太子參多糖的純化、組成及對(duì)LPS 損傷Raw264.7 巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用

謝美林，徐海清 ，李景明，查道喜，王學(xué)瑛，陳 洋，朱啟法

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.安徽皖南煙葉有限責(zé)任公司，安徽宣城 242000）

太子參是石竹科植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla（Miq.） Pax ex Pax etHoffm.干燥后的塊根，具有益氣、健脾潤(rùn)肺之功效[1]。近30 年，太子參的年需求量表現(xiàn)出強(qiáng)勁的增長(zhǎng)趨勢(shì)，支撐其市場(chǎng)需求不斷攀升的背后，是太子參較為穩(wěn)定、溫和的功能性。現(xiàn)有研究表明，太子參有抗腫瘤[2-3]、免疫調(diào)節(jié)[4-5]、降血糖[6-7]、抗氧化應(yīng)激[8]、保護(hù)心肌[9]等保健功效。目前公認(rèn)多糖是太子參中最主要的活性物質(zhì)之一，然而有關(guān)太子參多糖的研究大多集中在粗多糖的功能活性評(píng)價(jià)上，缺乏前期的純化工藝、理化性質(zhì)研究基礎(chǔ)，其功能、藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)和指標(biāo)性成分不夠明確[10-11]，這給太子參多糖資源的開(kāi)發(fā)和利用帶來(lái)了局限。

免疫系統(tǒng)是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜又重要的生理體系，伴隨著免疫系統(tǒng)的鈍化和免疫應(yīng)答的失衡，各種疾病接踵而至[12]，通過(guò)調(diào)節(jié)免疫來(lái)預(yù)防或治療疾病已成為研究熱點(diǎn)之一。已有研究表明太子參在免疫調(diào)節(jié)方面表現(xiàn)出潛力，陳耀金等[4]利用太子參膠囊粉灌胃小鼠，結(jié)果表明其對(duì)免疫功能低下小鼠的免疫力有增強(qiáng)效果；并且張炎達(dá)等[5]從太子參須獲得的粗提物也表現(xiàn)出顯著改善小鼠免疫功能。由于小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞（Raw 264.7）體外培養(yǎng)過(guò)程中也具備對(duì)抗原的較強(qiáng)吸附與吞噬能力，并釋放相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)因子，在一定程度上能夠模擬體內(nèi)巨噬細(xì)胞有關(guān)的免疫調(diào)節(jié)作用，是該類研究中常用的模型細(xì)胞[13]。因此，本研究提純了太子參多糖，并測(cè)定了太子參多糖的分子量與組成以及初步表征其結(jié)構(gòu)，以此基礎(chǔ)利用Raw 264.7 細(xì)胞模型初探了太子參多糖對(duì)脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）損傷Raw264.7 巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用，以期促進(jìn)太子參資源的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

太子參 安徽皖南煙葉公司太子參種植基地提供，采收年份為2019 年，經(jīng)曬干后直接運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-20 ℃保存留用；小鼠單核巨噬細(xì)胞系Raw 264.7中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供；DEAE Cellulose-52 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；單糖標(biāo)準(zhǔn)品（葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、核糖、N-乙酰-氨基葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖） 上海源葉生物科技有限公司；葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品（1、3、12、70、126、287 kDa）、青霉素-鏈霉素雙抗（100×）、噻唑藍(lán)（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）北京索萊寶科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） Sigma 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基美國(guó)Gibco 公司；類胎牛血清 美國(guó)HyClone 公司。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；IR Tracer-10 傅里葉變換紅外光譜儀 島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；U3000 高效液相色譜儀賽默飛世爾科技公司；Agilent 1206 高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；XSP-C204 光學(xué)顯微鏡CIC 公司；RT-6100 酶標(biāo)儀 雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 太子參粗多糖的提取 參考Hu 等[14]的方法，并稍作修改：太子參破碎成粉，過(guò)40 目篩，以蒸餾水為溶劑，100 ℃水浴提取120 min（1:8，m/v），8000 r/min離心15 min，取上清液備用，殘?jiān)凑障嗤椒ǚ磸?fù)提取共3次，合并上清液。旋蒸濃縮、Sevag 法除蛋白后加入無(wú)水乙醇配成終濃度為80%的乙醇溶液，于4 ℃條件下沉淀過(guò)夜12 h，8000 r/min 離心5 min后，收集沉淀，冷凍干燥，得太子參粗多糖。

