典型環(huán)境高鎘地區(qū)常見蔬菜中鎘的生物可及性及健康風險評估

徐飛飛，李躍麒，林 珺，賴月妃，黎姿茵，林秀琴，陳穎思，吳煒亮, ，楊杏芬,

（1.南方醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，食物安全與健康研究中心，廣東省熱帶病研究重點實驗室，粵港澳污染物暴露與健康聯(lián)合實驗室，廣東廣州 510515；2.暨南大學基礎醫(yī)學和公共衛(wèi)生學院，廣東廣州 510632）

2015 年全國土壤調查結果顯示，我國19.4%的農(nóng)業(yè)土壤受到重金屬污染，其中鎘是主要的重金屬污染物之一[1]。種植于受污染土壤中的農(nóng)作物易富集重金屬，如水稻、蔬菜在種植過程中易富集Cd[2]。對于非吸煙人群，膳食是攝入Cd 的主要途徑，而大米和蔬菜是中國南方地區(qū)人群暴露Cd 的主要膳食來源[3-4]。由于Cd 的半衰期長達10～30 年，攝入Cd 易在體內蓄積而造成嚴重的健康損害，如骨骼、腎、神經(jīng)等損傷[3,5-8]。因此，常使用風險熵評估模型對膳食Cd暴露的非致癌風險進行評估，在評估過程中一般使用食物中Cd 的濃度水平與膳食消費量計算其膳食暴露量[9]。然而，由于實際產(chǎn)生毒性作用的是通過膳食攝入后經(jīng)消化吸收到達組織的鎘濃度水平，因此目前的風險評估結果可能高估Cd 引起的健康風險。

近年來，國內外提出了多種生物可及性體外測試模型用于研究污染物在胃腸道消化過程中從食品基質釋放到胃腸液中的水平[10]，如生理原理提取法（the Physiologically Based Extraction Test，PBET）[11]、荷蘭公共衛(wèi)生與環(huán)境國家研究院法（National Institute of Public Health and the Environment，RIVM）[12-16]、德國標準研究院法（DIN）[17]等，其均發(fā)現(xiàn)在消化過程中基質中的污染物并非全部被釋放，而使用這些體外方法可獲得污染物被機體吸收的最高濃度水平，有助于提高風險評估的精確度。目前，Cd 膳食暴露風險評估的研究主要集中于不同膳食因素[18]、烹調方式[18-20]對膳食攝入Cd 的影響，尚未系統(tǒng)研究食物中Cd 的生物可及性及其對風險評估的作用。課題組前期研究顯示，某高鎘地區(qū)蔬菜中Cd 的平均濃度水平為0.14 mg/kg，且有23.75%的樣本超過食品安全國家標準GB 2762 的限量值[4]。因此，本研究以該典型環(huán)境高鎘地區(qū)居民日常消費的9 種蔬菜為研究對象，探索烹調方式、金屬元素含量對蔬菜中Cd 生物可及性的影響，并在風險評估過程中引入生物可及性，旨在更全面地評價通過蔬菜消費而導致的Cd 暴露對人體產(chǎn)生的健康風險提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔬菜樣品于2020 年1 月，在華南某高鎘區(qū)域隨機采集，共4 類9 種42 份蔬菜樣品。由于歷史原因，該區(qū)域土壤中Cd 濃度大于1.25 mg/kg，高于GB 15618-1995《土壤環(huán)境質量標準》規(guī)定的保證農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和植物正常生長的土壤臨界值。采集的樣品分別為葉菜類蔬菜（芥菜、白菜、麥菜、生菜和菜心）、甘藍類蔬菜（西蘭花）、鱗莖類蔬菜（韭菜）、根莖類蔬菜（大薯和蘿卜）。蔬菜樣品均為當?shù)鼐用袼N植。樣品低溫冷藏運輸至實驗室后，去除不可食部后，使用超純水將可食部洗凈，于室溫瀝干多余水分。之后，每份蔬菜樣品稱取1 kg，裝入密封袋中供后續(xù)實驗及檢測使用。

