富氫液對膿毒癥小鼠心肌細胞線粒體自噬的影響

侯凱耀， 張二飛， 鄭李娜， 陳紅光， 謝克亮

1.延安大學醫(yī)學院，陜西 延安 716000；

2.延安大學附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 延安 716000；

3.山西省人民醫(yī)院麻醉科，太原 030012；

4.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院麻醉科，天津 300052；

5.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院重癥醫(yī)學科，天津 300052

膿毒癥是由于微生物感染導致免疫系統(tǒng)過度激活，從而導致炎癥相關損傷的疾病，膿毒癥是全球十大最常見的死亡原因，該病引起的心肌損傷被稱為膿毒癥心肌病，也是感染患者最常見的死亡原因。膿毒癥的早期治療可改善患者預后，降低死亡率［1］。研究表明，膿毒癥引起的心功能障礙在膿毒癥中的發(fā)生率達40%，膿毒癥并發(fā)心功能障礙死亡率可達70%～90%［2］。膿毒癥誘導的心肌細胞線粒體氧化應激是心肌損傷的主要原因［3］。膿毒癥中心肌細胞線粒體超微結構損傷（線粒體腫脹和線粒體嵴丟失）和功能障礙［線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）下降和ATP產生減少］，最終引起心肌功能障礙［4］。目前，通過減輕膿毒癥心肌線粒體損傷改善心肌損傷的相關研究較少，且機制尚不清楚。有研究證實，通過誘導心肌細胞線粒體自噬可改善心肌細胞線粒體功能障礙和心肌損傷、防止心肌缺血再灌注損傷引起的心功能衰竭［5］。膿毒癥引起的心肌線粒體損傷和線粒體功能障礙是心肌損傷和心功能障礙的關鍵因素。線粒體自噬被證實是改善線粒體損傷、提高線粒體功能的有效途徑，但靶向調控線粒體自噬改善膿毒性心肌線粒體損傷的研究鮮有報道。

研究發(fā)現(xiàn)，氫可通過抗炎、抗氧化發(fā)揮對損傷器官的保護作用，低濃度氫氣具有膿毒癥保護作用［6］，可減輕肺、腦、肝等器官的損傷［7-8］。近年來，氫的醫(yī)學應用一直是科學家們研究的重點之一，氫的醫(yī)學應用的另一表現(xiàn)形式是以富氫液來實現(xiàn)的，而富氫液能否誘導心肌線粒體自噬從而改善膿毒癥引起的心肌損傷和心功能障礙尚未見報道?；诖?，本研究旨在評價腹腔注射富氫液對膿毒癥小鼠心肌細胞線粒體自噬的調控及心功能障礙的治療作用，以期為富氫液的醫(yī)學應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取72只雄性C57BL/6J小鼠作為研究對象，6～8周齡，體質量20～25 g，均購自中國北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心［動物合格證號：SCXK（京）-0008］。采用隨機數(shù)字表法分為4組：假手術組（Sham組）、假手術+富氫液組（Sham+HRS組）、膿毒癥組（CLP組）、膿毒癥+富氫液組（CLP+HRS組）。本實驗經延安大學醫(yī)學院實驗動物管理委員會批準，實驗過程遵守倫理學規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 盲腸結扎穿孔（cecal ligation perforation,CLP）制備膿毒癥模型制備 實驗前動物禁食，自由飲水。采用盲腸結扎穿孔法［6］建立小鼠膿毒癥模型。小鼠吸入2%七氟烷（恒瑞醫(yī)藥，國藥準字H20070172）進行麻醉。在無菌手術環(huán)境下，沿腹中線切開腹壁約1 cm進入腹腔，無菌鑷探查到盲腸后用手術縫線在回盲瓣下方距離盲腸根部約1.5 cm處用5號無菌絲線結扎盲腸，距離盲腸根部約1 cm處用22 G針頭穿透，并擠出少許糞便，將盲腸和擠出物共同還納腹腔，用無菌6-0絲線逐層縫合腹壁切口。Sham組和Sham+HRS組僅進行開腹及盲腸游離。手術結束后每只動物皮下注射0.9% NaCl溶液（50 kg·mL-1）。于術后6 h開始皮下注射抗生素［美羅培南，石藥集團中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司，國藥準字H20065253］25 mg·kg-1，1次·d-1，連續(xù)注射3 d。