1.2.2 太子參粗多糖的純化工藝優(yōu)化 DEAE Cellulose-52 是一種弱堿性陰離子填料，當(dāng)粗多糖溶液通過(guò)時(shí)，中性多糖可以流出，酸性多糖吸附在色譜物質(zhì)中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)中性與酸性多糖的有效分離[15]。因此，本研究使用DEAE Cellulose-52 填料進(jìn)行粗多糖的純化，參考雷思敏等[16]的方法，并稍作修改：以DEAE Cellulose-52 為柱填料，Tris-HCl 緩沖液溶解粗多糖上樣，上樣粗多糖濃度為1 mg/mL，采用NaCl鹽溶液進(jìn)行洗脫，流速為2.0 mL/min，10 mL/tube 收集，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)洗脫液，繪制洗脫曲線。

1.2.2.1 pH 的選擇 預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定了緩沖液環(huán)境為pH7.2～7.8 的洗脫效果，其中pH7.6 的效果較佳。在預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確稱取太子參粗多糖樣品25.0 mg，分別溶于25 mL pH 7.4、7.6、7.8 的Tris-HCl 緩沖液中，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾后緩慢上樣，吸附15 min，用0～0.3 mol/L NaCl 的Tris-HCl 緩沖液洗脫。

1.2.2.2 洗脫鹽濃度的選擇 參考1.2.2.1 中步驟，參數(shù)加以修改：pH7.6 緩沖液條件下，分別含0～0.1（0、0.1）、0～0.3（0、0.1、0.2、0.3）、0～0.5（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mol/L NaCl 的Tris-HCl 緩沖液梯度洗脫，濃度梯度為0.1 mol/L。

1.2.3 太子參多糖（PHP）的理化特征及結(jié)構(gòu)表征

1.2.3.1 紫外光譜掃描 稱取適量冷凍干燥后的PHP，用去離子水配制成100 μg/mL 的PHP 溶液，在25 ℃，波長(zhǎng)190～400 nm 范圍的紫外掃描儀中進(jìn)行掃描。

1.2.3.2 紅外光譜掃描 稱取2 mg 冷凍干燥后的PHP，與100 mg 經(jīng)120 ℃烘干4 h 的溴化鉀研磨混合后壓片，在4000～400 cm-1的范圍進(jìn)行紅外光譜掃描[17]。

1.2.3.3 分子量檢測(cè) 采用凝膠滲透色譜（Gel permeation chromatography，GPC）測(cè)定PHP 的分子量分布[18]。具體如下：色譜儀為Agilent 1206，選用Agilent PL aquageL-OH MIXED-M 色譜柱（7.5 mm×300 mm,8 μm），檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器，進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相為0.1 mol/L NaNO3溶液，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

1.2.3.4 單糖組成 采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化結(jié)合U3000 高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)PHP 的單糖組成。參考戴軍等的方法[19]，并稍作修改。PMP衍生：準(zhǔn)確吸取250 μL 混合對(duì)照溶液到5 mL EP 管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH，500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇，70 ℃反應(yīng)1 h。冷水中冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl 中和，再加入1 mL 氯仿漩渦1 min，3000 r/min 離心10 min，小心取上清，萃取3次。上清用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)條件：色譜儀為賽默飛U3000，選用Xtimate C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相為0.05 mol/L的磷酸二氫鉀溶液:乙腈（83:17），流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

1.2.4 PHP 對(duì)Raw 264.7 巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用

1.2.4.1 PHP 對(duì)Raw264.7 巨噬細(xì)胞的毒性作用濃度 細(xì)胞種板、培養(yǎng)參考Lee 等[20]的方法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞以1.0×105個(gè)/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔體積100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，分別加入含80、160、320、640、960 μg/mL PHP 的饑餓培養(yǎng)基（含2% 胎牛血清）100 μL，空白對(duì)照組為相同體積的饑餓培養(yǎng)基，同一處理設(shè)置6 個(gè)平行復(fù)孔。24 h 后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在492 nm 下的吸光值。

1.2.4.2 PHP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)傷害的細(xì)胞存活率影響LPS 誘導(dǎo)的免疫損傷是研究免疫調(diào)節(jié)作用的常用模型。參考Jin 等[21]的方法，并稍作修改。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1.0×105個(gè)/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔體積100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，分別加入含80、160、320、640 μg/mL PHP 的饑餓培養(yǎng)基100 μL，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組均加入相同體積饑餓培養(yǎng)基。處理4 h后，更換培養(yǎng)液，除空白對(duì)照組外均加入含1 μg/mL LPS 的饑餓培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)20 h。同一處理設(shè)置6 個(gè)平行復(fù)孔，隨后采用MTT 法檢測(cè)各孔在492 nm 下的吸光值，計(jì)算細(xì)胞存活率，并采用光學(xué)顯微鏡對(duì)培養(yǎng)結(jié)束后的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