豬胃蛋白酶、胰酶、脂肪酶、α-淀粉酶、牛血清白蛋白和粘蛋白 生化試劑，Sigma 公司；NaCl、KCl、KSCN、NaH2PO4、NaHCO3、CaCl2、MgCl2、KH2PO4、Na2SO4、尿酸和尿素（分析純）、D-（+）-葡萄糖、D-（+）-葡萄糖胺（生化試劑） 麥克林生化科技有限公司；D-葡萄糖醛酸、牛膽汁粉 索萊寶（中國北京）公司；Cd（1000 mg/L）、115In（1000 mg/L）標準溶液以及標準物質圓白菜（GBW10014）和菠菜（GBW10015） 國家標準（北京）檢測認證有限公司；烹調時所用的魯花牌花生油 購置于當?shù)爻校珻d 的檢測結果為“未檢出”。

350X 電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS） 美國珀金埃爾默公司；SHJ-6AB 雙數(shù)顯水浴磁力攪拌器 中國常州高德儀器制造有限公司；Milli-Q 超純水機 美國Millipore 公司；MARS7 微波消解儀 培安·CEM 微波化學（中國）技術中心；Newclassic-MS205DU 分析天平（萬分之一） 美國METTLER TOLEDO 公司；SevenCompactS210-S 電子pH 計美國METTLER TOLEDO 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 烹調方法 根據(jù)當?shù)鼐用竦呐腼兞晳T，采用不同烹調方式對所采集樣品進行處理。每份樣品取500 g，將其切成小塊后分為3 份，每份150 g，其中1 份不經(jīng)烹調處理，其余2 份分別進行水煮和生炒。其中，水煮樣品置于500 mL 煮沸的超純水中，于100 ℃水煮5 min，撈出，將水棄去；生炒樣品則待花生油（15 mL）溫度達180～190 ℃后，加入至不銹鋼平底鍋中翻炒1～2 min，取出。所有樣品經(jīng)烹調后使用勻漿機進行勻漿備用。

1.2.2 生物可及性測定方法 采用RIVM 體外消化模型模擬蔬菜的胃腸消化過程，對蔬菜中Cd 的生物可及性進行測定，分別為口腔、胃和小腸三個階段。模擬消化液配制參照Rotard 等[12]和Oomen 等[21]研發(fā)者所使用的成分及配比。具體流程如下：

口腔階段：將5.0 g 樣品置于50 mL 具塞三角瓶中，加入6 mL 模擬唾液，使用1 mol/L HCl 溶液將pH 調節(jié)至6.5±0.2。三角瓶置于37 ℃恒溫水浴磁力攪拌器中以100 r/min 攪拌2 min。

胃消化階段：口腔階段結束后，加入13 mL 模擬胃液于具塞三角瓶，使用1 mol/L HCl 溶液將pH 調節(jié)至1.5±0.1。三角瓶置于37 ℃恒溫水浴磁力攪拌鍋中以100 r/min 攪拌2 h。

小腸消化階段：胃消化階段后，加入12 mL 小腸液和6 mL 膽汁于具塞三角瓶，使用1 mol/L NaOH 溶液調節(jié)pH 至7.8±0.2。三角瓶置于37 ℃水浴中以100 r/min 攪拌2 h。

消化完成后，三角瓶置于沸水中30 s，將酶滅活。使用自來水冷卻至室溫后，消化液及消化殘渣轉移至50 mL 離心管中，5000 r/min 離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后，于-80 ℃中儲存待測。

1.2.3 金屬元素的測定

1.2.3.1 前處理方法 蔬菜樣品的前處理參照GB 5009.268-2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》。首先，稱取0.2～0.5 g 樣品（精確到0.001 g）于聚四氟乙烯消解罐中，加入10 mL 硝酸并放置1 h，后旋緊不銹鋼外套，置于微波消解儀中消解。完成后，將消解內罐取出，旋開蓋子，于100 ℃趕酸30 min。最后，將消解液轉移至25 mL 容量瓶中，使用超純水進行定容。

使用0.22 μm 濾膜過濾經(jīng)消化后所得的消化液，取1 mL 并直接加入100 μL 硝酸后，使用超純水定容至2 mL。

1.2.3.2 分析方法 蔬菜樣品中元素的測定參照GB 5009.268-2016《食品安全國家標準 食品中多元素的測定》，使用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分別對蔬菜樣品中的Mg、K、Ca、Cu、Zn、Cd 濃度水平以及消化液中Cd 的濃度水平進行測定。蔬菜樣品Cd 的濃度水平以鮮重計。

