究表明，用HP-β-CD處理后的細胞通透性較高，可提取脂質(zhì)的比例降低，不飽和脂肪酸和長鏈脂肪酸含量降低、蛋白質(zhì)水平的總泄漏增加，在細胞外觀察到屬于α-TP結(jié)合超家族和主要促進者超家族的蛋白質(zhì)，這些變化可以從分子水平上解釋HP-β-CD處理下滲透率的變化，羥丙基-β-環(huán)糊精有助于提高細胞通透性［61］。榮紹豐等［62］在制備11α，17α-羥基黃體酮時，通過在培養(yǎng)基中添加磁性納米四氧化三鐵粉，在高投料濃度為30 g·L-1時，摩爾轉(zhuǎn)化率仍可達到91.9%。

2.3.2 物理法 常用的物理方法包含超聲波技術(shù)和磁場技術(shù)，當超聲波在介質(zhì)中傳播時，由于超聲波與介質(zhì)的相互作用，使介質(zhì)發(fā)生物理的和化學的變化，從而產(chǎn)生一系列力學、熱學、電磁學和化學的超聲效應(yīng)。近年來，超聲波因具有波長短、穿透力強、操作簡單、成本低廉等物理特性，在醫(yī)療和化工領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

適當強度的超聲處理可以通過改變細胞膜的通透性來促進空化和改善傳質(zhì)來提高轉(zhuǎn)化效率。較早時，李曉靜［63］、陽葵等［64-65］考察了超聲因子、方式、時間與生長調(diào)節(jié)劑的配合使用等因素對甾體羥基化過程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲處理可以提高轉(zhuǎn)化率，且超聲波與表面活性劑配合使用時可以降低表面活性劑用量，減少表面活性劑對微生物菌體酶活性的影響，更有效地實現(xiàn)甾體底物轉(zhuǎn)化。進一步分析實驗數(shù)據(jù)，推測超聲生物效應(yīng)對甾體轉(zhuǎn)化可能有以下兩方面的作用：一是使甾體反應(yīng)物顆粒細化、增大固液界面、加速底物溶解和底物分子的傳遞從而提高轉(zhuǎn)化反應(yīng)效率；二是適當空化所產(chǎn)生的沖擊力會造成對細胞膜通透性的改變，促進胞內(nèi)酶的釋放及反應(yīng)物向胞內(nèi)的擴散。

電磁場可使細胞形態(tài)、脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）、核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）、蛋白質(zhì)合成、跨膜轉(zhuǎn)運、酶活性及生物遺傳等產(chǎn)生顯著變化。磁化水具有與普通水不同的獨特物理化學性質(zhì)，如提高物質(zhì)溶解能力、調(diào)節(jié)膜滲透性等功能。陽葵等［66］在16，17α-環(huán)氧孕酮11α-羥基化反應(yīng)研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)磁化水處理后的菌種斜面上菌層生長密實、豐厚飽滿、色澤碧綠，生長成熟期縮短28～32 h，且搖瓶轉(zhuǎn)化實驗表明，其轉(zhuǎn)化甾體底物的能力優(yōu)于對照，菌種性能明顯改善。

2.3.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù) 制備原生質(zhì)體用于甾體轉(zhuǎn)化是另一種有效解除細胞壁阻礙作用的方法，如王敏等［67］研究了氫化可的松生產(chǎn)菌藍色犁頭霉原生質(zhì)體的形成與再生，結(jié)果表明以0.4 mol·L-1NH4Cl做為穩(wěn)定劑、2.5 mg·mL-1溶壁酶和5 mg·mL-1纖維素酶組成的混合酶液溶解菌絲，4 h后原生質(zhì)體量高，再生率為15.6%，其11β羥化酶活性明顯高于完整菌絲體羥化酶的活性，在底物濃度相等的情況下可將轉(zhuǎn)化周期由48 h縮短至36 h。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)雖然有效改善了底物的傳質(zhì)阻力，但仍存在穩(wěn)定性差、再生迅速等問題，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。