1.2.2 富氫液制備 參考相關文獻［9］的方法，在高壓（0.4 MPa）下，使用GCH-300高純氫氣發(fā)生器（天津同普分析儀器科技有限公司）產生氫氣。將氫氣（純度＞99.9999%）在0.9% NaCl溶液中溶解4 h達到飽和狀態(tài)，常壓4℃儲存?zhèn)溆?，γ射線消毒滅菌。富氫液均為新鮮制備使用，氫濃度為0.6 mmol·L-1。于造模后1、6 h時，Sham+HRS組和CLP+HRS組小鼠腹腔注射富氫液10 mL·kg-1。Sham組和CLP組小鼠腹腔注射等容量0.9% NaCl溶液。

1.2.3 炎癥因子和心肌酶測定 造模后24 h，各組隨機取6只小鼠，吸入2%七氟烷進行麻醉，收集小鼠頸動脈血樣，在25℃下靜置凝結30 min。在1 500 r·min-1，4 ℃下離心15 min，取上清，-80 ℃保存待生化測定。采用ELISA試劑盒（美國R&D Systems公司）測定血清炎癥因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）水平，采用ELISA試劑盒（江蘇南京建成生物公司）測定肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）和肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）。

1.2.4 線粒體膜電位和ATP測定 造模后24 h，各組隨機取6只小鼠，吸入2%七氟烷進行麻醉，取左室心肌組織。按照組織線粒體分離試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）說明書分離線粒體。按照10 mL·g-1組織的用量加入線粒體分離介質A，在預冷的玻璃勻漿器中充分勻漿10次，4℃下1 000 r·min-1離心5 min，取上清液，4℃下3 500 r·min-1，離心10 min，棄上清，沉淀即為粗制線粒體。加入保存介質約400μL·g-1。采用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度［10］。采用熒光分光光度法檢測線粒體膜電位［11］。將線粒體加入0.9 mL JC-1染色工作液，混勻后使用EnSpire多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）測定綠色熒光強度（激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm）和紅色熒光強度（激發(fā)波長525 nm，發(fā)射波長590 nm），計算紅色熒光與綠色熒光強度的比值即為MMP。參照ATP檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）說明書采用熒光素-熒光酶發(fā)光法進行檢測。按照10 mL·g-1組織的用量加入ATP檢測裂解液，在預冷的玻璃勻漿器中充分勻漿10次，4℃下10 000 r·min-1離心5 min，取上清。在檢測孔中加入20μL組織樣本，混勻后使用EnSpire多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）測定相對光單位值，根據(jù)標準曲線計算ATP含量。

1.2.5 線粒體自噬相關蛋白測定 采用Western blot法測定心肌組織線粒體自噬LC3Ⅰ/Ⅱ和P62的表達。造模后24 h，各組隨機取6只小鼠，吸入2%七氟烷進行麻醉，分離左室心肌組織稱重，加入預冷的PBS緩沖液和蛋白酶抑制劑，采用JY96-II超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）裂解勻漿5 min，4 ℃下14 000 r·min-1離心10 min，離心半徑10 cm，取上清，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性，-80℃保存。經電泳分離蛋白、轉膜、脫脂牛奶封閉，加入LC3Ⅰ/Ⅱ和P62一抗（1∶800，英國Abcam公司），4℃孵育過夜。次日TBST洗膜5次，每次5 min，加入相應二抗室溫孵育1 h。洗膜緩沖液（Tris-buffered saline tween，TBST）洗膜5次，每次5 min；避光加入電化學發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）超敏發(fā)光液，機器曝光。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶的灰度值與對應內參磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 富氫液對膿毒癥小鼠心肌損傷炎癥因子和心肌損傷指標的影響

由表1可知，術后24 h，4組小鼠TNF-α、IL-1β、cTnI、CK-MB水平比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Sham組和Sham+HRS組血清TNF-α、IL-1β、cTnI和CK-MB水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sham組比較，CLP組和CLP+HRS組血清TNF-α、IL-1β、cTnI、CK-MB水平均顯著升高（P＜0.05）；與CLP組比較，CLP+HRS組血清TNF-α、IL-1β、cTnI、CK-MB 水平均顯著降低（P＜0.05）。以上結果表明，富氫液可以抑制膿毒癥小鼠的炎癥因子的過度表達，緩解心肌損傷。