1.2.3.3 質量控制 采用一系列質量控制程序保證Cd 測定的準確性和精密度：a.進行化學試劑空白測定，以校準ICP-MS 讀數(shù)的準確度；b.通過加標回收實驗獲得蔬菜樣品和消化液中Cd 的回收率，分別為94.3%～108.4%和92.3%～99.8%；c.測定了標準物質圓白菜（GBW 10014）和菠菜（GBW10015）的Cd，結果如表1所示；d.在20次測定后使用空白和漂移標準樣品維持儀器準確度；e.重復測定計算變異系數(shù)，以驗證分析精度并確保樣品在前處理期間無污染。

1.2.4 生物可及性的計算 蔬菜中Cd 的生物可及性是指樣品在消化過程中釋放至模擬消化液的濃度水平與樣品中Cd 的濃度水平的比值，計算公式如下：

式中：BAS 為Cd 的生物可及性；CIV為消化液中Cd 的濃度水平，mg/L；VIV為消化液體積，L；Cv為蔬菜樣品中Cd 的濃度水平，mg/kg；M 為蔬菜樣品的質量，kg。

1.2.5 健康風險評估 采用每日估計攝入量（Esti mated daily intake，EDI）及目標風險熵（Target Hazard Quotient，THQ）評估環(huán)境高鎘地區(qū)居民通過消費蔬菜攝入Cd 的健康風險。若THQ＜ 1，表明無顯著健康風險。反之，則存在健康風險。EDI 和THQ 的計算公式如下：式中：Cv為蔬菜樣品中Cd 的濃度水平，mg/kg；Wv為每日蔬菜消費量，kg/d；BEDI 是指經(jīng)生物可及性校正后的每日估計攝入量；BAS 為Cd 的生物可及性；BW 為平均體重，kg。本研究采用的平均體重以及蔬菜消費量為課題組前期于環(huán)境高鎘地區(qū)開展膳食調查得到的數(shù)據(jù)。其中，成人的平均體重為54.80 kg，成人每日蔬菜平均消費量為374 g/d，P95值為997 g/d（P95 值代表高消費人群的攝入量）。

式中：Efr是暴露頻率（365 d）；ED 為暴露持續(xù)時間（70 年）；RfD 為每日口服參考劑量（mg/kg）；AT 是非致癌物質的平均時間（365 d/年×ED）；10-3是單位換算系數(shù)；BTHQ 是指經(jīng)過生物可及性校正后的目標風險熵。根據(jù)美國環(huán)境保護局的數(shù)據(jù)，Cd 的每日經(jīng)口暴露參考劑量為0.001 mg/kg[22]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次。相關數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 進行數(shù)據(jù)處理。所有數(shù)據(jù)采用平均值或者平均值±標準偏差的形式表示。組間比較采用方差分析，相關性采用Pearson 和Spearman 相關分析。當P＜0.05 時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 蔬菜中的礦物元素及Cd 濃度水平

樣品中Mg、K、Ca、Cu、Zn 及Cd 的濃度水平如表2所示。蔬菜樣品中主要元素的平均濃度水平為K（1.32～4.54 g/kg）＞Ca（0.04～0.76 g/kg）＞Mg（0.06～0.26 g/kg）＞Zn（1.27～6.93 mg/kg）＞Cu（0.10～1.64 mg/kg）。蔬菜樣品中重金屬Cd 的平均濃度范圍為0.02～0.30 mg/kg，葉菜類和根莖類蔬菜的Cd濃度水平較高，其中麥菜的Cd 平均濃度最高，達0.30 mg/kg，高于標準限量值0.20 mg/kg，其次為生菜（平均濃度為0.15 mg/kg）和菜心（平均濃度為0.09 mg/kg）。不同種類蔬菜中重金屬Cd 的濃度水平差異較大。其中，葉菜類蔬菜的麥菜、生菜和菜心的Cd 含量較高，提示葉菜類蔬菜較其他種類蔬菜更易富集重金屬Cd，與Chen 等和侯勝男等的研究結果相似[23-24]。此外，Zhuang 等[25-26]的研究結果提示，除葉菜類蔬菜外，根莖類蔬菜亦較易累積Cd。值得注意的是，本次研究采集的根莖類蔬菜大薯中的Cd 濃度水平也較高，可能是由于根莖類蔬菜的可食用部分生長于土壤中，相比于其他類蔬菜更容易富集Cd[27]。