式中：A2表示實(shí)驗(yàn)組的吸光值；A1表示對(duì)照組吸光值；A0表示空白組吸光值。

1.2.5 太子參多糖的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定太子參多糖[22]。具體如下：準(zhǔn)確稱取無(wú)水葡萄糖10 mg，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻后即得100 mg/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL 于試管中，加蒸餾水定容至2 mL。先加入1 mL 5%苯酚，振蕩搖勻后再加入5 mL 濃硫酸，振蕩搖勻后于100 ℃沸水浴中先加熱15 min，后冰浴5 min，于490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以2 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白對(duì)照。分別以葡萄糖含量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。太子參粗多糖得率及純度計(jì)算公式如下：

式中：m 表示由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的多糖質(zhì)量，mg；M1表示提取時(shí)太子參粉的質(zhì)量，mg；M2指太子參粗多糖的質(zhì)量，mg；n 表示稀釋倍數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 23 軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Excel、Origin 2017 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參多糖的測(cè)定

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0067x-0.0667，其R2=0.9987，表明在32～138 μg 的質(zhì)量范圍內(nèi)具備良好的線性關(guān)系。通過(guò)水提醇沉法對(duì)太子參粗多糖進(jìn)行提取，由苯酚-硫酸法檢測(cè)得知太子參多糖得率為8.23%±0.78%，多糖純度為51.47%±2.59%。與Hu 等的文獻(xiàn)相比，多糖純度提高了7.07%[14]。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 太子參多糖的純化工藝優(yōu)化

2.2.1 pH 條件優(yōu)化 DEAE Cellulose-52 是一種陰離子交換樹(shù)脂，在堿性條件下有利于交換發(fā)生?；诖?，本研究首先對(duì)比了太子參粗多糖在不同弱堿性（pH 為7.4、7.6、7.8）環(huán)境下的洗脫效果，以確定洗脫液的最佳pH。由圖2可知，該粗提物中性多糖含量高，酸性多糖含量相對(duì)較低。并且不同pH 的洗脫液處理時(shí)，表現(xiàn)出不同分離效果；當(dāng)pH 為7.4（圖A）時(shí)，前半段分離效果比較好，而后三個(gè)峰存在連續(xù)拖尾現(xiàn)象；當(dāng)pH 為7.6（圖B）時(shí)，洗脫峰分離度高，無(wú)拖尾現(xiàn)象，主要峰的吸光值最高，洗脫效果較好；當(dāng)pH 為7.8（圖C）時(shí)，雖然峰形明顯，但峰形不夠尖銳。因此，選擇pH 為7.6 作為太子參多糖純化的pH 條件。

圖2 不同pH 下的離子交換洗脫曲線Fig.2 Ion exchange elution curve at different pH

2.2.2 梯度洗脫鹽濃度的選擇 進(jìn)一步對(duì)比了不同鹽濃度（0～0.1、0～0.3、0～0.5 mol/L，NaCl）的洗脫液對(duì)太子參粗多糖的洗脫效果。由圖3可知，在0～0.1 mol/L 的NaCl 條件下，峰分離度高，但峰數(shù)少，具有一定分離效果；在0～0.3 mol/L 的NaCl 條件下，多糖被主要分成5 個(gè)峰，其中前3 個(gè)分離度好，且吸光值高。在0～0.5 mol/L 的NaCl 條件下，多糖被分成更多級(jí)分，但分離度差，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，不利于選擇組分進(jìn)行收集。因此本實(shí)驗(yàn)選擇0～0.3 mol/L 的NaCl 作為太子參多糖純化的鹽濃度洗脫條件。

圖3 不同洗脫鹽濃度的離子交換洗脫曲線Fig.3 Ion exchange elution curve at different salt concentrations

綜上，以pH7.6 的Tris-HCl 緩沖液上樣，選擇0～0.3 mol/L NaCl 的鹽溶液進(jìn)行洗脫，收集第1 個(gè)主峰，旋蒸濃縮，透析除鹽，冷凍干燥，即得太子參多糖。采用苯酚-硫酸法檢測(cè)其純度為80.52%±1.84%，相比于現(xiàn)有文獻(xiàn)，用于功能研究的太子參的多糖提取物，純度提高了17.02%[23]。