2.3.4 分子工程方法 研究表明，膜工程在減少滲透性障礙方面比外源性透化劑更有效，如Ni等［68］使用分子工程方法通過降低膜通透性屏障來加速全細胞生物催化，選取具有遺傳改變的外膜結(jié)構(gòu)的大腸桿菌細胞，使用脂多糖突變體SM10和布朗氏脂蛋白突變體E609L與兩種大小和疏水性顯著不同的模型底物硝基頭孢菌素和四肽N-琥珀酰拉-Ala-Pro-Phe-p-硝基苯胺進行研究。通過遺傳方法降低外膜滲透性導致全細胞催化反應(yīng)的反應(yīng)速率顯著增加（高達380%）。引入的突變對膜通透性屏障的影響與多粘菌素B九肽的影響進行了比較，結(jié)果表明，通過基因修飾可以減少類脂A的合成，進而影響疏水性脂多糖的合成，故細胞對親水性底物四肽的通透性增加。

2.4 反應(yīng)器內(nèi)流體力學特性

生物反應(yīng)器內(nèi)流體的流動狀態(tài)，影響反應(yīng)器內(nèi)的流體速度、溶氧（dissolved oxygen，DO）、剪切速率等流體力學性質(zhì)，進而對微生物的生理特性產(chǎn)生影響，最終影響反應(yīng)效果。反應(yīng)器內(nèi)流體力學特性是生物轉(zhuǎn)化過程不可忽略且極其重要的研究內(nèi)容，對于甾體的微生物羥基化也是如此。Rong等［69］進行甾體微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)器流體力學方面的研究，在1 L反應(yīng)器考察了具有不同結(jié)構(gòu)參數(shù)透平槳流體力學特性，并采用熱模實驗考察了轉(zhuǎn)化率等參數(shù)。結(jié)果表明，大直徑（60 mm）六葉Rushton槳葉對氣體分散更有效，流體的軸向速度最高。增大葉片數(shù)和葉輪直徑均能提高葉輪的剪切和功率，且葉輪直徑的影響比葉片數(shù)的影響更明顯，即適度增加葉片數(shù)目和葉輪直徑，可以改善攪拌槽內(nèi)流體的混合，提高發(fā)酵液中溶氧值，對微生物的生長和坎利酮的11α-羥基化有促進作用，獲得了較高的底物轉(zhuǎn)化率。張曉麗等［70］在搖瓶水平上考察了坎利酮羥基化的轉(zhuǎn)速效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，一定范圍內(nèi)增加轉(zhuǎn)速，溶氧水平相應(yīng)增加，轉(zhuǎn)化率提高，在 160 r·min-1時，轉(zhuǎn)化率較高，但繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)化率反而下降。轉(zhuǎn)速過大，菌體受到較強的剪切作用，不利于菌體的生長；轉(zhuǎn)速較低，培養(yǎng)基中溶氧下降，不利于菌體對底物的轉(zhuǎn)化。

3 展望

甾體微生物羥基化反應(yīng)的工藝過程復雜，影響因素較多，甾體羥基化反應(yīng)過程的研究，目前主要集中于搖瓶水平發(fā)酵工藝的優(yōu)化，并取得了較多成果，也有很多學者開始從菌株的遺傳修飾、酶的固定化方面進行研究，但生物反應(yīng)器水平研究較少，如流體力學方面的研究，需給予足夠重視。絲狀真菌發(fā)酵生物反應(yīng)器是目前的研究熱點之一，目前僅有的研究中主要以冷模實驗為主，包括攪拌槳的類型、組合形式、轉(zhuǎn)速、通氣量等對發(fā)酵過程中的流變特性、混合特性、傳質(zhì)性能、氣液分散特性、顆粒懸浮特性、菌絲體形態(tài)等方面的影響，以及放大方法的研究。熱模實驗由于成本較高，研究較少，主要集中于1 L和5 L發(fā)酵罐，研究的主要內(nèi)容為攪拌槳類型、轉(zhuǎn)速、通氣量、發(fā)酵工藝對轉(zhuǎn)化率、酶活、菌絲體形態(tài)等參數(shù)的影響。不同規(guī)模生物反應(yīng)器內(nèi)流體力學特性、耦合微生物生理特性，即反應(yīng)工程特性與工藝特性結(jié)合，是實現(xiàn)工業(yè)放大的必經(jīng)之路。此外，在攪拌槳型研究中，目前提出了柔性槳的概念，國外研究中將其應(yīng)用于米曲霉產(chǎn)糖過程，可有效提高轉(zhuǎn)化率和酶活，改善粘壁現(xiàn)象，但在甾體羥基化過程中的研究仍有待進一步的探索；同時因甾體羥基化衍生物的具有重要的生物活性，市場需求量較大，未來仍需持續(xù)重點從工程與工藝兩個方面對甾體化合物羥基化進行研究。