表2 環(huán)境高鎘地區(qū)常見蔬菜中主要元素和Cd 的濃度水平（x±s）Table 2 Average concentrations of major elements and cadmium in commonly consumed vegetables collected from a high-level environmental Cd region (x±s)

2.2 烹調方法對蔬菜中Cd 濃度水平的影響

對每種蔬菜分別采用水煮和生炒2 種烹調方式進行處理，烹調方法對Cd 濃度水平的影響如圖1所示。結果表明，水煮蔬菜的Cd 濃度范圍為0.02～0.12 mg/kg，而未經(jīng)烹調和生炒蔬菜樣品的Cd 濃度范圍分別為0.03～0.24 和0.03～0.21 mg/kg。與未經(jīng)烹調的相應蔬菜樣品比較，烹調方式水煮顯著降低各類蔬菜Cd 的平均濃度水平（P＜0.05）。其中，芥菜經(jīng)水煮后的平均下降比例最高，約為45.73%，其次為蘿卜和大薯，平均下降比例分別為36.83%和35.02%。然而，烹調方式生炒對蔬菜Cd 濃度水平的影響則未見顯著性差異（P＞0.05）。水煮可顯著降低蔬菜中Cd 的濃度水平的原因可能是水煮過程中Cd 從蔬菜析出至水中，從而降低了蔬菜中的Cd 含量，結果與Mnisi 等[19]和Zhuang 等[26]的研究結果一致。由于生炒過程中水分損失較少，而且植物組織軟化程度也較水煮低，因此與烹調前的蔬菜相比Cd 濃度無顯著變化。

圖1 不同烹調方式對蔬菜中Cd 濃度水平的影響Fig.1 Effects of different cooking methods on the cadmium concentrations in vegetable samples

2.3 蔬菜中Cd 的生物可及性

如表3所示，未經(jīng)烹調的蔬菜樣品中Cd 的生物可及性范圍為4.44%～40.86%，其中西蘭花的Cd 生物可及性最高，達40.86%，其次為芥菜（32.64%），菜心和大薯的Cd 生物可及性最低，分別為12.92%和4.44%。經(jīng)水煮后，蔬菜中Cd 的生物可及性顯著增加（P＜0.05），其生物可及性變化范圍為5.36%～55.33%。其中，菜心樣品經(jīng)水煮后，Cd 的生物可及性增加0.88 倍。對于烹調方式生炒而言，烹調前后Cd 的生物可及性變化無顯著性差異（P＞0.05）。對于蔬菜中Cd 生物可及性而言，水煮可使蔬菜中Cd 的生物可及性明顯增加，與Pelfrêne 等的研究結果相近，這可能歸因于水煮過程中植物組織由于細胞壁膨脹、果膠溶解/解聚和細胞分離而軟化，因此植物組織可在消化過程中受到一定破壞而將Cd 更完全地釋放[28]。然而，F(xiàn)u 等的研究結果顯示水煮的烹調方式可顯著降低蔬菜中Cd 的生物可及性，這可能是因為相關研究所采用的烹調時間較長，或在水煮過程中加入鹽，從而可能會導致更多的Cd 釋放至水中，導致水煮過程中蔬菜初始濃度下降比例較高，從而掩蓋了體外消化過程的影響[18-19,26]。

表3 烹調前后蔬菜中Cd 的生物可及性（x±s）Table 3 Cd bioaccessibility of vegetables before and after different cooking methods (x±s)