2.3 PHP 的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外光譜掃描 如圖4所示，曲線整體呈先上升再下降的趨勢(shì)，在210 nm 左右有最大吸收，且吸光值高達(dá)2.000，而210 nm 為多糖的特征吸收峰[24]，此處吸光值高說(shuō)明PHP 的主要成分為多糖。圖中在240～290 nm 處有一個(gè)較寬的小吸收峰，吸光值低于0.500。260 和280 nm 分別是核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收波長(zhǎng)[25]，這說(shuō)明純度為80.52%的PHP 的雜質(zhì)主要可能為蛋白質(zhì)和核酸。

圖4 PHP 的紫外全掃描圖譜Fig.4 UV spectra of PHP

2.3.2 紅外光譜掃描 紅外圖譜常常用來(lái)鑒定多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)。在中紅外圖譜解析中，一般將波數(shù)4000～1300 cm-1稱為特征區(qū)，可以根據(jù)分子官能團(tuán)和基團(tuán)吸收峰來(lái)判斷物質(zhì)類別。1300～400 cm-1稱為指紋區(qū)，可以判斷糖苷鍵類型和構(gòu)型[26]。

PHP 的紅外掃描圖譜見(jiàn)圖5。圖中3400 cm-1的-OH 伸縮振動(dòng)峰、2936 cm-1的C-H 鍵的伸縮振動(dòng)峰和1380 cm-1的C-H 鍵的彎曲振動(dòng)峰，聯(lián)合證明所檢測(cè)化合物為糖類化合物[27-29]。在1636 和1424 cm-1分別為-COOH 的非對(duì)稱及對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。圖譜在1000～1200 cm-1的三個(gè)吸收峰是吡喃環(huán)吸收振動(dòng)引起的，具有C-O-C 骨架[30]，α型的C-H在844 cm-1會(huì)有一個(gè)吸收峰，而β型的在891 cm-1處有一個(gè)吸收峰[31]，圖中在852 cm-1有一個(gè)吸收峰，說(shuō)明含有α-型糖苷鍵。綜上說(shuō)明PHP 是一種α-吡喃糖。

圖5 PHP 的紅外光譜掃描圖Fig.5 Scanning infrared spectrum of PHP

2.3.3 分子量檢測(cè) 多糖的溶解度和粘度受其分子量大小的影響，并且多糖鏈的大小與結(jié)構(gòu)與其生物活性密切相關(guān)[30]。以出峰時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù)值（lg Mw）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為lg Mw=-1.2807 t+15.374，R2=0.9981。

如圖6所示，PHP 主要被分成3 個(gè)峰，其中2 個(gè)強(qiáng)吸收峰的出峰時(shí)間在9.38 與9.90 min，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子量分別為2.3×103和500 Da。此外，8.13～9.10 min 有1 個(gè)較大連續(xù)峰，代入標(biāo)曲后分子量在5.2×103～92×103Da 之間。結(jié)合文獻(xiàn)，太子參中多糖的分子量基本在3×103～2.2×105Da 之間[14,32-33]。有研究報(bào)道，醇沉的乙醇終濃度不同，所得多糖的分子量會(huì)不同[34]，李松法等[35]采用不同濃度的乙醇分級(jí)醇沉了黃芪多糖，發(fā)現(xiàn)醇沉所得黃芪多糖的分子量隨乙醇濃度的升高而降低。本研究中太子參多糖分子量在500～92×103Da 之間，與現(xiàn)有的太子參多糖的分子量存在差異，這可能是使用80%乙醇濃度醇沉導(dǎo)致的。

圖6 PHP 的分子量分布Fig.6 Molecular weight distribution of PHP

2.3.4 單糖組成檢測(cè) 標(biāo)準(zhǔn)單糖出峰時(shí)間及順序見(jiàn)圖7。圖8 為PHP 的HPLC 色譜圖，PHP 主要是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖醛酸組成。郭守斌測(cè)定了10 種不同產(chǎn)地太子參的單糖，總結(jié)出太子參的單糖組成為半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無(wú)水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸，且不同產(chǎn)地太子參多糖中單糖組成略有差異[36]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是基本一致的。夏和先等比較了組培太子參和野生太子參的單糖組成，發(fā)現(xiàn)其單糖組成基本相同，但單糖的比例明顯不同[37]。葡萄糖與半乳糖是PHP 中最主要的兩種單糖，這與金針菇、杏鮑菇、猴頭菇等食用菌多糖的單糖組成相類似[38]，可能具有與其類似的免疫調(diào)節(jié)、降血糖血脂、抗疲勞等生理活性[39]。