表1 4組小鼠血清TNF-α、IL-1β、cTnI和CK-MB水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum TNF-α,IL-1β,cTnI and CK-MB levels among four groups of mice(±s)

表1 4組小鼠血清TNF-α、IL-1β、cTnI和CK-MB水平比較（±s）Table 1 Comparison of serum TNF-α,IL-1β,cTnI and CK-MB levels among four groups of mice(±s)

注：TNF-α—腫瘤壞死因子-α；IL-1β—白細胞介素-1β；cTnI—肌鈣蛋白I；CK-MB—肌酸激酶同工酶。*表示與Sham組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學意義；#表示與CLP組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學意義。

CK-MB（U·L-1）1 450.17±60.48 1 464.01±61.56 3 670.50±404.76*2 328.67±305.05*#99.26＜0.001組別Sham組（n=6）Sham+HRS組（n=6）CLP組（n=6）CLP+HRS組（n=6）F值P值TNF-α（pg·mL-1）43.17±5.67 44.01±5.73 184.83±13.11*123.17±8.42*#366.42＜0.001 IL-1β（pg·mL-1）31.67±4.72 30.17±4.79 62.67±6.98*40.17±5.71*#42.67＜0.001 cTnI（pg·mL-1）2.73±0.22 2.73±0.20 3.63±0.22*3.04±0.28*#20.01＜0.001

2.2 富氫液對膿毒癥小鼠心肌損傷線粒體ATP含量和MMP的影響

由表2可知，術后24 h，4組心肌線粒體ATP含量和MMP比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Sham組和Sham+HRS組心肌線粒體ATP含量和MMP比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sham組比較，CLP組和CLP+HRS組心肌線粒體ATP含量和MMP比較均顯著降低（P＜0.05）；與CLP組比較，CLP+HRS組心肌線粒體ATP含量和MMP均顯著升高（P＜0.05）。以上結果表明，富氫液可以通過增加膿毒癥心肌損傷線粒體ATP含量和改善MMP來提高線粒體功能。

表2 4組小鼠心肌組織MMP和ATP含量比較（±s）Table 2 Comparison of MMP and ATP contents in myocardial tissue among four groups of mice(±s)

表2 4組小鼠心肌組織MMP和ATP含量比較（±s）Table 2 Comparison of MMP and ATP contents in myocardial tissue among four groups of mice(±s)

注：MMP—線粒體膜電位；ATP—三磷酸腺苷。*表示與Sham組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學意義；#表示與CLP組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學意義。

ATP（nmol·g-1蛋白）6.60±0.67 6.53±0.69 3.32±0.59*6.28±0.67*#34.925＜0.001組別Sham組（n=6）Sham+HRS組（n=6）CLP組（n=6）CLP+HRS組（n=6）F值P值MMP（紅/綠強度比值）5.02±0.78 5.02±0.65 3.15±0.50*4.44±0.56*#11.684＜0.001

2.3 富氫液對膿毒癥小鼠心肌組織線粒體自噬的影響

由表3可知，4組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62/GAPDH表達水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Sham組與Sham+HRS組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62/GAPDH表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與Sham組比較，CLP組和CLP+HRS組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平顯著升高（P＜0.05），P62達水平表達顯著降低（P＜0.05）；與CLP組比較，CLP+HRS組LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達水平進一步增加（P＜0.05），P62表達水平進一步降低（P＜0.05）。結果表明，富氫液可以增加線粒體自噬的發(fā)生，可能與受損線粒體的更新和循環(huán)有關。

表3 4組小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和P62表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and P62 expression levels in myocardial tissues among four groups of mice(±s)

表3 4組小鼠心肌組織LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和P62表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and P62 expression levels in myocardial tissues among four groups of mice(±s)

注：LC3Ⅱ/LC3Ⅰ—微管關聯(lián)蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ；P62—蛋白62；GAPDH—內參蛋白。*表示與Sham組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學意義；#表示與CLP組比較，差異在P＜0.05水平有統(tǒng)計學意義。

P62/GAPDH 0.75±0.12 0.74±0.13 0.56±0.10*0.31±0.06*#31.310＜0.001組別Sham組（n=6）Sham+HRS組（n=6）CLP組（n=6）CLP+HRS組（n=6）F值P值LC3Ⅱ/LC3Ⅰ1.00±0.14 0.98±0.13 1.45±0.22*1.87±0.29*#25.430＜0.001