Zhuang 等[26]對生菜、馬鈴薯等6 種蔬菜中Cd的生物可及性進行了研究，其范圍在35%～66%之間，而Pelfrêne 等[28]通過體外消化模型UBM 而得到的韭菜、法國豆、胡蘿卜等7 種蔬菜中Cd 的生物可及性范圍為63%～72%。與上述兩項研究結果相比，本研究通過RIVM 體外消化模型得到的蔬菜中Cd 的生物可及性略低，可能是由于所使用的體外消化方法不同以及蔬菜樣本中Cd 濃度水平的差別所造成的。Aziz 等通過體外消化模型得到的蔬菜中Cd 的生物可及性為7.21%～63.62%，與本次研究的Cd 生物可及性范圍較為接近[29]。此外，本研究表明不同種類蔬菜中Cd 的生物可及性存在一定的差異，甘藍類＞塊根類＞葉菜類＞塊莖類，與Hu 等[20]的研究結果一致。

2.4 蔬菜中主要礦物元素對Cd 生物可及性的影響

相關性分析結果顯示，環(huán)境高鎘地區(qū)蔬菜樣品中礦物元素濃度水平與烹調前后Cd 的濃度水平、Cd 生物可及性的相關關系如表4所示。蔬菜樣品中礦物元素與Cd 的濃度水平之間相關關系不具有統(tǒng)計學意義。蔬菜樣品中礦物元素、Cd 濃度水平與Cd 的生物可及性的關系為：K 的含量和未經(jīng)烹調蔬菜Cd 的生物可及性存在極顯著負相關關系（P＜0.01），而Cu 的含量和烹調前蔬菜Cd 的生物可及性、水煮后蔬菜Cd 的生物可及性存在顯著負相關關系（P＜0.05）。烹調前Cd 的濃度水平與烹調前Cd 的生物可及性、水煮后Cd 的生物可及性存在顯著負相關關系（P＜0.05；P＜0.01）；烹調前Cd 的生物可及性、水煮后Cd 的生物可及性以及生炒后Cd 的生物可及性兩兩之間存在極顯著正相關關系（P＜0.01）。

表4 蔬菜中主要礦物元素與Cd 及其生物可及性之間的相關性Table 4 Correlations of the major mineral elements with Cd and Cd bioaccessibility in vegetable samples

本研究未發(fā)現(xiàn)蔬菜樣品中Cd 的濃度水平與礦物元素之間存在顯著的相關關系。然而，Cd 的生物可及性與樣品中的Cu、K 之間存在顯著的負相關關系，可能是由于這些金屬離子表現(xiàn)出與Cd 相似的物理化學性質，通過影響pH 或是競爭性與蛋白結合而影響蔬菜中Cd 的溶解度[30]。相關的研究結果表明，添加CaCl2可顯著降低大米和蔬菜中Cd 的生物可及性，而添加葡萄糖酸鋅顯著降低蔬菜中Cd 的生物可及性[18,30]，這與本文所觀察到的結果較為一致。烹調前蔬菜的Cd 濃度水平與烹調前蔬菜的Cd 生物可及性和水煮后蔬菜Cd 的生物可及性存在顯著的負相關關系，表明隨著蔬菜樣品中的Cd 濃度水平增加，食品基質中釋放出鎘的能力降低，從而導致釋放出的Cd 濃度與初始Cd 濃度的比值下降，即其生物可及性降低。然而，相關研究結果表明Cd 濃度水平與Cd 的生物可及性之間存在顯著正相關關系（P＜0.05）[28,31]，可能是因為本研究中的蔬菜樣品Cd 濃度水平較低（85%的樣本＜0.1mg/kg），僅代表該濃度下的相關關系，具有一定的局限性。