圖7 單糖混標(biāo)樣品的HPLC 色譜圖Fig.7 HPLC spectrum of the mixture of monosaccharides

圖8 PHP 的HPLC 圖譜Fig.8 HPLC spectrum of PHP

2.4 PHP 對(duì)Raw 264.7 巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用

2.4.1 PHP 對(duì)Raw 264.7 巨噬細(xì)胞的毒性作用濃度PHP 對(duì) Raw 264.7 巨噬細(xì)胞毒性作用結(jié)果如圖9所示。PHP 在80～640 μg/mL 范圍內(nèi)，對(duì)Raw 264.7巨噬細(xì)胞的存活率具有提升作用，且呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系，在添加量為320 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率最大，為111.35%。但是當(dāng)濃度達(dá)到960 μg/mL 后，PHP 對(duì)細(xì)胞表現(xiàn)出毒害作用，因此，選擇PHP 濃度為80～640 μg/mL 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。張麗娟等[40]探究了太子參多糖對(duì)Raw 264.7巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響，結(jié)果表明太子參多糖的安全濃度為600 μg/mL，這與本文研究結(jié)果相近。研究表明多糖可以通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用[41]。此外，鐵皮石斛多糖、杏鮑菇等多糖的單糖組成均以葡萄糖、半乳糖、甘露糖為主[38,42]，與本研究中PHP的單糖組成較為一致，且此類多糖均表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)活性[42-43]，進(jìn)一步說(shuō)明PHP 具備潛在的免疫調(diào)節(jié)活性。

圖9 PHP 對(duì)Raw 264.7 巨噬細(xì)胞存活率的影響Fig.9 Effects of PHP on cell viability in Raw264.7 cells

2.4.2 PHP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)免疫損傷的Raw 264.7 巨噬細(xì)胞存活的影響 PHP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)的免疫損傷下細(xì)胞存活檢測(cè)結(jié)果如圖10所示。與空白組相比，在1 μg/mL 的LPS 的誘導(dǎo)損傷下，細(xì)胞相對(duì)存活率極顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)成功建立了免疫損傷模型。不同濃度的PHP 處理后，Raw 264.7 巨噬細(xì)胞存活率有一定提升效果；當(dāng)劑量為640 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞存活率極顯著提高了7.21%（P＜0.01）。這表明太子參多糖對(duì)Raw 264.7 巨噬細(xì)胞的免疫損傷具有一定緩解作用。

圖10 PHP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)損傷的Raw264.7細(xì)胞存活率的影響Fig.10 Effects of PHP on cell viability in Raw264.7 cells induced by LPS

Raw 264.7 巨噬細(xì)胞最好的狀態(tài)呈透亮的圓形，細(xì)胞吞噬抗原過(guò)多、培養(yǎng)環(huán)境惡劣都會(huì)促使該細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、長(zhǎng)梭形[44]。由圖11可知，空白對(duì)照組的Raw 264.7 巨噬細(xì)胞呈橢圓或圓形。模型組在LPS 刺激下，細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，呈菱形、梭形，細(xì)胞密度明顯少于空白對(duì)照組。陳光勇[45]、鄭勝眉[46]等顯微鏡下觀察Raw 264.7 巨噬細(xì)胞時(shí)，LPS 處理組同樣出現(xiàn)了數(shù)量降低、長(zhǎng)梭狀的細(xì)胞形變等。加入PHP 的處理組中，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改善，大多細(xì)胞呈標(biāo)準(zhǔn)圓形、類橢圓形、紡錘形等，這表明PHP 具有改善Raw 264.7 巨噬細(xì)胞形態(tài)的作用。

圖11 PHP 對(duì)LPS 誘導(dǎo)損傷的Raw 264.7 巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.11 Effects of PHP on cell morphology in Raw264.7 cells induced by LPS

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)水提醇沉法從太子參中提取了太子參粗多糖，得率為8.23%，純度為51.47%。并采用DEAE Cellulose-52 離子交換柱法純化得太子參多糖（PHP），其純度為80.52%。PHP 是一種α-吡喃糖，分子量在500～92×103Da，主要由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖及葡萄糖醛酸組成。以LPS誘導(dǎo)的Raw 264.7 小鼠巨噬細(xì)胞為模型，PHP 可以提高免疫損傷后的細(xì)胞存活率，改善細(xì)胞形態(tài)，說(shuō)明了PHP 對(duì)由LPS 誘導(dǎo)損傷的Raw 264.7 巨噬細(xì)胞有保護(hù)作用，初步表明具備體外調(diào)節(jié)免疫的潛力。