3 討論

膿毒癥性心肌病的發(fā)病機制包括氧化應激、鈣失衡、線粒體功能障礙、內質網(wǎng)應激、自噬抑制、程序性細胞死亡激活、免疫紊亂等［12］。有研究報道，脂多糖誘導的膿毒癥心功能障礙與線粒體生物合成功能不全相關。過度的線粒體裂變會促進線粒體損傷，減少線粒體ATP的合成，通過線粒體依賴的凋亡途徑導致心肌細胞死亡，從而導致心臟功能下降［13］。因此，線粒體功能障礙可能是膿毒癥性心肌病潛在的分子機制［14］。氫具有在細胞水平上起作用的能力，H2可穿過血腦屏障，進入線粒體，甚至在一定條件下還具有轉運到細胞核的能力。近年來，氫的生物學效應已在170多種疾病模型和人類疾病中得到證實［15］，包括缺血/再灌注損傷、代謝綜合征、炎癥、癌癥、腦損傷和敗血癥［16-21］。但目前H2治療疾病的機制尚未完全明確，其可能的機制包括抗炎、抗氧化、抗凋亡、保護線粒體、保護內質網(wǎng)、調節(jié)免疫細胞亞型和信號通路等。

心肌細胞線粒體功能障礙在膿毒性心肌病病理過程中起著十分重要的作用，線粒體功能受損導致細胞ATP儲存的消耗，細胞ATP儲存對于維持心肌組織的完整性和預防心肌細胞損傷至關重要，線粒體損傷發(fā)生線粒體裂變導致心肌細胞中的線粒體斷裂和跨膜電位去極化，并導致線粒體功能障礙［15］。本研究結果表明，膿毒癥會導致心肌細胞線粒體的ATP含量降低和MMP下降，而給予富氫液處理后，心肌線粒體ATP含量和MMP增加，說明富氫液可能改善了線粒體的功能進而降低了膿毒癥心肌損傷。由于功能失調的線粒體可以通過自噬分離和消除，這一過程稱為線粒體自噬。線粒體自噬是參與修復受損線粒體的主要應激反應和保護機制之一，在嚴重或慢性壓力下，過度或不足的自噬會導致大量的自我降解或有毒物質的積累，兩者均是不適應的，并最終引發(fā)細胞死亡［22-23］。LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化的過程是自噬的進行過程，LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化的減少或LC3Ⅰ水平的增加是自噬水平降低的特征；相反，當自噬增加時，會發(fā)現(xiàn)更高水平的LC3Ⅱ蛋白，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的升高被認為是自噬的標志；另一個廣泛使用的自噬標記物是P62，其是作為一個適配器分子，自噬受體P62是細胞解毒、應激反應和代謝過程的關鍵介質［19］。

本課題組前期的研究證實了H2可以減輕膿毒癥腦細胞的線粒體功能障礙［24］，富氫液可以減輕LPS導致的巨噬細胞的線粒體功能障礙［25］。而對于線粒體功能障礙的調控方式之一的線粒體自噬，已有的研究也表明，富氫生理鹽水可通過PTEN誘發(fā)的假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK）介導的自噬減輕心肌I/R損傷中的炎癥和細胞凋亡［24］。在心肌蛋白水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，膿毒癥組LC3表達增加，P62表達降低。膿毒癥導致自噬增加，考慮是應激導致自噬增加，與已有研究結果一致［26-27］，膿毒癥導致的急性肺損傷出現(xiàn)自噬增加。給予富氫液后的結果顯示，與膿毒癥組相比，給予富氫液治療的膿毒癥小鼠，P62水平進一步降低，腹腔注射富氫液后膿毒癥小鼠心肌LC3Ⅱ蛋白水平進一步增加，LC3Ⅰ蛋白水平降低，提示富氫液可通過促進膿毒性心肌細胞的線粒體自噬作用改善心肌線粒體功能。與本課題組前期的結果一致［28］，富氫液能夠使LPS導致的急性肺損傷和巨噬細胞自噬進一步增加，發(fā)揮對受損線粒體清除再循環(huán)利用的作用。

綜上所述，富氫液改善小鼠膿毒癥心功能障礙的機制可能與調節(jié)心肌細胞線粒體自噬、改善心肌線粒體功能相關。但是本研究也存在不足，自噬干預后，富氫液的治療效果和機制還有待進一步驗證。本研究結果為H2治療膿毒癥提供了新的理論依據(jù)。