2.5 健康風險評估

根據(jù)前期橫斷面調查所得的膳食消費量和體重數(shù)據(jù)，對環(huán)境高鎘地區(qū)居民消費蔬菜攝入Cd 的EDI 和THQ 進行評估，如表5所示。結果表明，在使用常規(guī)的風險評估模型時，一般消費人群通過消費蔬菜而每日攝入Cd 的平均水平為0.55 μg/kg·bw，而蔬菜高消費人群每日攝入Cd 的平均水平為1.47 μg/kg·bw。2010 年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會（JECFA）制定了Cd 的膳食暴露健康指導值，即Cd 的每月容許攝入量（PTMI）為25 mg/kg·bw[32]。通過換算，蔬菜高消費人群的Cd 每日攝入量已高于JECFA 建立的健康指導值。相比較而言，在風險評估過程中引入Cd 的生物可及性，則發(fā)現(xiàn)一般消費人群通過蔬菜而每日攝入Cd 的平均水平為0.12 μg/kg·bw，高消費人群每日攝入Cd 的平均水平為0.31 μg/kg·bw，均低于JECFA設定的健康指導值，提示其引起人體健康風險的可能性較低。同樣地，如表5所示，根據(jù)每日消費蔬菜攝入Cd 的平均水平得到一般消費人群的平均THQ 為0.55，高消費人群的平均THQ 為1.47。在考慮Cd的生物可及性時，一般消費人群的平均THQ 為0.12，高消費人群的平均THQ 為0.31。引入生物可及性后，高消費人群的平均THQ 小于1，提示蔬菜中Cd 經(jīng)消化吸收后其對人體的危害降低，總體而言，當前的結果提示食用蔬菜攝入Cd 引起的健康風險較低。

表5 環(huán)境高鎘地區(qū)居民通過消費蔬菜每日攝入Cd 的水平（μg/kg·bw）及其風險熵Table 5 EDI (μg/kg·bw) and THQ of Cd for local residents in high-level environmental Cd region via vegetable consumption

通過前期調查所獲得蔬菜消費量以及當?shù)厝巳旱捏w重，計算出的當?shù)赝ㄟ^食用蔬菜獲得的EDI 為生菜＞菜心＞大薯＞韭菜＞大白菜＞麥菜＞芥菜＞西蘭花＞蘿卜。對于居住于該環(huán)境高鎘地區(qū)的一般人群而言，除生菜外，通過其他蔬菜攝入Cd 的水平均低于健康指導值。相反，對于高消費人群，除了蘿卜、西蘭花和芥菜外，通過其他蔬菜消費而暴露Cd 的水平均高于PTMI。烹調方式對蔬菜的EDI 無明顯影響，但將Cd 的生物可及性引入膳食暴露評價模型，可使因消費蔬菜而攝入Cd 的暴露量明顯降低，除該地區(qū)的高消費人群通過消費生菜攝入Cd 的暴露水平高于健康指導值外，消費其他蔬菜的BEDI 均低于PTMI。同樣地，除蘿卜、西蘭花、芥菜和麥菜外，高消費人群的THQ 均大于1。然而，考慮Cd 的生物可及性后，高消費人群消費除生菜外的其他蔬菜攝入的Cd 所造成的健康風險較低，因BTHQ 均小于1。但值得注意的是，通過蔬菜攝入的Cd 僅是膳食Cd 暴露的一部分，前期有研究提示通過大米暴露Cd 可能會造成一定的潛在健康風險[4,16,33]，因此環(huán)境高鎘地區(qū)居民因膳食暴露Cd 而帶來的健康風險仍較高，需引起高度關注。

3 結論

本研究以典型環(huán)境高鎘地區(qū)為研究區(qū)域，對當?shù)胤N植的9 種常見蔬菜中五種金屬元素（Mg、K、Ca、Cu、Zn）及Cd 進行檢測，采用體外RIVM 胃腸消化模型測定蔬菜中Cd 的生物可及性，評估通過消費蔬菜攝入Cd 對人體造成的健康風險。結果表明，水煮可以降低蔬菜中的Cd 濃度水平，并對Cd 的生物可及性有明顯影響。利用相關分析發(fā)現(xiàn)，蔬菜中的K 和Cu 顯著影響蔬菜中Cd 的生物可及性。若不考慮生物可及性，攝入所采集的蔬菜樣本對當?shù)匾话闳巳涸斐傻慕】碉L險較低，但可能導致高消費人群的健康風險。若將生物可及性的數(shù)據(jù)納入計算，除生菜外其余蔬菜的高消費人群的BTHQ 均低于1，提示食用蔬菜引起健康風險的可能性較低。然而，仍應關注環(huán)境高鎘地區(qū)人群其他膳食來源的Cd 暴露水平以及總體情況是否可造成慢性長期暴露而引起的健康風險。